Summary
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van insuline 3D lymfkliertest pancreatoids uit de alvleesklier progenitoren vrij zwevende e10.5 losgekoppeld en de bijbehorende mesenchym uitdrukken.
Abstract
De alvleesklier is dat een complex orgaan samengesteld uit vele verschillende soorten cellen die samenwerken om bloed glucose homeostase en spijsvertering te regelen. Deze celtypen behoren enzym-afscheidende acinaire cellen, een arborized ductaal systeem verantwoordelijk voor het vervoer van enzymen aan de gut en hormoon-producerende endocriene cellen.
Endocriene beta-cellen zijn de enige celtype in het lichaam die insuline tot lagere niveaus van de glucose van het bloed. Diabetes, een ziekte die wordt gekenmerkt door het verlies of de disfunctie van de beta-cellen, is het bereiken van epidemische proporties. Het is dus essentieel om protocollen voor het onderzoek naar bèta-cel ontwikkeling die kan worden gebruikt voor screeningonderzoek voor het afleiden van de drug en cel-gebaseerde therapeutics. Terwijl het experimentele onderzoek van muis ontwikkeling essentieel is, zijn in vivo studies moeizaam en tijdrovend. Gekweekte cellen bieden een handiger platform voor screening; Nochtans, zijn zij niet in staat om de cellulaire diversiteit, architecturale organisatie en cellulaire interacties gevonden in vivo. Het is dus essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe instrumenten voor het onderzoek naar alvleesklier organogenese en fysiologie.
Alvleesklier epitheliale cellen ontwikkelen in de nauwe samenwerking met mesenchym vanaf de aanvang van de organogenese als cellen organiseren en in de complexe, fysiologisch bevoegde volwassen orgel differentiëren. De alvleesklier mesenchym biedt belangrijke signalen voor de endocriene ontwikkeling, waarvan vele niet goed nog, dus moeilijk begrepen zijn te recapituleren tijdens de in vitro cultuur. Hier beschrijven we een protocol bij cultuur three-dimensional, cellulaire complexe muis organoids die mesenchym behouden, pancreatoids genoemd. De e10.5 lymfkliertest alvleesklier kiem is ontleed, losgekoppeld en gekweekt in een scaffold-vrije omgeving. Deze zwevende cellen monteren zelf met mesenchym onder omslag steken de ontwikkelende pancreatoid en een robuust aantal endocriene beta-cellen ontwikkelen en de acinaire cellen van de buis. Dit systeem kan worden gebruikt om te studeren van de cel lot vastberadenheid, structurele organisatie, en voedselproductie, cel-cel interactie tijdens organogenese, of voor de drug, klein molecuul of genetische screening.
Introduction
De mechanismen van de normale ontwikkeling en de Fysiologie uitgezet is primordiaal te begrijpen van de etiologie van de ziekte en behandelingsmethoden uiteindelijk te cultiveren. Kweken en differentiatie van stamcellen maakt het snel en high-throughput analyse van de ontwikkeling, het wordt beperkt door de bestaande hoeveelheid kennis met betrekking tot de mechanismen tot regeling van de cel lot en kunstmatig recapituleert ontwikkeling in een relatief homogene, tweedimensionale staat1,2. Niet alleen biedt in vivo ontwikkeling beïnvloed door Extrinsieke invloeden, met verschillende soorten cellen in de niche en milieu paracrine signalen en organisatorische steun te loodsen organogenese, maar de functie van deze cellen beroept zich ook op hun omgeving voor begeleiding3,4,5. Gezien het belang van deze externe signalen, de beperkingen van differentiatie protocollen en het moeizame karakter van in vivo muismodellen, zijn nieuwe systemen nodig om de fundamentele ontwikkelings processen en fysiologie experimenteel te onderzoeken.
De opkomst van protocollen voor het genereren van driedimensionale, complexe organoids biedt een handige en congruent systeem om te studeren organogenese, fysiologie, drug werkzaamheid en zelfs pathogenese. Tot vaststelling van lymfkliertest organoids voor verschillende systemen zoals de maag6 en darm7 hebben ons begrip van de organogenese uitgebreid, die een tool om te bestuderen van ontwikkelingsstoornissen complexiteit met minder beperkingen dan in vivo bieden: en in vitro modellen. Vanwege deze vooruitgang in de lymfkliertest organoid formatie en de komst van menselijke pluripotente cellen, menselijke intestinale8, retinale9, renale10,11, en cerebrale12 organoids zijn vervaardigd, en dit repertoire wordt alleen beperkt door de bestaande kennis over de mechanismen van ontwikkeling.
Van bijzonder belang is de generatie van de alvleesklier organoids, zoals een groot aantal ziekten verschillende alvleesklier celtypes teistert, met inbegrip van acinaire cellen en leidingen in exocrine alvleesklier insufficiëntie13, acinaire cellen van pancreatitis14, en beta cellen in diabetes15. Verwerven van kennis met betrekking tot de ontwikkeling van deze verschillende soorten cellen zou helpen bij het begrijpen van hun pathologie en kan ook fungeren als een platform voor gepersonaliseerde drug screening of transplantatie. Eerder, Greggio et al. een methode ontwikkeld om lymfkliertest alvleesklier organoids die in vivo morfogenese recapituleren en ontwikkelen van georganiseerde, driedimensionale, complexe structuren, samengesteld uit alle belangrijke alvleesklier epitheliale cel maken 16,17soorten. Dit is een belangrijke stap voorwaarts in de alvleesklier veld, met name als maken cellen in vitro biologische onderzoek van bèta-cel ontwikkeling kunt inschakelen. Echter een schaarste van de endocriene cellen gevormd in dit protocol, tenzij de organoids waren in weefsel, waar de niche zou kunnen communiceren en bieden instructievideo signalen17getransplanteerd. Het mesenchym vormt het grootste gedeelte van de niche, zwaar onder omslag steken de ontwikkelende epitheel van de vroege stadia van de organogenese aan latere stadia, met inbegrip van endocriene delaminatie en differentiatie3,4, 18. De interactie van het mesenchym met de ontwikkelingslanden alvleesklier is nog een ander voorbeeld van Extrinsieke signalering en het belang van het behoud van in vivo cellulaire complexiteit te bestuderen van de organogenese.
Hier beschrijven we hoe te genereren van driedimensionale alvleesklier organoids, pancreatoids, van gedissocieerde e10.5 lymfkliertest alvleesklier progenitoren genoemd. Deze pancreatoids behouden van inheemse mesenchym, zelf monteren in zwevende voorwaarden en alle grote alvleesklier celtypes, met inbegrip van een robuust aantal endocriene beta cellen19genereren. Deze aanpak is geschikt voor de analyse van de ontwikkeling van het endocriene, zoals eerdere protocollen robuuste endocriene differentiatie ontbreken. Echter, met behulp van het protocol voor alvleesklier organoids zoals beschreven door Greggio et al. beter voor de analyse van de alvleesklier epitheliale vertakking en voedselproductie geschikt is, als vertakking beperkter is in pancreatoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven in deze methode beschreven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Baylor College of Medicine.
1. bereiding van muis embryonale dag 10.5 alvleesklier voorlopercellen
Opmerking: Dit protocol hoeft niet te worden gevolgd onder steriele omstandigheden tot stap 2, maar het is optimaal steriliseren dissectie tools te spuiten met 70% ethanol vóór gebruik.
- Als u wilt instellen voor dissectie, vul een ijsemmer en plaats een container fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in het ijs. Reinig twee boete-tipped pincet en dissectie schaar met 70% ethanol. Ingesteld in de buurt van de dissectie-gebied, een container met ten minste drie borosilicaat capillaire buizen, mond Pipetteer een lichtere, en 1.000 µL Pipetteer tips gefilterd.
- Bereiden van ten minste 1 mL koude dispase 1,25 mg/mL verdund in gesteriliseerd water en plaats in de tweede put uit een 12 goed bord op het ijs. PBS zetten in de eerste, derde en vierde putjes van de 12 goed plaat. Plaats 1 mL van 0,05% trypsine in een 1,5 mL tube op ijs. Vooraf warm een schudden incubator naar 37 oC.
- Euthanaseren e10.5 getimede-zwangere muizen overeenkomstig de richtsnoeren van de IACUC. Spray de buik met 70% ethanol te reinigen van de regio alvorens een V-vormige insnijding in de schaamstreek van de muis met schaar en pincet en het blijven tot het middenrif.
Opmerking: Verschijning van een vaginale plug in dit protocol geeft dag 0,5. 5 - 6-week-oude muizen, met fungeert een gewichtstoename van meer dan 2 g als een secundaire maatregel van succesvolle bevruchting.- Accijnzen zorgvuldig de baarmoeder doordat een insnijding om de bovenste laterale gedeelten van de baarmoeder, het orgel omhoog uit de buurt van de muis, en na deze incisie tot de genitale regio trekken voordat herhalen aan de andere kant. Plaats het in een 10 cm petrischaal met de koude PBS.
Opmerking: Het is mogelijk te krijgen van organoids van e11.5 los gezien de cellen, maar in tegenstelling tot de e10.5 pancreatoids, deze organoids nog niet zijn gekenmerkt en dus niet de capaciteit om te differentiëren in alle drie belangrijke alvleesklier lineages kan behouden.
- Accijnzen zorgvuldig de baarmoeder doordat een insnijding om de bovenste laterale gedeelten van de baarmoeder, het orgel omhoog uit de buurt van de muis, en na deze incisie tot de genitale regio trekken voordat herhalen aan de andere kant. Plaats het in een 10 cm petrischaal met de koude PBS.
- Onder een licht dissectie Microscoop, plaats de petrischaal en zorgvuldig de baarmoeder weefsel te openen door het plaatsen van twee pincet tussen elk embryo en peeling weefsel uit de buurt van de dooierzak. Transfer van embryo's door grijpen de dooierzak voorzichtig met een pincet en breng dit in een 10 cm petrischaal met verse, koude PBS. Plaats de petrischaal op ijs.
Opmerking: Het is belangrijk om te heedfully het verwijderen van embryo's, bij voorkeur binnen de dooierzak, gehouden als krachtig verwijdering kan trek de navelstreng, rippen van weefsel van het embryo en de structurele integriteit. - Plaats meerdere PBS druppels op een 10 cm petrischaal deksel. Gebruiken deze druppels voor het overbrengen van het embryo tijdens dissectie extraembryonic weefsels worden geschrapt om te zorgen voor zichtbaarheid. Een embryo overbrengen in een daling van de PBS en zachtjes verwijderen uit de dooierzak met pincet, terwijl de resterende embryo's in PBS op ijs(Figuur 1 blijven). Verwijder het hoofd voordat het embryo verhuizen naar een nieuwe PBS drop pincet met licht schep het embryo, niet het weefsel (Figuur 1B) schade.
Opmerking: Het weefsel moet mogelijk vaker worden overgedragen aan de verse PBS druppels dan hier beschreven, afhankelijk van de dekking van de vloeistof.- In een nieuwe PBS drop, verwijderen de toppen van de voorpoot met pincet (Figuur 1B). Plaats pincet in de opening waar ledemaat bud was aanwezig en zachtjes scheuren alleen de meeste externe weefsel anteriorly (Figuur 1B). Draaien van embryo en herhaal Richtung posterior, stoppen bij de stuk knop. Op dit punt, moet het maag-darmkanaal zichtbaar (Figuur 1B).
- De achterste regio van het maag-darmstelsel heeft een lichte bocht (figuur 1F). Invoegen pincet achter deze bocht in de opening tussen het maag-darmkanaal en de spinale regio van de muur van het lichaam. Loskoppelen van het maag-darmkanaal, werken langzaam naar boven tot de meest anterior regio wordt bereikt waar de cardiale regio verbindt (Figuur 1-B-E).
Optioneel: Verwijder het primordiale hart en de lever knoppen uit de ventrale regionen van het maagdarmkanaal, waardoor alleen de continue gut buis. De eerste paar keer dit protocol wordt uitgevoerd het kan dan makkelijker te vertrekken van het hart en de lever als ventrale monumenten tot de morfologie van het maag-darmkanaal en de dorsale alvleesklier bud meer zijn familiar (Figuur 1C en D ). - Het maag-darmkanaal overbrengen in de verse PBS druppel.
- Pincet te nemen en zachtjes knijpen het weefsel onder de uitstekende kiem en de darm en iets til het buitenste weefsel uit (Figuur 1D-F).
Opmerking: De dorsale alvleesklier kiem ligt tussen de maag en darm (Figuur 1C-G). De alvleesklier kiem onder moet uitzien als een ronde, knobby structuur (Figuur 1G). - Pincet plaats op de plaats waar de kiem verbindt met de darm en een snuifje omhoog de kiem (Figuur 1G) los te maken. Één keer in een nieuwe PBS-zeepbel wassen vóór de overbrenging van de kiem in het eerste putje van de plaat 12 goed in koude PBS op ijs. Herhaal totdat alle knoppen worden verzameld uit embryo's en in het eerste putje van de 12 goed plaat geplaatst.
- Plaats de 12 schotel goed onder de loep lichte dissectie. Het aantal alvleesklier toppen met succes ontleed om te berekenen later de splitsingsverhouding.
- Plaats een gefilterde 1.000 µL pipette uiteinde in de mond pipet met een capillair verbonden. Vlam steriliseren van het capillair en maken een bocht in de buis voor het gebruiksgemak. Gebruik het capillair toppen overbrengen naar de tweede goed met koude dispase oplossing voor 2 min voordat de overdracht aan de derde putje met de schone PBS (Figuur 1G).
Opmerking: Tijdens het overzetten toppen van dispase naar PBS, raak het weefsel naar het uiteinde van het capillair. Als het weefsel vast te aan het uiteinde van de buis zitten komt, omhoog en omlaag Pipetteer of schudden in de schone PBS oplossing totdat losgemaakt. - Pipetteer toppen op en neer, en breng aan de vierde putje met schone PBS. Ten slotte, met behulp van de capillaire apparaat overdracht toppen aan de 1,5 mL-buis met 0,05% trypsine. Plaats de buis in de voorverwarmde 37 oC shaker en schud bij 1500 t/min voor 4 min.
- Vortex voor ongeveer 10 s plaats dan onmiddellijk de buis in een centrifuge en spin gedurende 5 minuten bij 200 g. verwijderen alle maar ongeveer 50 µL van oplossing voorzichtig over het gecentrifugeerde cellen (Figuur 1G) niet te verstoren.
- Plaats een gefilterde 1.000 µL pipette uiteinde in de mond pipet met een capillair verbonden. Vlam steriliseren van het capillair en maken een bocht in de buis voor het gebruiksgemak. Gebruik het capillair toppen overbrengen naar de tweede goed met koude dispase oplossing voor 2 min voordat de overdracht aan de derde putje met de schone PBS (Figuur 1G).
2. het kweken van gedissocieerde progenitoren om te vormen van de Pancreatoids
Opmerking: Het volgende moet worden uitgevoerd in een steriele atmosfeer in een standaard weefselkweek kap, met behulp van steriele standaardprocedures.
- Voor elke bud verzameld, toevoegen 400 µL organogenese media16,17 (tabel 1) aan de gecentrifugeerde cellen. Pulse vortex driemaal en plaat 100 µL per putje van een lage bijlage 96 goed plaat, splitsen toppen met een verhouding van 1:4 (Figuur 1G).
- Kijk onder de Microscoop te visualiseren losgekoppeld cellen vrij zwevend (Figuur 1H). Zet de schotel van cultuur in een incubator 37 oC met 5% CO2 op een rocker op middellange snelheid.
- De voortgang van pancreatoids dagelijks. Vervangen door 100 µL van verse media om de 3 dagen, zorgvuldig pipetting media onder microscopische controle in de kap te verwijderen terwijl het verlaten van pancreatoid in de put. Anderzijds kunnen vers 100 µL van media worden toegevoegd aan een nieuwe goed en pancreatoid overgedragen met behulp van de borosilicaat-capillair verbonden aan mond pipet en 1000 µL gefilterd pipette uiteinde.
3. verwerking van de Pancreatoids voor immunefluorescentie Imaging
- Voor het verwerken van pancreatoids voor immunefluorescentie beelden, eerst voorbereiden 4% paraformaldehyde/PBS, pH7.4 (PFA) oplossing. Plaats 50 µL van 4% PFA in wells van een 96 goed plaat.
- Pancreatoids borosilicaat capillaire buisjes en mond pipet gebruikt met het topje van de gefilterde Pipetteer 1.000 µL, overdracht van kweekmedium zo weinig media zoveel mogelijk rekening met de verse put met 4% PFA. De rocker aangezet bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Pancreatoids overbrengen van 4% PFA in een putje met 100 µL van verse PBS, rock bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten herhalen voor een totaal van drie verse PBS wast.
Opmerking: Het protocol kan worden gepauzeerd hier, met pancreatoids die zijn opgeslagen in 100 µL van PBS bij 4 oC gedurende maximaal één week.
- Voor wholemount imaging (aanbevolen als antilichamen geschikt, alternatieve aanpak in sectie 3.3 zijn. en microscopie in 3.4.), van PBS overboeken naar 50 µL 5% ezel serum in 1 x PBS met 0,1% nonionic wasmiddel (PBST) te blokkeren. Rock's nachts op 4 oC of als alternatief voor 4 uur bij kamertemperatuur.
- Pancreatoids overbrengen naar een nieuwe put met primaire antilichamen verdund in 50 µL van 5% ezel serum in 1 x PBST. Optimaal, rock gedurende 24 uur bij 4 oC (ten minste 12 h maar maximaal 36 uur).
Opmerking: Antilichamen opgesomd in de Tabel van materialen tegen Chga (1:100), DBA (1:400), Vim (1:400) en Pdx1 (1:100) zijn geschikt voor wholemount vlekken; andere antilichamen voorschrijven optimalisatie. - Pancreatoids overbrengen in een put met 100 µL van verse PBST te wassen en rock gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap voor een totaal van drie verse PBST wast.
- Pancreatoids overbrengen naar een nieuwe put met secundaire antilichamen verdund in 50 µL van 5% ezel serum in 1 x PBST. De plaat beschermen tegen licht en plaats in de 4 oC, schommelen voor optimaal 24 h (ten minste 12 h maar maximaal 36 uur).
Opmerking: Alle secundaire antilichamen vermeld in de Tabel van materialen en DAPI nucleaire counterstain zijn geschikt voor wholemount vlekken. - Pancreatoids overbrengen naar een nieuwe put met 100 µL van 1 x PBST en rock bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten herhalen voor een totaal van drie wast in 1 x PBST. In de derde en laatste wash, voeg 300 nM DAPI.
- Tot slot plaatst in 100 µL van schone PBS en winkel bij 4 oC beschermd tegen licht voor tot een week voordat het imaging door confocale microscopie, hoewel de beste resultaten komen uit imaging onmiddellijk na kleuring. Om te voorkomen dat verkeer van pancreatoids tijdens imaging maar voorkomen uitdroogt, plaatst u elke pancreatoid in een druppel 20 µL van PBS. Als pancreatoids niet nog blijven, PBS volume te verlagen.
- Pancreatoids overbrengen naar een nieuwe put met primaire antilichamen verdund in 50 µL van 5% ezel serum in 1 x PBST. Optimaal, rock gedurende 24 uur bij 4 oC (ten minste 12 h maar maximaal 36 uur).
- Voor bevroren secties, pancreatoids van PBS overboeken naar 30% sacharoseoplossing 's nachts op 4 oC.
- Insluiten media toevoegen in een luchtbel onder een Microscoop dissectie. Geniet met pincet onder microscopische controle, pancreatoids door zachtjes duwen door de insluiten media meermaals residuele sacharose verwijderen vóór de overbrenging naar een weefsel blok met bevroren insluiten media.
- Plaats het weefsel blok op droog ijs totdat bevroren en de sectie op de cryostaat op 8 µm.
Opmerking: Secties kunnen worden achtergelaten bij-80 oC of immunostained onmiddellijk. - Het toestaan van secties van-80 oC te ontdooien bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 5 minuten tot droog. Tekenen van een hydrofobe barrière met behulp van de pen van de hydrofobe pap rond het weefsel en het blok met behulp van 5% ezel serum verdund in 1 x PBST gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder media en vervang onmiddellijk door primaire antilichamen verdund in 5% ezel serum verdund in 1 x PBST overnachting in 4 oC.
- Verwijder de primaire oplossing en wassen van weefsels driemaal met 1 x PBST voor 10 minuten elk. Na dit, voeg secundair antilichaam oplossing verdund in 5% ezel serum verdund in 1 x PBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en dia's te beschermen tegen licht.
- Verwijderen van de secundaire oplossing en wassen van dia's drie keer in 1 x PBST voor 10 minuten elk. In de laatste wasbeurt, voeg 300 nM DAPI.
- Verwijder media en voeg montage media en een dekglaasje aan. Winkel glijdt weg van licht in 4 oC tot klaar om het imago.
4. isolatie van RNA van Pancreatoids voor transcriptie analyse
- Verzamelen pancreatoids met behulp van borosilicaat capillair verbonden aan een mond Pipetteer met een gefilterde 1.000 µL pipette uiteinde voor steriliteit en plaats in 500 µL van zure guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroformoplossing in een 1,5 mL-buis. Bewaren bij-80 oC of ga onmiddellijk naar RNA isolatie.
- Voor RNA isolatie, monsters op ijs ontdooien als nodig en voeg 100 µL van chloroform. Vortex goed en plaats in de 4 oC gedurende 15 minuten cool vooraf een centrifuge naar 4 oC.
- Plaats van buizen in centrifuge en spin voor 20 min bij 12.000 g bij 4 oC.
- Verwijder voorzichtig buizen om de scheiding van de lagen niet te storen. Met behulp van een 200 µL Pipet, verzamelen de heldere waterige oplossing en leg in een nieuwe 1,5 mL-buis, waardoor er achter een klein bedrag aan buffer van de witte eiwit laag en roze DNA. Raak niet aan het uiteinde van de pipet om het even wat in dit proces en raak niet de muren van de 1,5 mL-buis.
- Voeg 500 µL van 100% isopropanol en aan de nieuwe buis met de waterige laag en vortex. Laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, langer op het ijs, of voor maximale neerslag laat 's nachts op-20 oC.
- Centrifugeer bij 12.000 g gedurende 15 minuten op 4 oC aan het RNA pellet. Verwijder de isopropanol zonder de pellet te verstoren.
Opmerking: Omdat pancreatoids klein zijn, is het waarschijnlijk dat de pellet zal niet zichtbaar zijn. - Voeg koud, 75% ethanol en omkeren van de buis meerdere malen. Plaats in de centrifuge en draaien op 9.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 oC. verwijderen de ethanol en spin voor 2 min op 9.000 x g.
- Gebruik een pipet 200 µL te verwijderen van alle resterende ethanol in de buis, zonder contact met de regio die de pellet woont in. Laat het GLB open op de buis gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur om verdamping van residuele ethanol.
- Resuspendeer de pellet in door vortexing in 20 µL van schone, nuclease-gratis water.
Optioneel: Warmte het RNA bij 65 oC gedurende 3 minuten en onmiddellijk terugkeren naar het ijs. RNA kan worden opgeslagen bij-80 oC of onmiddellijk gebruikt voor reverse transcriptie en qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zorgvuldige dissectie van muis embryo's bij e10.5 van de baarmoeder hoorn moet onbeschadigd embryo's in PBS voor verdere dissectie (Figuur 1A) opleveren. Het maag-darmkanaal kan efficiënt worden verwijderd van het embryo (Figuur 1,B), het toelaat van onderscheidingsvermogen van de dorsale alvleesklier toppen op de kruising van de darm en maag (Figuur 1C-F). De alvleesklier kiem van e10.5 heeft eerder gekenmerkt; progenitoren kenbaar moeten maken voor Pdx1, Sox9, Ptf1a, en Hes120,21,22,23. Na weefsel verwerking stappen, gedissocieerde alvleesklier afzonderlijke cellen of kleine groepen van cellen kunnen worden gevisualiseerd door de lichte microscopie (Figuur 1G-H).
Organogenese media, deze vrij zwevende, steiger-vrije cellen zelf samenstellen en organiseren in driedimensionale pancreatoids die groeien en blijven van kracht gedurende ten minste tien dagen in cultuur(Figuur 2). De pancreatoids hebben morfologische overeenkomsten met de in vivo alvleesklier, met vertakkende morfogenese voordoet. Met behulp van transgene muizen, kunnen verschillende soorten cellen of processen worden gecontroleerd in real-time. Bijvoorbeeld kunt met behulp van Ins1-eGFP24 muizen naar aanleiding van de vorming van endocriene beta cellen, pancreatoids worden beeld in dagelijks te visualiseren van beta cel ontwikkeling (Figuur 2B). Verder, door veranderen kweekomstandigheden, toe te voegen kleine molecules, drugs of manipuleren van het genoom, niet alleen kan de cel lot bepaling worden beoordeeld, maar wijzigingen in de structuur en morfologie kunnen ook worden onderzocht. Hier tonen we de toepassing van proteïne kinase C activator phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) bij hoge concentraties (160 nM), die verandert de morfologie van de ontwikkeling van pancreatoids, wat leidt tot losjes verbonden epitheliale cellen en verhoogd vertakking 19 (Figuur 2C).
Om te beoordelen van de associatie van de alvleesklier mesenchym weefsel met alvleesklier epitheliale cellen, kan immunokleuring worden uitgevoerd voor markeringen voor elk weefsel. Immunokleuring van duct marker, DBA25,26, met een endocriene markeringen, Chga27en kernen gekenmerkt door DAPI onthullen multi lineage vorming in pancreatoids (Figuur 3A). Een mesenchym marker, Vimentin, co gekleurd met een alvleesklier voorlopercellen marker (van e9.0 tot ongeveer e15.5) Pdx1, blijkt dat het mesenchym omhult de pancreatoid (Figuur 3B). Immunokleuring kan ook worden gebruikt om te onderzoeken morfologie, met Pdx1 onthullend vertakkende structuren, evenals verschillende merkers van de celtypes van belang. In Figuur 3C, visualiseren we beta cel ontwikkeling door kleuring voor de epitheliale markering Pdx1 en de markering van beta cel Ins. Using qPCR analyse, afschriften van voorlopercellen en differentiatie van cellen een worden beoordeeld, zoals voorlopercellen genen Pdx1 en Hes1, en gedifferentieerde markeringen, Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1, en Ins1 (Figuur 4).
Figuur 1: overzicht van de dissectie, dissociatie, en platen van de alvleesklier voorlopercellen e10.5 voor de generatie van pancreatoid. (A) de helderveld afbeelding van e10.5 embryo. (B) het schema van de dissectie procedure, vanaf de linkerbovenhoek. De rode, onderbroken lijnen geven gebieden te snijden, terwijl de groene streek het maag-darmkanaal is. Ten eerste, het hoofd wordt verwijderd gevolgd door het verwijderen van de voorpoot toppen en de opening van de kant van het organisme. (C) het maag-darmstelsel wordt zorgvuldig verwijderd, met de toppen van het hart en de lever uitsteken van de ventrale regio van het darmstelsel. De maag, darm en dorsale alvleesklier bud kunnen worden gevisualiseerd, zoals weergegeven in de afbeelding helderveld. (D) opheffing van het hart en de lever toppen. Schema is aan de linkerkant en de afbeelding helderveld ligt aan de rechterkant. (E) Pinching van het weefsel rond de dorsale alvleesklier kiem de kiem voor dissectie bloot te stellen. Schema is aan de linkerkant en de afbeelding helderveld ligt aan de rechterkant. (F) het maag-darmkanaal met de dorsale alvleesklier bud onder helderveld microscopie. In de afbeelding aan de linkerkant is de bocht in de darm zichtbaar, waar pincet kan worden geplaatst wanneer loskoppelen van het maag-darmkanaal van de spinale regio. Aan de rechterkant toont de hoge vergroting helderveld afbeelding zowel de dorsale en ventrale alvleesklier toppen. (G) verwijdering van dorsale alvleesklier bud en verwerking van weefsels voor dissociatie, hersuspensie in organogenese media, en plating. (H) de helderveld afbeelding toont gedissocieerde cellen onmiddellijk na beplating. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Toezicht op pancreatoids na verloop van tijd. (A) helderveld beelden van pancreatoids op dag 1, dag 2 en dag 3. Schaal bars = 100 um. (B) manipulatie van kweekomstandigheden alvleesklier genuitdrukking te onderzoeken. Hier, leidt de toevoeging van hoge niveaus van PMA tot losgedraaide epitheliale structuur en verhoogde vertakking, zoals gevisualiseerd door helderveld microscopie op dag 1 en 2. Schaal bars = 100 µm. (C) Ins1-eGFP muis pancreatoids op dag 4, dag 5 dag 6, dag 7 en dag 9, met de ontwikkeling van beta cellen aangegeven door eGFP in het groen. Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Immunokleuring van pancreatoids. (A) immunokleuring pancreatoid op dag 5 om te markeren van leidingen door DBA in rood, endocriene cellen door Chga in groen en kernen gekenmerkt door DAPI in blauw. (B) immunokleuring pancreatoid op dag 7 ter gelegenheid van mesenchym door Vimentin in rood en alvleesklier progenitoren door Pdx1 in het groen. (B) immunokleuring pancreatoid op dag 7 ter gelegenheid van de beta-cellen door insuline in rood en alvleesklier progenitoren door Pdx1 in het groen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Transcript analyse. Kwantitatieve PCR van dag 7 pancreatoids voor markers van voorlopercellen en onderscheidende cellen. Vergelijking met in vivo lymfkliertest weefsel wordt weergegeven in Scavuzzo et al. (2017). resultaten zijn genormaliseerd naar Gapdh. N = 2, schaal bars zijn SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Component | Afkorting | Eindconcentratie |
| Penicilline-streptomycine | P/S | 1% |
| FBS-vrije media aanvullen | 10% | |
| Bèta-Mercaptoethanol | BMT | 0.1 mM |
| Phorbol 12-myristaat 13-acetaat | PMA | 16 nM |
| Y-27632 of ROCK-remmer | RI | 10 uM |
| Epidermale groeifactor | EFG | 25 ng/mL |
| R-Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| zure Fibroblast groeifactor, Fibroblast groeifactor 1 | aFGF, FGF1 | 25 mg/mL |
| Natriumzout van heparine | Heparine | 2 U/mL |
| Fibroblast groeifactor 10 | FGF10 | 100 ng/mL |
| Dulbecco van bewerkt Eagle Medium/nutriënt mengsel F-12 | DMEM/F12 | tot 5 mL |
Tabel 1. Organogenese media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De progressie van cel cultuur modellen is cruciaal voor goed model ontwikkelen, produceren klinisch relevante celtypes, test drug werkzaamheid of zelfs transplantatie aan patiënten. Echter kunstmatig Recapitulerend ontwikkeling in een schotel is een uitdaging zoals we zijn nog lang niet het begrip van de mechanismen van de organogenese en fysiologie in vivo. In vitro cellen zijn dus inefficiënt gegenereerde, niet volledig functioneel, kunnen worden gehandhaafd voor langere tijd, of haven van andere afwijkingen van vergelijkbare cellen in het lichaam. Dit is omdat er veel verschillende celtypen interactie tussen terwijl complexe morfogenetische veranderingen plaatsvinden om te beïnvloeden ontwikkeling en fysiologie. Verkrijgen van een goed begrip van hoe de ontwikkeling verloopt door de combinatie van het gemak van in vitro zou systemen met behoud van de complexiteit van in vivo ontwikkeling geven een waardevol instrument voor het biomedisch onderzoek.
De ontwikkeling van organoids is een veelbelovende laan naar de modellering van de ingewikkeldheid van ontwikkeling. In dit protocol, duidelijk naar voren komt hoe maak je alvleesklier organoids, genoemd pancreatoids, die inheemse mesenchym behouden en krachtig genereren endocriene cellen, zij het pancreatoids geen glucose responsiviteit vertonen. Deze tool kan worden gebruikt om de mechanismen van ontwikkeling, alsook de functionaliteit in een cultuur-systeem dat de heterogeniteit van weefsel gevonden in vivo handhaaftonderzoeken. Dit kan verder worden gebruikt voor genetische schermen of scherm kleine moleculen of drugs. Dit is met name interessant, zoals testen kandidaat-geneesmiddelen in relatief homogene cel cultuur systemen kunnen het omzeilen van effecten van deze stoffen op andere nauw verwante celtypes.
Er zijn verschillende kritische stappen tijdens dit protocol. Ten eerste, het zorgvuldig verwijderen van embryo's uit de baarmoeder is belangrijk als het uittrekken van de embryo's van krachtig kan rippen van de abdominale regio en maken het moeilijk om te onderscheiden van het maag-darmkanaal om te verkrijgen van de alvleesklier kiem (stap 1.3). Tweede, schone dissectie van de alvleesklier kiem van het maag-darmkanaal is kritisch, omdat nemen overtollige weefsel tot differentiatie van andere celtypes (stap 1.4.4 leiden kan). Om dit te doen, is het belangrijk te knijpen onder de alvleesklier kiem en het weefsel van de overlay voorafgaand aan de alvleesklier kiem isoleren op te heffen. Tot slot, wanneer verhuizen toppen van de dispase terug naar de PBS te wassen, is het noodzakelijk om te gebruiken een capillair borosilicaat en het weefsel aanraking van de rand van de opening van de tube niet te laten, anders, het weefsel zal vasthouden aan het uiteinde van de buis (stap 1.5.1). Om dit te voorkomen, beginnen mond pipetting oplossing alvorens naar de kiem, waardoor de kiem te gaan in de buis, in plaats van aan de buitenkant.
Deze methode kunnen de vorming van de endocriene cellen in een 3D pancreatoid, echter de epitheliale vertakking is beperkter dan andere bestaande protocollen16,17. Verder, terwijl endocriene insulineproducerende vorm cellen, ze geen vertonen glucose responsiviteit. Dus kan verder onderzoek naar de rijping van deze cellen waardevolle informatie opleveren zowel in de generatie van functionele pancreatoids alsmede op het gebied van beta cel generatie in het algemeen.
De generatie van pancreatoids die zich ontwikkelen endocriene cellen, in de toekomst, en waar u verkrijgen van glucose responsiviteit potentiële gevolgen heeft voor de behandeling van diabetes. Diabetes is een uitstekende kandidaat voor regeneratieve therapie, zoals alvleesklier beta cellen verloren of disfunctionele zijn en vervanging van deze cellen potentieel complicaties van de ziekte verlichten kan. Vooruitgang is geboekt in het onderscheiden van hPSCs in beta cellen, echter in diabetes, zijn er vaak disfuncties naar andere celtypes in de alvleesklier samen met beta-cellen, met inbegrip van alpha cellen of acinaire cellen28,29, 303231,,. Dus, het genereren van nieuwe alvleesklier weefsels voor transplantatie kan volledig vervangen het getroffen weefsel. Met het extra onderzoek naar lymfkliertest pancreatoid vorming en de werking, kan de ontwikkelings traject worden geïmiteerd voor het genereren van menselijke pancreatoids uit hPSCs. Deze menselijke pancreatoids kan worden gebruikt voor de gepersonaliseerde geneeskunde naar scherm voor responsiviteit drugs in een patiënt-specifieke context en regeneratieve therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Jolanta Chmielowiec voor nuttige discussie over het protocol en het manuscript. Wij danken ook Benjamin Arenkiel voor toegang tot de confocal microscoop. Dit werk werd gesteund door de NIH (P30-DK079638 naar M.B.) en T32HL092332-13 M.A.S. en M.B., de McNair medische Stichting (M.B.) en de confocal kern op de BCM intellectuele en ontwikkelingsstoornissen Research Center (NIH U54 HD083092 van de Eunice Kennedy Shriver nationale Instituut van kind gezondheid en menselijke ontwikkeling).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
