Summary
Nous présentons ici un protocole pour produire de l’insuline exprimant 3D pancreatoids murin de progéniteurs pancréatique flottant e10.5 dissocié et le mésenchyme associé.
Abstract
Le pancréas est qu'un organe complexe composé de plusieurs types de cellules différentes qui travaillent ensemble pour réguler la digestion et l’homéostasie du glucose du sang. Ces types de cellules comprennent des cellules acineuses sécrétant des enzymes, un système canalaire arborisé responsable pour le transport des enzymes de l’intestin et productrices de l’hormone des cellules endocrines.
Bêta-cellules endocrines sont le type de cellule unique dans le corps qui produisent l’insuline pour abaisser la glycémie. Le diabète, une maladie caractérisée par une perte ou à la dysfonction des cellules bêta, atteint des proportions épidémiques. Ainsi, il est essentiel d’établir des protocoles afin d’étudier le développement des cellules bêta qui peut être utilisé pour des fins de dépistage pour dériver de la drogue et les thérapies cellulaires. Alors que l’étude expérimentale du développement chez la souris est essentielle, des études in vivo sont laborieux et fastidieux. Les cellules cultivées fournissent une plate-forme plus commode pour le dépistage ; Cependant, ils sont incapables de maintenir la diversité cellulaire, organisation architectonique et interactions cellulaires trouvées in vivo. Ainsi, il est essentiel de développer de nouveaux outils pour étudier la physiologie et l’organogénèse du pancréas.
Les cellules épithéliales du pancréas développent en étroite association avec mésenchyme dès le début de l’organogenèse comme cellules organisent et se différencient en l’organe adulte complexe, physiologiquement compétent. Le mésenchyme pancréatique fournit des signaux importants pour le développement du système endocrinien, dont beaucoup ne sont pas bien compris encore, donc difficile de récapituler au cours de la culture in vitro . Nous décrivons ici un protocole à la culture souris complexes en trois dimensions, cellulaire organoïdes qui conservent le mésenchyme, appelé pancreatoids. Le bourgeon du pancréas murin e10.5 est disséqué, dissocié et cultivé dans un environnement sans échafaudage. Ces cellules de flottants s’auto-assembler avec mésenchyme enveloppant le pancreatoid en développement et quelques robustes de bêta-cellules endocrines, développant ainsi que l’acineuses et les cellules de la gaine. Ce système peut être utilisé pour étudier les interactions cellulaires sort détermination, organisation structurelle et morphogenèse, cellules pendant l’organogenèse, ou pour la drogue, petite molécule ou dépistage génétique.
Introduction
Délimiter les mécanismes du développement normal et la physiologie est primordiale pour comprendre l’étiologie de la maladie et de cultiver en fin de compte les méthodes de traitement. Alors que la mise en culture et la différenciation des cellules souches permettent une analyse rapide et haut débit de développement, il est limité par l’acquis des connaissances sur les mécanismes de régulation sort de la cellule et récapitule artificiellement le développement dans un relativement un État homogène, deux dimensions1,2. Non seulement en vivo développement touché par des influences extrinsèques, avec différents types de cellules dans la niche et le milieu fournit des signaux paracrines et soutien organisationnel pour guider l’organogenèse, mais la fonction de ces cellules s’appuie également sur leur cadre d’orientation3,4,5. Compte tenu de l’importance de ces facteurs externes, les limitations des protocoles de différenciation et la nature laborieuse des modèles de souris in vivo , nouveaux systèmes sont nécessaires pour étudier expérimentalement physiologie et processus de base du développement.
L’émergence des protocoles pour générer organoïdes Three-Dimensional, complexe fournit un système commode et congruent pour étudier l’organogénèse, la physiologie, l’efficacité du médicament et même pathogenèse. Établissement organoïdes murin pour différents systèmes tels que l' estomac de6 et l’intestin7 ont élargi notre compréhension de l’organogenèse, fournissant un outil pour étudier les complexités du développement avec moins de restrictions que en vivo et les modèles in vitro . En raison de ces avancées dans la murine organoïde formation et l’avènement de pluripotentes humaines découlent cellules, intestinale humaine8, rétinienne9, rénale10,11, et cérébral12 organoïdes ont été produites et ce Répertoire est seulement limitée par les connaissances actuelles concernant les mécanismes de développement.
Un intérêt particulier est la génération de pancréatique organoïdes, comme les types différents de cellules pancréatiques, y compris les cellules acineuses et conduits à l’insuffisance pancréatique exocrine13, cellules acineuses dans la pancréatite14, sévit dans une multitude de maladies et cellules bêta dans le diabète15. Acquérir des connaissances concernant l’évolution de ces différents types de cellules puisse aider à comprendre leur pathologie et peut, aussi, servir de plate-forme pour le dépistage des drogues personnalisée ou de la transplantation. Auparavant, Greggio et coll. a développé une méthode pour créer des murins organoïdes pancréatique récapituler en vivo morphogenèse et de développer des structures organisées, en trois dimensions, complexes composés de toutes les principales cellules épithéliales du pancréas types de16,17. Il s’agit d’une avancée majeure dans le domaine du pancréas, surtout en faisant des cellules in vitro pouvez activer investigation biologique du développement des cellules bêta. Toutefois, la rareté des cellules endocrines formé dans le présent protocole à moins que les organoids ont été transplantés dans les tissus, où la niche pourrait interagir et fournir des repères pédagogiques17. Le mésenchyme constitue la plus grande partie de la niche, très enveloppant l’épithélium en développement depuis le début de l’organogenèse aux stades ultérieurs, y compris la délamination endocrinienne et différenciation3,4, 18. L’interaction entre le mésenchyme et le pancréas en développement est encore un autre exemple de signalisation extrinsèque et l’importance de maintenir in vivo la complexité cellulaires pour étudier l’organogenèse.
Nous décrivons ici comment générer en trois dimensions organoïdes pancréatique, appelé pancreatoids, de e10.5 dissociées des progéniteurs pancréatique murine. Ces pancreatoids conserver mésenchyme natif, s’auto-assembler en conditions flottantes et générer tous les types de grandes cellules pancréatiques, dont quelques cellules endocrines de beta19robuste. Cette approche est plus adaptée pour l’analyse du développement endocrinien, comme les protocoles précédents n’ont pas la différenciation endocrine robuste. Cependant, en utilisant le protocole pour organoïdes pancréatique tel que décrit par Greggio et coll. est mieux adapté pour l’analyse de ramification épithéliales du pancréas et de la morphogenèse, comme ramification est plus limitée en pancreatoids.
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Protocol
Toutes les expériences animales décrites dans cette méthode ont été approuvées par le Comité utilisation du Baylor College of Medicine et d’institutionnels animalier.
1. préparation des progéniteurs pancréatiques de souris embryonnaires jour 10,5
Remarque : Ce protocole n’a pas à suivre dans des conditions stériles jusqu'à l’étape 2, mais il est optimal pour stériliser les outils de dissection et pulvériser avec avant l’utilisation d’éthanol à 70 %.
- Pour mettre en place pour la dissection, remplissez un seau à glace et placez un récipient de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la glace. Nettoyez les deux pinces à pointe fine et ciseaux de dissection à l’éthanol à 70 %. Situé à proximité de la zone de dissection, un contenant d’au moins trois borosilicaté capillaire tubes, une pipette de la bouche, un briquet et filtrée 1 000 pointes de pipette µL.
- Préparer au moins 1 mL d’a froid de 1,25 mg/mL dilué dans l’eau stérilisée et place dans le deuxième puits d’une plaque 12 bien sur la glace. Mettre des PBS dans la première, troisième et quatrième puits des 12 plaque bien. Placez 1 mL de 0,05 % trypsine dans un 1,5 mL tube sur la glace. Préchauffer un secousse incubateur à 37 oC.
- Euthanasier e10.5 souris enceintes chronométré conformément aux lignes directrices IACUC. Vaporiser l’abdomen d’éthanol à 70 % à nettoyer la région avant d’effectuer une incision en forme de V sur les parties génitales de la souris à l’aide de ciseaux et pinces et poursuivre jusqu'à la membrane.
NOTE : Apparition d’un bouchon vaginal dans le présent protocole indique jour 0,5. À l’aide de 5 - souris âgés de 6 semaines, un gain de poids de plus de 2 g agit comme une mesure secondaire de fécondation réussie.- L’accise soigneusement l’utérus en faisant une incision dans les portions latérales supérieures de l’utérus, tirant l’orgue vers le haut de la souris et suite à cette incision vers le bas pour la région génitale avant de répéter de l’autre côté. Placez-le dans une boîte de Pétri avec du PBS de froid de 10 cm.
Remarque : Il est possible d’obtenir des organoïdes des cellules e11.5 dissociées, mais contrairement à la pancreatoids de e10.5, ces organoïdes ne sont pas encore caractérisées et donc ne peuvent pas conserver la capacité de se différencier en tous les trois lignées du pancréas majeures.
- L’accise soigneusement l’utérus en faisant une incision dans les portions latérales supérieures de l’utérus, tirant l’orgue vers le haut de la souris et suite à cette incision vers le bas pour la région génitale avant de répéter de l’autre côté. Placez-le dans une boîte de Pétri avec du PBS de froid de 10 cm.
- Sous un microscope à dissection léger, placez la boîte de Pétri et ouvrir lentement les tissus utérins en plaçant deux pinces entre chaque embryon et épluchage des tissus de la vésicule vitelline. Transfert d’embryons en saisissant le sac vitellin délicatement avec la pince et le placer dans une boîte de Pétri avec frais, de 10 cm froid PBS. Placez la boîte de Pétri sur glace.
NOTE : Il est important d’éliminer heedfully embryons, préférence maintenues dans le sac vitellin, comme suppression forcée peut tirer le cordon ombilical, déchirure des tissus de l’embryon et de compromettre l’intégrité structurale. - Déposer plusieurs gouttes de PBS sur un couvercle de boîte de Pétri de 10 cm. Ces gouttelettes permet de transférer l’embryon au cours de la dissection comme tissus extra-embryonnaires sont retirées pour assurer la visibilité. Transfert d’un embryon à une baisse de PBS et retirez doucement le sac vitellin avec une pincette, alors que les embryons restants restent dans du PBS sur la glace (Figure 1A). Sortez la tête avant de rejoindre une nouvelle goutte de PBS à l’aide de pinces à évider légèrement l’embryon, à ne pas endommager le tissu (Figure 1B) de l’embryon.
NOTE : Le tissu devrez peut-être être transférées plus fréquemment à des gouttelettes de PBS frais que celle décrite ici, selon l’opacité du liquide.- Une nouvelle chute de PBS, enlever les bourgeons des membres antérieurs avec une pincette (Figure 1B). Placer la pince dans l’ouverture où se trouvait le bourgeon de membre et doucement déchirer seulement le tissu externe plus vers l’avant (Figure 1B). Tourner l’embryon et répéter dans le sens postérieur, s’arrêtant à le œuf du membre postérieur. À ce stade, le tube digestif doit être visible (Figure 1B).
- La région postérieure du tube digestif a une légère courbure (Figure 1F). Insérer pinces derrière ce virage dans l’ouverture entre le tube digestif et de la région de la colonne vertébrale de la paroi du corps. Détacher le tube digestif, travaillant lentement vers le haut jusqu'à ce que la région plus antérieure est atteint lorsque la région cardiaque connecte (Figure 1B-E).
FACULTATIF : Retirez le coeur primordial et les bourgeons du foie les régions ventrales du tractus gastro-intestinal, laissant seulement le tube tube digestif continu. Les premières fois ce protocole est réalisé, il pourrait être plus facile de laisser le cœur et le foie comme points de repère ventrales jusqu'à ce que la morphologie de l’appareil gastro-intestinal et le bourgeon du pancréas dorsal sont plus familiers (Figure 1C et D ). - Transférer le tube digestif à la goutte de PBS frais.
- Prendre la pince et pincer doucement le tissu sous le bourgeon qui dépasse et l’intestin et soulevez légèrement le tissu extérieur au large (Figure 1,D-F).
Remarque : Le bourgeon du pancréas dorsal est situé entre l’estomac et l’intestin (Figure 1C-G). Le bourgeon du pancréas sous devrait ressembler à une structure ronde, noueuse (Figure 1G). - Placez les pinces où le œuf se connecte à l’intestin et le pincement vers le haut pour desserrer le bourgeon (Figure 1G). Laver une seule fois dans une nouvelle bulle de PBS avant de transférer l’oeuf dans le premier puits de la plaque de 12 puits dans du PBS froid sur la glace. Répétez jusqu'à ce que tous les bourgeons sont collectées à partir d’embryons et placés dans le premier puits de la plaque bien 12.
- Placer le plat bien 12 sous le microscope à dissection léger. Compter le nombre de bourgeons pancréatiques disséqué avec succès pour ensuite calculer le coefficient de fractionnement.
- Place un filtrée 1 000 µL de pipette dans la pipette de bouche avec un tube capillaire jointe. Flamme stériliser le tube capillaire et créer un coude dans le tube pour la facilité d’utilisation. Le capillaire permet de transférer des bourgeons à la deuxième solution a froid contenant bien pendant 2 min avant de les transférer à la troisième puits avec du PBS propre (Figure 1G).
Remarque : Pendant le transfert des bourgeons d’a à PBS, évitez de toucher les tissus jusqu'à l’extrémité du tube capillaire. Si le tissu se coince à l’extrémité du tube, pipette de haut en bas ou secouer dans la solution de PBS propre jusqu'à ce que desserré. - Pipetter bourgeons de haut en bas et transférer dans le 4e puits avec du PBS propre. Enfin, en utilisant le transfert capillaire périphérique bourgeons au tube de 1,5 mL avec 0.05 % trypsine. Placer le tube dans le shaker de 37 oC préchauffé et agiter à 1 500 tr/min pendant 4 min.
- Vortex pour environ 10 s puis placer immédiatement le tube dans une centrifugeuse et un essorage pendant 5 min à 200 g. retirer tout mais environ 50 µL de solution avec prudence quant à ne pas déranger les cellules centrifugés (Figure 1G).
- Place un filtrée 1 000 µL de pipette dans la pipette de bouche avec un tube capillaire jointe. Flamme stériliser le tube capillaire et créer un coude dans le tube pour la facilité d’utilisation. Le capillaire permet de transférer des bourgeons à la deuxième solution a froid contenant bien pendant 2 min avant de les transférer à la troisième puits avec du PBS propre (Figure 1G).
2. mise en culture des progéniteurs dissociés pour former Pancreatoids
Remarque : Ce qui suit doit être effectué dans une atmosphère stérile sous une hotte de vitroplants standard, en utilisant des procédures stériles standards.
- Pour chaque bourgeon recueillie, ajouter 400 µL organogenèse médias16,17 (tableau 1) pour les cellules centrifugés. Vortex d’impulsion trois fois et plaque 100 µL / puits d’un faible attachement 96 bien plate, fractionnement des bourgeons à un ratio de 1:4 (Figure 1G).
- Vérifier au microscope pour visualiser dissocié de cellules flottant librement (Figure 1H). Posez le plat de la culture dans un incubateur à 37 oC avec 5 % de CO2 sur un rocker à vitesse moyenne.
- Surveiller la progression de pancreatoids tous les jours. Remplacer par 100 µL de supports neufs tous les 3 jours, soigneusement pipetage médias sous contrôle microscopique dans la hotte pour enlever tout en laissant pancreatoid dans le puits. Sinon, frais 100 µL de médias peuvent être ajoutés à un nouveau puits et pancreatoid en utilisant le tube capillaire de borosilicate, attaché à la pipette de la bouche et 1000 µL filtrée de pipette.
3. le traitement Pancreatoids pour l’imagerie par immunofluorescence
- Pour traiter les pancreatoids pour les images par immunofluorescence, tout d’abord préparer 4 % paraformaldéhyde/PBS, solution de pH7.4 (PFA). Déposer 50 µL de 4 % PFA dans les puits d’un 96 bien plate.
- Grâce aux tubes capillaires en verre borosilicaté et la pipette de la bouche avec la pipette filtrée de 1 000 µL, transfert pancreatoids de milieu de culture compte médias aussi peu que possible du puits fraîche avec 4 % PFA. Situé sur la bascule à température ambiante pendant 15 min.
- Transfert pancreatoids de 4 % PFA dans un puits avec 100 µL de PBS frais, rock à température ambiante pendant 5-10 min. Repeat pour un total de trois lavages de PBS frais.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici, avec pancreatoids stocké dans 100 µL de PBS à 4 oC pendant une semaine.
- Pour l’imagerie wholemount (recommandé si les anticorps sont une approche convenable, alternative à la section 3.3. et microscopie 3.4.), transfert de PBS dans 50 µL de sérum âne 5 % dans du PBS 1 x avec 0,1 % de détergent non ionique (PBST) au bloc. Roche du jour au lendemain à 4 oC ou alternativement pendant 4 h à température ambiante.
- Transfert pancreatoids vers un nouveau puits contenant des anticorps primaires dilués dans 50 µL de sérum d’âne de 5 % à 1 x PBST. Idéalement, rock pendant 24 h à 4 oC (au moins 12 h, mais jusqu'à 36 h).
Remarque : Les anticorps énumérés dans la Table des matières contre Chga (1/100), s/n (1 : 400), Vim (1 : 400) et Pdx1 (au 1/100) conviennent pour la coloration de wholemount ; autres anticorps peuvent exiger l’optimisation. - Transfert pancreatoids vers un puits contenant 100 µL de PBST fraîche pour laver et balancer durant 30 min à température ambiante. Répétez cette étape pour un total de trois lavages frais de PBST.
- Transfert pancreatoids vers un nouveau puits contenant des anticorps secondaires dilués dans 50 µL de sérum d’âne de 5 % à 1 x PBST. Protéger la plaque de la lumière et placer à 4 oC, bascule de façon optimale 24h (au moins 12 h, mais jusqu'à 36 h).
Remarque : Tous les anticorps secondaires répertoriés dans la Table des matières et DAPI contre-colorant nucléaire conviennent pour une coloration wholemount. - Transfert pancreatoids vers un nouveau puits contenant 100 µL de 1 x PBST et rock à température ambiante pendant 30 min. Repeat pour un total de trois lavages en 1 x PBST. Dans le troisième et dernier lavage, ajouter 300 nM DAPI.
- Enfin, placez dans 100 µL de PBS propre et le magasin à 4 oC à l’abri de la lumière pour jusqu'à une semaine avant l’imagerie par microscopie confocale, bien que les meilleurs résultats proviennent de l’imagerie immédiatement après la coloration. Pour éviter les mouvements de pancreatoids au cours de l’imagerie, mais éviter le dessèchement, placez chaque pancreatoid dans une goutte de 20 µL de PBS. Si pancreatoids ne restent pas toujours, réduire le volume de PBS.
- Transfert pancreatoids vers un nouveau puits contenant des anticorps primaires dilués dans 50 µL de sérum d’âne de 5 % à 1 x PBST. Idéalement, rock pendant 24 h à 4 oC (au moins 12 h, mais jusqu'à 36 h).
- Pour les coupes congelées, transfert pancreatoids de PBS dans une solution de saccharose 30 % durant la nuit à 4 oC.
- Ajouter des éléments multimédias encastrement dans une bulle sous un microscope à dissection. À l’aide de forceps sous contrôle microscopique, tremper les pancreatoids en poussant doucement à travers les médias encastrement plusieurs fois pour enlever le saccharose résiduel avant de les transférer à un bloc de tissu avec milieu encastrement gelé.
- Placez le bloc de tissu sur la glace sèche jusqu'à ce que la gelée et la section sur le cryostat à 8 µm.
Remarque : Sections peuvent être stockées immédiatement à-80 oC ou immunostained. - Permettre à des sections de-80 oC pour décongeler à température ambiante pendant environ 5 min à sec. Dessiner une barrière hydrophobe, vous utilisez le stylet de pap hydrophobe autour du tissu et le bloc à l’aide de 5 % de sérum d’âne dilué dans 1 x PBST pendant 30 min à température ambiante.
- Retirez les supports et les remplacer immédiatement avec des anticorps primaires dilués à 5 % de sérum d’âne dilué dans 1 x PBST nuit à 4 oC.
- Enlever la solution primaire et laver les tissus trois fois avec 1 x PBST pour 10 min chacun. Suite à cela, ajouter la solution d’anticorps secondaire diluée à 5 % de sérum d’âne dilué dans 1 x PBST pendant 1 h à température ambiante et de protéger les lames de la lumière.
- Enlever la solution secondaire et les lames trois fois en 1 x PBST de 10 min chacun. Dans le lavage final, ajouter 300 nM DAPI.
- Retirez les supports et ajouter des supports de montage et un lamelle couvre-objet. Magasin de glisse abri de la lumière à 4 oC jusqu’au moment de l’image.
4. isolement de l’ARN du Pancreatoids pour l’analyse de la transcription
- Recueillir des pancreatoids à l’aide de capillaire de borosilicate attaché à une pipette de bouche avec un filtrée 1 000 µL pipette pour stérilité et lieu dans 500 µL de solution de thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium acide dans un tube de 1,5 mL. Conserver à-80 oC ou procéder immédiatement à l’isolement d’ARN.
- Pour les ARN, décongeler les échantillons sur la glace si nécessaire et ajouter 100 µL de chloroforme. Vortex bien et place à 4 oC pendant 15 min. refroidissent préalablement une centrifugeuse à 4 oC.
- Placer les tubes dans la centrifugeuse et un essorage pendant 20 min à 12 000 g à 4 oC.
- Retirer délicatement les tubes pour ne pas déranger la séparation des couches. À l’aide d’une pipette µL 200, collecter la solution aqueuse limpide et placer dans un nouveau tube de 1,5 mL, laissant derrière une petite quantité de mémoire tampon de la couche protéique blanc et rose couche d’ADN. Ne touchez pas l’embout de la pipette à rien dans ce processus et ne pas toucher les parois du tube 1,5 mL.
- Ajouter 500 µL d’isopropanol 100 % dans le nouveau tube contenant la phase aqueuse et vortex. Laisser reposer à température ambiante pendant 20 min, plus de temps sur la glace, ou de précipitations maximales laisser une nuit à-20 oC.
- Centrifuger à 12 000 g pendant 15 min à 4 oC pour granuler la RNA. Supprimer l’isopropanol sans déranger le culot.
Remarque : Comme pancreatoids sont de petite taille, il est probable que la pastille ne sera pas visible. - Ajouter froid, 75 % d’éthanol et inverser le tube plusieurs fois. Placer dans la centrifugeuse et essorage à 9 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Retirer l’éthanol et l’essorage pendant 2 min à 9 000 x g.
- Utiliser une pipette de 200 µL d’enlever tout l’éthanol restant dans le tube, sans contact avec la région dans que le culot réside. Laisser le bouchon ouvert sur le tube pendant 5-10 min à température ambiante pour assurer l’évaporation d’éthanol résiduel.
- Resuspendre culot au vortex dans 20 µL d’eau propre et exempte de nucléase.
Facultatif : Chaleur l’ARN à 65 oC pendant 3 min et immédiatement retourner sur la glace. ARN peut être conservé à-80 oC ou immédiatement utilisé pour la transcription inverse et qPCR.
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Representative Results
Une dissection minutieuse des embryons de souris à e10.5 de la corne utérine devrait produire des embryons intacts dans du PBS pour davantage de dissection (Figure 1A). Le tractus gastro-intestinal peut être efficacement retiré de l’embryon (Figure 1B), permettant de discerner le bourgeon du pancréas dorsal à la jonction de l’intestin et l’estomac (Figure 1A-C). Le bourgeon du pancréas e10.5 a déjà été caractérisé ; progéniteurs devraient exprimer Pdx1, Sox9, Ptf1a et Hes120,21,22,23. À la suite des étapes de traitement de tissus, dissociés pancréatiques cellules individuelles ou en petits groupes de cellules peuvent être visualisées par microscopie optique (Figure 1G-H).
Dans les milieux de l’organogenèse, ces cellules flottant librement, exempt d’échafaudage s’auto-assembler et organisent en trois dimensions pancreatoids qui se développent et persistent pendant au moins dix jours de culture (Figure 2A). Les pancreatoids ont des similitudes morphologiques du pancréas en vivo , avec ramification morphogenèse se produisant. À l’aide de souris transgéniques, les différents types de cellules ou de processus peuvent être surveillés en temps réel. Par exemple, vous utilisez Ins1-eGFP24 souris pour marquer la formation de cellules endocrines de beta, pancreatoids peut être photographiée sur tous les jours à visualiser le développement des cellules bêta (Figure 2B). En outre, en altérant les conditions de culture, ajoutant de petites molécules, drogues ou en manipulant le génome, non seulement la détermination de destin cellulaire peut être évaluée mais changements dans la structure et la morphologie peuvent également être étudiées. Ici, nous montrons l’application de la protéine kinase C activateur phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) à des concentrations élevées (160 nM), qui modifie la morphologie du développement pancreatoids, menant à plus ou moins associés à des cellules épithéliales et augmenté la ramification 19 (figure 2C).
Pour évaluer l’association de tissu pancréatique mésenchyme pancréatique cellules épithéliales, immunomarquage peut être effectuée pour les marqueurs de chaque tissu. Immunomarquage de marqueur de conduit,25,s/n26, avec un marqueur endocrine, Chga27et noyaux marquées par DAPI révèlent des lignées multiples formation en pancreatoids (Figure 3A). Un marqueur de mésenchyme, vimentine, co colorées avec un marqueur de l’ancêtre du pancréas (à partir de e9.0 à environ e15.5) Pdx1, montre que le mésenchyme enveloppe la pancreatoid (Figure 3B). Immunomarquage permet également d’étudier la morphologie, avec Pdx1 révélateur des structures ramifiées, ainsi que des marqueurs différents types de cellules d’intérêt. Dans la Figure 3C, nous visualisons le développement des cellules bêta de coloration pour les marqueurs épithéliaux Pdx1 et le marqueur de cellules bêta Assur. Using qPCR analyse, transcriptions de géniteurs et de différencier les cellules un être évalués, tels que les gènes de l’ancêtre Pdx1 et Hes1 et des marqueurs différenciées Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1 Nkx6-1 et Ins1 (Figure 4).
Figure 1: plan de dissection, dissociation et bordé de progéniteurs pancréatique e10.5 pour la génération de pancreatoid. (A) l’image de fond clair de l’embryon e10.5. (B) le schéma de la procédure de dissection, en commençant en haut à gauche. Le rouge, les lignes pointillées indiquent des régions pour couper, tandis que la zone verte est le tractus gastro-intestinal. Tout d’abord, l’animal n’a été suivie de la suppression des bourgeons des membres antérieurs et l’ouverture du côté de l’organisme. (C) le tractus gastro-intestinal est soigneusement enlevé, avec les bourgeons de coeur et le foie qui dépassent de la région ventrale du tractus. Bourgeon pancréatique dorsale, l’estomac et l’intestin peuvent être visualisées, comme illustré dans l’image de fond clair. (D) retrait du cœur et du foie bourgeons. Schéma est sur la gauche et l’image de fond clair est sur la droite. Pincement (E) du tissu autour du bourgeon pancréatique dorsal pour exposer le bourgeon pour la dissection. Schéma est sur la gauche et l’image de fond clair est sur la droite. (F) le tube digestif avec le bourgeon du pancréas dorsal en microscopie fond clair. Dans l’image sur la gauche, le coude dans l’intestin est visible, lorsque la pince peut être placée lorsque détacher le tube digestif de la région de la colonne vertébrale. Sur la droite, l’image de fond clair de fort grossissement montre les deux bourgeons pancréatiques dorsales et ventrales. Enlèvement (G) du bourgeon pancréatique dorsale et traitement des tissus avant la dissociation, la remise en suspension dans les médias de l’organogenèse et placage. (H) l’image de fond clair indique les cellules dissociées immédiatement après l’ensemencement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Suivi pancreatoids au fil du temps. (A) des images de fond clair de pancreatoids au jour 1 et jour 2 jour 3. Barreaux de l’échelle = 100 um. (B) Manipulation des conditions de culture pour enquêter sur la morphogenèse du pancréas. Ici, l’ajout de niveaux élevés de PMA mène à structure épithéliale desserrée et ramification accrue, comme visualisés par microscopie à fond clair aux jours 1 et 2. Barreaux de l’échelle = 100 µm. (C) Ins1-eGFP souris pancreatoids au jour 4, jour 5, jour 6, jour 7 et jour 9, avec le développement des cellules bêta indiquée par eGFP en vert. Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Immunomarquage de pancreatoids. (A) pancreatoid d’immunomarquage à J5 pour marquer les conduits par DBA dans les cellules rouges, endocriniennes par Chga dans les noyaux par DAPI a marqué en bleu et vert. (B) pancreatoid d’immunomarquage au jour 7, à l’occasion du mésenchyme de vimentine dans des progéniteurs rouges et pancréatiques par Pdx1 en vert. (B) pancreatoid d’immunomarquage au jour 7 pour marquer des cellules bêta par l’insuline en progéniteurs rouges et pancréatiques par Pdx1 en vert. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse de la transcription. PCR quantitative de pancreatoids jour 7 marqueurs de cellules souches et différenciation des cellules. Comparaison in vivo des tissus murins apparaît en Scavuzzo et al. (2017). résultats sont normalisées à Gapdh. N = 2, échelle bars sont SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Composant | Abréviation | Concentration finale |
| Pénicilline-streptomycine | P/S | 1 % |
| Milieux FBS sans supplément | 10 % | |
| Bêta-mercaptoéthanol | afro-caribéens | 0,1 mM |
| Phorbol 12-Myristate 13-acétate | PMA | 16 nM |
| Inhibiteur de la Y-27632 ou de la roche | RI | 10 uM |
| Facteur de croissance épidermique | EGF | 25 ng/mL |
| R-Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| facteur de croissance fibroblastique acide, facteur de croissance fibroblastique 1 | FVA, FGF1 | 25 ug/mL |
| Sel de sodium de l’héparine | Héparine | 2 U/mL |
| Facteur de croissance fibroblastique 10 | FGF10 | 100 ng/mL |
| Dulbecco Modified Eagle Medium/nutriments mélange F-12 | DMEM/F12 | à 5 mL |
Le tableau 1. Médias de l’organogenèse.
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Discussion
La progression des modèles de culture de cellules est essentielle à l’élaboration d’un modèle correctement, produisent des types de cellules cliniquement pertinents, test de l’efficacité du médicament ou même greffe à des patients. Cependant, récapitulant artificiellement le développement dans un plat est difficile car nous sommes encore loin de comprendre les mécanismes de l’organogénèse et de la physiologie in vivo. In vitro les cellules sont donc générés de façon inefficace, pas entièrement fonctionnel, ne peut être maintenu pendant de longues périodes de temps, ou héberger d’autres anomalies des cellules comparables dans le corps. C’est parce que plusieurs types de cellules différents interagissent alors que des changements complexes morphogénétiques se produisent pour influencer le développement et la physiologie. Comprendre comment le développement produit en combinant la commodité de in vitro systèmes tout en conservant la complexité du développement de in vivo seraient leur donner un outil précieux pour la recherche biomédicale.
Le développement d’organoïdes est une piste prometteuse vers la modélisation de la complexité du développement. Dans ce protocole, nous exposons comment faire organoïdes pancréatique, appelé pancreatoids, qui conservent mésenchyme natif et robuste génèrent des cellules endocrines, quoique les pancreatoids ne présentent pas de réactivité du glucose. Cet outil peut être utilisé pour étudier les mécanismes de développement ainsi que des fonctionnalités dans un système de culture qui maintient l’hétérogénéité des tissus trouvés en vivo. En outre, cela peut être utilisé pour écrans génétiques ou pour les petites molécules écran ou médicaments. C’est particulièrement intéressant, car test médicaments candidats dans les systèmes de cultures cellulaires relativement homogène peuvent contourner les effets de ces composés sur d’autres types de cellules étroitement apparentées.
Il y a plusieurs étapes cruciales au cours du présent protocole. Tout d’abord, l’enlèvement soigneux d’embryons de l’utérus est important comme tirant avec force les embryons peut déchirer la région abdominale et il est difficile de discerner le tractus gastro-intestinal pour obtenir le bourgeon du pancréas (étape 1.3). Deuxièmement, propre dissection du bourgeon pancréatique par le tractus gastro-intestinal est essentielle, que prendre des tissus en excès peut conduire à la différenciation des autres types de cellules (étape 1.4.4). Pour ce faire, il faut pincer sous le bourgeon du pancréas et soulevez le tissu de recouvrement avant d’isoler le bourgeon du pancréas. Enfin, lors du déplacement des bourgeons de l’a retour dans du PBS pour laver, il est impératif d’utiliser un tube capillaire de borosilicate et de ne pas laisser le tissu touchent le bord de l’ouverture du tube, sinon, le tissu s’en tiendra à l’extrémité de la canule (étape 1.5.1). Pour éviter cela, commencer à doser bouche avant de déménager vers le œuf, ce qui permet de le œuf d’aller dans le tube, plutôt qu’à l’extérieur.
Cette méthode permet la formation de cellules endocrines dans un pancreatoid 3D, cependant, la ramification épithéliale est plus limitée que celle des autres existants protocoles16,17. En outre, alors que la forme des cellules endocrines productrices d’insuline, ils ne présentent pas de réactivité du glucose. Ainsi, outre enquête sur la maturation de ces cellules fournira des renseignements précieux, tant dans la génération de pancreatoids fonctionnelles ainsi que le domaine de la génération de cellules bêta en général.
La génération de pancreatoids qui développent les cellules endocrines, et, à l’avenir, qui obtenir réactivité de glucose, a des implications potentielles pour le traitement du diabète. Le diabète est un candidat de choix pour la thérapie régénérative, comme les cellules bêta du pancréas sont perdus ou dysfonctionnel et remplacement de ces cellules peut alléger potentiellement des complications de la maladie. Progrès ont été accomplis dans la différenciation des hPSCs dans les cellules bêta, cependant, dans le diabète, il y a souvent des dysfonctionnements d’autres types de cellules dans le pancréas ainsi que les cellules bêta, y compris les cellules alpha ou cellules acineuses28,29, 30,31,32. Ainsi, générant de nouveaux tissus pancréatiques destinés à la transplantation peut remplacer complètement le tissu affligé. Avec le complément d’enquête de murin pancreatoid formation et le fonctionnement, la trajectoire du développement peut être imitée pour générer les humains pancreatoids hors hPSCs. Ces pancreatoids humaines peut être utilisés pour la médecine personnalisée à l’écran une réceptivité aux drogues dans un contexte spécifique au patient et pour la thérapie régénérative.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Jolanta Chmielowiec pour toute question utile concernant le protocole et le manuscrit. Nous remercions également Benjamin Arenkiel d’accès au microscope confocal. Ce travail a été soutenu par les NIH (P30-DK079638 à M.B.) et T32HL092332-13 au M.A.S. et M.B., la Fondation médicale McNair (à M.B.) et le noyau confocal au BCM intellectuelle et Developmental Disabilities Research Center (NIH U54 HD083092 de la Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et le développement humain).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
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