Summary
Aquí, presentamos un protocolo para generar insulina expresando 3D pancreatoids murino de e10.5 flotante disociado progenitores pancreático y el mesenchyme asociado.
Abstract
El páncreas es que un órgano complejo compuesto de muchos diferentes tipos de células que trabajan juntas para regular la digestión y la homeostasis de la glucosa de sangre. Estos tipos de células son las células acinares secretoras de enzimas, un sistema ductal arborized responsable para el transporte de las enzimas de las células endocrinas de las tripas y la producción de hormonas.
Endocrino de las células beta son el tipo celular único en el cuerpo que producen insulina para bajar los niveles de glucemia. Diabetes, una enfermedad caracterizada por una pérdida o disfunción de células beta, está alcanzando proporciones epidémicas. Por lo tanto, es indispensable establecer protocolos para investigar el desarrollo de las células beta que puede utilizarse para fines de investigación para obtener los medicamentos y terapias basadas en células. Mientras que la investigación experimental del desarrollo del ratón es esencial, en vivo los estudios son laboriosos y lentos. Las células cultivadas ofrecen una plataforma más conveniente para la investigación; sin embargo, no son capaces de mantener la diversidad celular, organización arquitectónica y las interacciones celulares que se encuentran en vivo. Por lo tanto, es esencial para desarrollar nuevas herramientas para investigar la fisiología y la organogénesis pancreática.
Pancreáticas células epiteliales se desarrollan en la asociación cercana con el mesénquima del inicio de la organogénesis como células organizan y diferencian en el complejo órgano adulto fisiológicamente competente. El mesénquima pancreático proporciona señales importantes para el desarrollo endocrino, muchos de los cuales no son bien entendidos todavía, por lo tanto difícil recapitular durante el cultivo en vitro . Aquí, describimos un protocolo cultura ratón complejo tridimensional, celular organoides que retienen mesenchyme, denominado pancreatoids. El brote pancreático murino e10.5 es disecado, disociado y cultivado en un ambiente libre de andamio. Estos flotan células auto montan con mesénquima que envuelven el desarrollo pancreatoid y un número sólido de endocrina las células beta en desarrollo junto con el acinar y las células del conducto. Este sistema puede ser utilizado para estudiar las interacciones de célula célula célula sino determinación, organización estructural y morfogénesis, organogénesis, o de drogas, de molécula pequeña o screening genético.
Introduction
Delinear los mecanismos del desarrollo normal y la fisiología es primordial para entender la etiología de la enfermedad y, en definitiva, cultivar métodos de tratamiento. Mientras que el cultivo y diferenciación de células madre permiten el análisis rápido y alto rendimiento de desarrollo, está limitada por el cuerpo existente de conocimientos sobre mecanismos de regulación sino de la célula y artificialmente recapitula el desarrollo en un relativamente Estado homogéneo bidimensional1,2. En vivo desarrollo afectado por influencias extrínsecas, con diferentes tipos de células en el lugar y entorno proporciona señales paracrinas y apoyo organizativo para orientar la organogénesis, no sólo la función de estas células también se basa en su alrededores de dirección3,4,5. Dada la importancia de estos estímulos externos, las limitaciones de los protocolos de diferenciación y la naturaleza laboriosa de modelos de ratón en vivo , nuevos sistemas se necesitan para investigar experimentalmente la fisiología y los procesos básicos del desarrollo.
La aparición de protocolos para generar organitas tridimensional, complejo proporciona un sistema conveniente y congruente para el estudio de la organogénesis, fisiología, eficacia de los medicamentos e incluso patogenia. Establecer organitas murino para diferentes sistemas como el estómago intestino y6 7 han ampliado nuestra comprensión de la organogénesis, proporcionando una herramienta para estudiar las complejidades del desarrollo con menos restricciones que en vivo y en vitro modelos. Debido a estos avances en el organoide murino la formación y el advenimiento de humanas pluripotentes células, intestinal humano8, retina9, renal10,11, y organitas cerebral12 se han producido y esto repertorio es limitado solamente por el conocimiento existente respecto de los mecanismos de desarrollo.
De particular interés es la generación de pancreático organoides, como una miríada de enfermedades plagas diferentes pancreático tipos celulares, incluyendo células acinares y conductos en la escasez pancreática exocrine13, las células acinares en pancreatitis14, y células beta en la diabetes15. Adquirir conocimiento sobre el desarrollo de estos diferentes tipos de células podría ayudar en la comprensión de su patología y puede, también, actuar como una plataforma de screening de drogas personalizada o trasplante. Previamente, Greggio et al desarrollaron un método para crear murino organitas pancreático que recapitulan en vivo morfogénesis y desarrollan estructuras organizadas, tridimensionales, complejas compuesto por las principales células epiteliales pancreáticas los tipos de16,17. Este es un gran paso adelante en el área pancreático, sobre todo lo que hacen las células en vitro puede permitir investigación biológica del desarrollo de la célula beta. Sin embargo, una escasez de células endocrinas formados en este protocolo a menos que los organoides se trasplantaron en el tejido, donde el nicho podría interactuar y proporcionar señales de instrucción17. El mesénquima constituye la mayor parte del nicho, muy envolvente el epitelio en desarrollo desde etapas iniciales de la organogénesis para etapas posteriores incluyendo delaminación endocrino y diferenciación3,4, 18. La interacción de la mesénquima con el páncreas en desarrollo es otro ejemplo de señales extrínsecas y la importancia de mantener en vivo la complejidad celular para el estudio de la organogénesis.
Aquí, describimos cómo generar tridimensional organitas pancreático, llamado pancreatoids, de progenitores pancreáticos murinos disociado los e10.5. Estos pancreatoids retener mesénquima nativo, uno mismo-montar en condiciones libres y generar todos los tipos de células pancreáticas principales, incluyendo un número sólido de células endocrinas beta19. Este enfoque es más adecuado para el análisis del desarrollo endocrino, como protocolos anteriores carecen de diferenciación endocrina robusta. Sin embargo, usando el protocolo para páncreas organoides de Greggio et al. , es más adecuado para el análisis de la ramificación epitelial pancreático y morfogénesis, como ramificación es más limitada en pancreatoids.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se describe en este método fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Baylor College of Medicine.
1. preparación del ratón embrionario día 10,5 progenitores pancreáticos
Nota: Este Protocolo no necesita seguir en condiciones estériles hasta el paso 2, sin embargo, es óptima para esterilizar instrumentos de disección y rocíe con antes del etanol al 70% de uso.
- Para configurar para la disección, llene un cubo de hielo y colocar un recipiente de tampón fosfato salino (PBS) en el hielo. Limpiar dos pinzas de punta fina y tijeras de disección con etanol al 70%. Situado cerca de la zona de disección, un recipiente con al menos tres borosilicate capilar tubos, una pipeta de boca, un encendedor y filtra las puntas de pipeta 1.000 μl.
- Preparar al menos 1 mL de dispase frío 1,25 mg/mL diluido en agua esterilizada y el lugar en el segundo pozo de una placa bien 12 en hielo. Poner PBS en la primera, tercera y cuarta pozos de 12 bien la placa. Colocar 1 mL de 0.05% tripsina de 1,5 mL tubo en hielo. Precaliente un incubador de agitación a 37 oC.
- Eutanasia a ratones embarazadas tiempo e10.5 con arreglo a directrices IACUC. Rocíe el abdomen con etanol al 70% para limpiar la región antes de hacer una incisión en forma de V en el área genital del ratón usando tijeras y pinzas y continuar hasta el diafragma.
Nota: La apariencia de un tapón vaginal en este protocolo indica día 0.5. Usando 5 - ratones de 6 semanas de edad, un aumento de peso de más de 2 g actúa como una medida secundaria de impregnación acertada.- Suprimir cuidadosamente el útero, haciendo una incisión en las porciones lateral superiores del útero, tirando el órgano hacia arriba del ratón y después de esta incisión hasta la región genital antes de repetir en el lado opuesto. Colocar en una placa de Petri con PBS frío de 10 cm.
Nota: Es posible obtener organoides de las células de e11.5 disociado, sin embargo a diferencia de la pancreatoids de e10.5, estos organoides no se caracterizan aún y así no podrán mantener la capacidad de diferenciarse en todos los tres principales linajes pancreáticos.
- Suprimir cuidadosamente el útero, haciendo una incisión en las porciones lateral superiores del útero, tirando el órgano hacia arriba del ratón y después de esta incisión hasta la región genital antes de repetir en el lado opuesto. Colocar en una placa de Petri con PBS frío de 10 cm.
- Bajo un microscopio de disección ligera, coloque la placa de Petri y abra con cuidado el tejido uterino colocando dos pinzas entre cada embrión y descamación del tejido de la vesícula vitelina. Transferencia de embriones agarrando el saco de yema de huevo suavemente con fórceps y colóquelos en una placa de Petri con fresco, de 10 cm PBS frío. Coloque el plato Petri en hielo.
Nota: Es importante eliminar Washingtgon embriones, preferentemente mantenidos dentro del saco de yema de huevo, como contundente eliminación puede tirar el cordón umbilical, extraer tejido del embrión y comprometer la integridad estructural. - Coloque varias gotas de PBS en una tapa de caja de Petri de 10 cm. Usar estas gotas para transferir el embrión durante la disección como extraembrionarias tejidos se quitan para asegurar visibilidad. Transferir un embrión a una gota de PBS y retire suavemente del saco de yema de huevo con unas pinzas, mientras que los embriones restantes permanecen en PBS en el hielo (figura 1A). Quitar la cabeza antes de mover el embrión de una nueva gota de PBS con unas pinzas sacar ligeramente el embrión, para no dañar el tejido (figura 1B).
Nota: El tejido deba transferirse con mayor frecuencia a gotitas frescas de PBS que se describe aquí, dependiendo de la opacidad del líquido.- En una nueva gota de PBS, quitar los brotes del miembro anterior con unas pinzas (figura 1B). Colocar pinzas en la abertura donde el esbozo estaba presente y rasgar suavemente sólo el tejido más externo anterior (figura 1B). Gire el embrión y repetir en la dirección posterior, en la yema del miembro posterior. En este punto, el tracto gastrointestinal debe ser visible (figura 1B).
- La región posterior del tracto gastrointestinal tiene una curva leve (Figura 1F). Insertar pinzas detrás de esta curva en la abertura entre el tracto gastrointestinal y de la región espinal de la pared del cuerpo. Extraer el tracto gastrointestinal, trabajando lentamente hacia arriba hasta alcanzar la región más anterior es DanDe la región cardíaca (figura 1B-E).
OPCIONAL: Quitar el corazón primordial y los brotes del hígado de las regiones ventrales del tracto gastrointestinal, dejando solamente el tubo intestinal continuo. Las primeras veces que se realiza este protocolo podría ser más fácil dejar el corazón y el hígado como ventral hasta la morfología del tracto gastrointestinal y el brote pancreático dorsal son más familiar (figura 1C y D ). - Traslado del tracto gastrointestinal a la dulce gota de PBS.
- Toma de fórceps y pellizcar suavemente el tejido debajo de la yema que sobresale y el intestino y levantar ligeramente el tejido exterior apagado (figura 1D-F).
Nota: El brote pancreático dorsal está situado entre el estómago y el intestino (figura 1C-G). El brote pancreático debajo debería verse como una estructura redonda, lleno de protuberancias (figura 1G). - Colocar pinzas donde la yema se conecta con el intestino y el sujetador hacia arriba para aflojar el brote (figura 1G). Lavar una vez en una nueva burbuja de PBS antes de transferir la yema en el primer pocillo de la placa de la pozo 12 en PBS frío en hielo. Repita hasta que todos los brotes obtenidos de embriones y colocados en el primer pocillo de la placa de la pozo 12.
- Coloque el plato bien 12 bajo el microscopio de disección ligera. Cuenta el número de yemas pancreáticas disecado con éxito más tarde calcular el cociente de la división.
- Lugar filtrada 1.000 μl Punta de una pipeta dentro de la pipeta de boca con un tubo capilar conectado. Llama esterilizar el tubo capilar y crear una curva en el tubo para la facilidad de uso. Utilizan el tubo capilar para transferir cogollos a la segunda solución fría dispase bien contiene por 2 min antes de transferir al tercer pozo con PBS limpio (figura 1G).
Nota: Durante la transferencia de los brotes del dispase a PBS, evite tocar el tejido de la punta del tubo capilar. Si el tejido se atasca en la punta del tubo, pipetear arriba y abajo o agite en la solución de PBS limpiarla hasta que afloja. - Pipetear los brotes hacia arriba y hacia abajo y traslado a la cuarta bien con PBS limpio. Por último, utilizando la transferencia del dispositivo capilar brotes al tubo de 1,5 mL con 0.05% tripsina. Coloque el tubo en la coctelera de 37 oC precalentado y agitar a 1.500 rpm durante 4 minutos.
- Vortex para aproximadamente 10 s inmediatamente Coloque el tubo en una centrifugadora y centrifugado durante 5 minutos a 200 g. Quite todo pero aproximadamente 50 μl de solución con cautela para no molestar las células centrifugadas (figura 1G).
- Lugar filtrada 1.000 μl Punta de una pipeta dentro de la pipeta de boca con un tubo capilar conectado. Llama esterilizar el tubo capilar y crear una curva en el tubo para la facilidad de uso. Utilizan el tubo capilar para transferir cogollos a la segunda solución fría dispase bien contiene por 2 min antes de transferir al tercer pozo con PBS limpio (figura 1G).
2. cultivo de progenitores disociados para formar Pancreatoids
Nota: Lo siguiente debe realizarse en un ambiente estéril en una campana de cultivo de tejidos estándar, empleando los procedimientos estándar estériles.
- De cada yema recogido, añadir 400 μL organogénesis medios16,17 (tabla 1) a las células centrifugadas. Vórtice de pulso tres veces y bien placa de placa 100 μl por pozo de una fijación baja 96, División de brotes en una proporción de 1:4 (figura 1G).
- Ver bajo el microscopio visualizar disocia las células flotan libremente (figura 1H). Coloque la placa de cultivo en un incubador de 37 oC con 5% CO2 en un eje de balancín a velocidad media.
- Supervisar el progreso de pancreatoids diariamente. Reemplazar con 100 μl de frescos medios cada 3 días, Pipetear cuidadosamente bajo control microscópico en la campana para quitar dejando pancreatoid en el pozo. Alternativamente, fresco 100 μl de los medios de comunicación pueden agregarse a un nuevo pozo y pancreatoid transferidos usando el tubo capilar de borosilicato atado pipeta de boca y 1000 μl filtrado punta de pipeta.
3. proceso Pancreatoids para la proyección de imagen inmunofluorescente
- Para procesar pancreatoids para imágenes de inmunofluorescencia, en primer lugar preparar 4% paraformaldehido/PBS, solución pH7.4 (PFA). Colocar 50 μl de PFA en pozos de una 96 placa bien el 4%.
- Utilizando los tubos de borosilicato al capilar y pipeta de boca con la punta de filtrado pipeta de 1000 μl, transferencia pancreatoids de teniendo medios tan poco como sea posible en el pozo fresco con 4% de medio de cultivo PDA. Situado en el eje de balancín a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Pancreatoids de transferencia de 4% rock PFA en un pozo con 100 μl de PBS fresco, a temperatura ambiente durante 5-10 min Repita para un total de tres frescos lavados de PBS.
Nota: El protocolo se puede pausarse aquí, con pancreatoids almacenados en 100 μl de PBS a 4 oC durante hasta una semana.
- Para la proyección de imagen de wholemount (recomendado si los anticuerpos son adecuado, la alternativa en la sección 3.3. microscopia en 3.4 y.), transferencia de PBS en el suero de 5% burro de 50 μl de PBS 1 x con 0,1% detergente no iónico (SAFT) al bloque. Rock toda la noche a 4 oC o 4 h a temperatura ambiente.
- Transferencia de pancreatoids a un nuevo pozo que contiene anticuerpos primarios diluidos en 50 μl de suero 5% burro en 1 x PBST. Óptimamente, roca durante 24 h a 4 oC (menos de 12 h pero hasta 36 h).
Nota: Anticuerpos indicadas en la Tabla de materiales contra Chga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) y Pdx1 (1: 100) son adecuados para la tinción de wholemount; otros anticuerpos pueden requerir optimización. - Transferencia de pancreatoids a un pozo con 100 μl de SAFT fresca para lavar y rock durante 30 min a temperatura ambiente. Repita este paso para un total de tres frescos lavados de SAFT.
- Transferencia de pancreatoids a un nuevo pozo que contiene anticuerpos contra secundario diluido en 50 μl de suero 5% burro en 1 x PBST. Proteja la placa de la luz y en 4 oC, mecedora para óptimo 24 h (por lo menos 12 h pero hasta 36 h).
Nota: Todos los anticuerpos secundarios enumerados en la Tabla de materiales y DAPI contratinción nuclear son adecuados para la tinción de wholemount. - Transferencia de pancreatoids a un nuevo pozo con 100 μl de 1 x Saft y roca a temperatura ambiente durante 30 minutos Repita para un total de tres lavados en 1 x PBST. En el tercer y último lavado, agregar 300 nM DAPI.
- Por último, coloque 100 μl de PBS y conservar a 4 oC protegido de la luz por hasta una semana antes de la proyección de imagen por microscopía confocal, aunque los mejores resultados provienen de la proyección de imagen inmediatamente después de la tinción. Para evitar el movimiento de pancreatoids durante la proyección de imagen, pero evitar que se sequen, coloque cada pancreatoid en una gota de 20 μl de PBS. Si pancreatoids no permanecen aún, reducir el volumen de PBS.
- Transferencia de pancreatoids a un nuevo pozo que contiene anticuerpos primarios diluidos en 50 μl de suero 5% burro en 1 x PBST. Óptimamente, roca durante 24 h a 4 oC (menos de 12 h pero hasta 36 h).
- Para secciones congeladas, transferencia pancreatoids de PBS en solución de sacarosa de 30% durante la noche a 4 oC.
- Añadir medio de inclusión en una burbuja debajo de un microscopio de disección. Utilizando fórceps bajo control microscópico, poner en remojo pancreatoids empujando suavemente a través de los medios de comunicación empotrar varias veces para eliminar la sacarosa residual antes de transferir a un bloque de tejido con medio congelado de inclusión.
- Coloque el bloque de tejido en hielo seco hasta que congelado y la sección en el criostato a 8 μm.
Nota: Las secciones pueden almacenarse a-80 oC o immunostained inmediatamente. - Permiten que las secciones de-80 oC se descongele a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos hasta que se seque. Dibujar una barrera hidrofóbica al usar el lápiz hidrofóbico pap en el tejido y el bloque utilizando suero de burro 5% diluido en 1 x PBST por 30 min a temperatura ambiente.
- Quitar los medios de comunicación y reemplace inmediatamente con anticuerpos primarios diluidos en suero de burro 5% diluido en 1 x SAFT durante la noche a 4 oC.
- La principal solución de quitar y lavar los tejidos tres veces con 1 x PBST de 10 minutos cada uno. A continuación, agregue una solución de anticuerpo secundario diluido en suero de burro 5% diluido en 1 x PBST por 1 h a temperatura ambiente y proteja los portaobjetos de la luz.
- Retirar la solución secundaria y lavar portaobjetos tres veces en 1 x PBST de 10 minutos cada uno. En el último lavado, agregar 300 nM DAPI.
- Quitar los medios de comunicación y agregar medios de montaje y un cubreobjetos. Tienda se desliza lejos de la luz en 4 oC hasta que esté listo a la imagen.
4. aislamiento de ARN de Pancreatoids para el análisis de la transcripción
- Recoger pancreatoids con capilar de borosilicato unido a una pipeta de boca con un filtrado 1.000 μl Punta de pipeta para esterilidad y lugar en 500 μl de solución de ácido Guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo en un tubo de 1,5 mL. Almacenar a-80 oC o proceder de inmediato al aislamiento de RNA.
- Para el aislamiento de RNA, descongelar las muestras en hielo si es necesario y añadir 100 μl de cloroformo. Mezclar bien y lugar en 4 oC por 15 minutos pre-enfriarán una centrifugadora a 4 oC.
- Colocar tubos en la centrífuga y vuelta por 20 min a 12.000 g a 4 oC.
- Retire con cuidado los tubos para no molestar a la separación de las capas. Usando una pipeta μl 200, recoge la solución acuosa clara y colocar en un tubo nuevo de 1.5 mL, dejando una pequeña cantidad al búfer de la capa de la proteína blanco y rosa capa de ADN. No toque la punta de la pipeta a nada en este proceso y no toque las paredes del tubo de 1,5 mL.
- Añadir 500 μl de isopropanol 100% a tubo nuevo que contiene la capa acuosa y vortex. Deje reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos, más tiempo en el hielo, o para dejar de precipitación máxima durante la noche a-20 oC.
- Centrifugar a 12.000 g durante 15 min a 4 oC para el RNA de la pelotilla. Remover el isopropanol sin perturbar el pellet.
Nota: Como pancreatoids son pequeñas, es probable que la pastilla no será visible. - Frío, añadir etanol al 75% e invertir el tubo varias veces. En la centrifugadora y la vuelta a 9.000 x g por 10 min a 4 oC. eliminar el etanol y centrifugado por 2 min a 9.000 x g.
- Utilice una pipeta de 200 μL para eliminar cualquier resto etanol en el tubo, sin contacto con la región en que la pelotilla reside. Deje la tapa abierta en el tubo durante 5-10 min a temperatura ambiente para asegurar la evaporación de etanol residual.
- Resuspender el precipitado en todo con un vórtex en 20 μl de agua libre de nucleasa.
Opcional: Calor del RNA a 65 oC por 3 minutos e inmediatamente volver al hielo. RNA puede ser almacenado a-80 oC o inmediatamente utilizado para transcripción reversa y qPCR.
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Representative Results
Disección cuidadosa de embriones de ratón en e10.5 desde el cuerno uterino debe producir embriones indemnes en PBS para más la disección (figura 1A). El tracto gastrointestinal puede eliminarse eficientemente del embrión (figura 1B), que permite el discernimiento del brote pancreático dorsal en la ensambladura del intestino y el estómago (figura 1C-F). Previamente se ha caracterizado el brote pancreático e10.5; progenitores deben expresar Pdx1, Sox9, Ptf1a y Hes120,21,22,23. Siguiendo los pasos del proceso de tejido, disociadas pancreáticas células individuales o pequeños grupos de células se pueden visualizar por microscopía de luz (figura 1G-H).
En medio de la organogénesis, estas células flotan libremente, libre de andamios uno mismo-montan y organizan en pancreatoids tridimensional que crecen y persisten durante al menos diez días en cultivo (figura 2A). Los pancreatoids tienen similitudes morfológicas con el páncreas en vivo , con ramificación morfogénesis que ocurre. Usando ratones transgénicos, diferentes tipos de células o procesos pueden ser monitoreados en tiempo real. Por ejemplo, utilizando Ins1-eGFP24 ratones con motivo de la formación de las células endocrinas de la beta, pancreatoids puede ser reflejada a diario para visualizar el desarrollo de las células beta (figura 2B). Además, por alterar las condiciones de cultivo, adición de pequeñas moléculas, drogas o manipulando el genoma, no sólo puede evaluarse la determinación del destino celular pero también se pueden investigar los cambios en la estructura y morfología. A continuación os mostramos la aplicación de la proteína quinasa C activador forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a concentraciones altas (160 nM), que altera la morfología del desarrollo de pancreatoids, lo que libremente asociados a las células epiteliales y aumento de ramificación 19 (figura 2C).
Para evaluar la Asociación del tejido pancreático de mesénquima con células epiteliales pancreáticas, inmunotinción puede realizarse para los marcadores de cada tejido. Immunostaining del marcador de conducto, DBA25,26, con un marcador endocrino, Chga27y núcleos marcados por DAPI revelan multilineal formación en pancreatoids (figura 3A). Un marcador de mesénquima, Vimentin, co teñidas con un marcador de progenitoras pancreáticas (e9.0 a aproximadamente e15.5) Pdx1, muestra que el mesénquima envuelve el pancreatoid (figura 3B). Inmunotinción puede utilizarse también para examinar la morfología, con estructuras de ramificación reveladoras Pdx1, así como marcadores de diferentes tipos de células de interés. En la figura 3C, visualizamos célula beta desarrollo de coloración para el marcador epitelial Pdx1 y el marcador de la célula beta pulg usando análisis de qPCR, transcripciones de progenitores y diferenciando las células un evaluarse, tales como los genes del progenitor Pdx1 y Hes1 y marcadores diferenciados Prss1 Prss3 Hnf6, Isl1, Nkx6-1 y Ins1 (figura 4).
Figura 1: esquema de la disección, disociación y galjanoplastia de e10.5 progenitores pancreáticos para la generación de pancreatoid. (A) la imagen trasmitida de embriones e10.5. (B) el esquema de procedimiento de la disección, a partir de la parte superior izquierda. El rojo, las líneas punteadas indican regiones de cortar, mientras que la zona verde es el tracto gastrointestinal. En primer lugar, la cabeza se retira seguida por la eliminación de los brotes del miembro anterior y la apertura de la parte del organismo. (C) el tracto gastrointestinal es cuidadosamente eliminado, con los brotes de corazón y hígado que sobresale de la región ventral de la zona. El estómago, el brote pancreático dorsal y el intestino se pueden visualizar, como se muestra en la imagen trasmitida. (D) eliminación del corazón y de hígado brotes. Esquema es el de la izquierda y la imagen trasmitida está a la derecha. (E) pellizcando el tejido alrededor del brote pancreático dorsal para exponer la yema para la disección. Esquema es el de la izquierda y la imagen trasmitida está a la derecha. (F) del tracto gastrointestinal con el brote pancreático dorsal bajo microscopía brightfield. En la imagen de la izquierda, la curva en el intestino es visible, donde pueden colocar fórceps cuando extraer el tracto gastrointestinal de la región espinal. A la derecha, la imagen trasmitida de alta magnificación muestra las yemas pancreáticas dorsales y ventrales. (G) remoción del brote pancreático dorsal y procesamiento del tejido antes de la disociación, resuspensión en medio de la organogénesis y la galjanoplastia. (H) la imagen trasmitida muestra células disociadas inmediatamente después de la galjanoplastia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Control de pancreatoids con el tiempo. (A) Brightfield imágenes de pancreatoids en día 1, día 2 y día 3. Barras de escala = 100 um. (B) manipulación de las condiciones de cultivo para investigar morfogénesis pancreática. Aquí, la adición de altos niveles de PMA conduce a aflojado estructura epitelial y mayor ramificación, como visualizar por microscopía de campo luminoso en el día 1 y 2. Barras de escala = 100 μm. (C) Ins1-eGFP ratón pancreatoids en día 4, día 5, día 6, día 7 y día 9, con el desarrollo de las células beta indicado por eGFP en verde. Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Inmunotinción de pancreatoids. (A) Immunostaining pancreatoid en día 5 para marcar conductos de DBA en células rojas, endocrinas por Chga en verde y núcleos marcados por DAPI en azul. (B) Immunostaining pancreatoid en el día 7 con motivo de mesénquima por vimentina en progenitores rojos y pancreáticos por Pdx1 en verde. (B) Immunostaining pancreatoid en día 7 para marcar las células beta por insulina en progenitores rojos y pancreáticos por Pdx1 en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Análisis de la transcripción. PCR cuantitativa de pancreatoids día 7 para los marcadores de progenitores y células diferenciadoras. Se presenta la comparación en vivo tejido murino en Scavuzzo et al. (2017). resultados se normalizan para Gapdh. N = 2, las barras de escala son SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componente | Abreviatura | Concentración final |
| Penicilina-estreptomicina | P/S | 1% |
| Suplemento de los medios de comunicación libres de FBS | 10% | |
| Beta-mercaptoetanol | bME | 0,1 mM |
| Forbol 12-miristato 13-acetato | PMA | 16 nM |
| Inhibidor de la Y-27632 o ROCK | RI | 10 uM |
| Factor de crecimiento epidérmico | EGF | 25 ng/mL |
| R-Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| ácido factor de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento fibroblástico 1 | FGFa, FGF1 | 25 ug/mL |
| Sal de sodio de la heparina | Heparina | 2 U/mL |
| Factor de crecimiento fibroblástico 10 | FGF10 | 100 ng/mL |
| Dulbecco modificado Eagle mezcla medio/nutrientes F-12 | DMEM/F12 | a 5 mL |
Tabla 1. Medios de organogénesis.
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Discussion
La progresión de los modelos de cultura de célula es fundamental para desarrollo de modelos de correctamente, producir tipos de células clínicamente relevantes, prueba de eficacia de los medicamentos o incluso trasplante a los pacientes. Sin embargo, recapitulando artificialmente el desarrollo en un plato es todo un reto ya que estamos todavía lejos de comprender los mecanismos de la organogénesis y la fisiología en vivo. Así en vitro de las células son ineficaz generado, no completamente funcional, incapaz de mantener por largos períodos de tiempo, u otras anormalidades de las células comparables en el cuerpo del puerto. Esto es porque muchos diferentes tipos de células interactúan mientras que ocurren complejos cambios morfogenéticos para influir el desarrollo y la fisiología. Obtener una comprensión de cómo el desarrollo ingresos combinando la conveniencia de in vitro sistemas conservando la complejidad del desarrollo en vivo serían impartir una herramienta valiosa para la investigación biomédica.
El desarrollo de organoides es una vía prometedora hacia las complejidades del desarrollo de modelado. En este protocolo, describiremos cómo hacer organitas pancreático, llamado pancreatoids, que conservan mesénquima nativo y robusta generar células endocrinas, aunque pancreatoids no exhiben la capacidad de respuesta de la glucosa. Esta herramienta puede utilizarse para investigar los mecanismos de desarrollo, así como funcionalidad en un sistema de cultivo que mantiene la heterogeneidad del tejido encontrado en vivo. Además, esto puede usarse para pantallas genéticas o pantalla pequeñas moléculas o fármacos. Esto es particularmente interesante, como prueba fármacos candidatos en sistemas de cultivo celular relativamente homogénea pueden eludir efectos de estos compuestos en otros tipos de células estrechamente relacionados.
Hay varios pasos críticos durante este protocolo. En primer lugar, eliminar los embriones del útero es importante como tirando con fuerza los embriones puede rasgar la región abdominal y hacen difícil discernir el tracto gastrointestinal para obtener la yema pancreática (paso 1.3). En segundo lugar, limpia la disección de la yema pancreática en el tracto gastrointestinal es crítica, como tomar exceso de tejido puede conducir a la diferenciación de otros tipos de células (paso 1.4.4). Para ello, es importante pellizcar debajo de la yema pancreática y levantar el tejido de superposición antes de aislar el brote pancreático. Por último, cuando regresen los brotes de la dispase en el PBS para lavar, es imprescindible usar un tubo capilar de borosilicato y no que el tejido de contacto con el borde de la abertura del tubo, de lo contrario, el tejido se pegue a la punta del tubo (paso 1.5.1). Para evitar esto, comenzar solución pipetas de boca antes de pasar hacia la yema, permitiendo que la yema ir en el tubo y no en el exterior.
Este método permite la formación de las células endocrinas en un pancreatoid 3D, sin embargo, la ramificación epitelial es más limitada que otros protocolos existentes16,17. Además, mientras que la forma de células endocrinas productoras de insulina, no exhiben capacidad de respuesta de la glucosa. Por lo tanto, más investigación sobre la maduración de estas células proporcionará información valiosa tanto en la generación de pancreatoids funcional, así como al campo de la generación de células beta en general.
La generación de pancreatoids que desarrollan las células endocrinas, y en el futuro, que obtener respuesta de la glucosa, tiene implicaciones potenciales para el tratamiento de la diabetes. La diabetes es un candidato ideal para la terapia regenerativa, las células beta pancreáticas son perdidas o disfuncional y reemplazar estas células potencialmente puede aliviar las complicaciones de la enfermedad. Se ha avanzado en el distinción de hPSCs en las células beta, sin embargo, en la diabetes, a menudo hay disfunciones a otros tipos de células en el páncreas y las células beta, incluyendo las células alfa o células acinares28,29, 3031,de,32. Por lo tanto, generar nuevo tejido pancreático para el trasplante puede reemplazar completamente el tejido afligido. Con la investigación adicional de murino pancreatoid formación y el funcionamiento, la trayectoria del desarrollo se puede mímico para generar humano pancreatoids de hPSCs. Estos pancreatoids humanos puede utilizarse para la medicina personalizada a la pantalla de sensibilidad a los medicamentos en un contexto específico para cada paciente y para terapia regenerativa.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Jolanta Chmielowiec útil discusión sobre el protocolo y el manuscrito. También agradecemos a Benjamin Arenkiel acceso al microscopio confocal. Este trabajo fue financiado por los NIH (P30-DK079638 a m) y T32HL092332-13 de M.A.S. y M.B., la Fundación médica de McNair (a m) y el núcleo confocal en el BCM intelectual y discapacidades del desarrollo investigación centro (NIH U54 HD083092 de la Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
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