Summary
Qui, presentiamo un protocollo per generare insulina esprimendo 3D pancreatoids murino da progenitori pancreatici e 10.5 digalleggiante dissociato e mesenchima associato.
Abstract
Il pancreas è che un organo complesso composto di molti diversi tipi di cellule che lavorano insieme per regolare la digestione e l'omeostasi del glucosio di anima. Questi tipi di cellule includono enzima-secrezione delle cellule acinose, un sistema duttale arborized responsabile del trasporto degli enzimi per le cellule endocrine dell'intestino e producono ormoni.
Beta-cellule endocrine sono il tipo di suola delle cellule nel corpo che producono l'insulina per abbassare i livelli di glucosio nel sangue. Diabete, una malattia caratterizzata da una perdita o la disfunzione delle cellule beta, sta raggiungendo proporzioni epidemiche. Quindi, è essenziale stabilire protocolli per studiare lo sviluppo della beta-cellula che può essere utilizzato ai fini dello screening per derivare la droga e le terapie basate su cellule. Mentre l'indagine sperimentale del mouse sviluppo è essenziale, in vivo gli studi sono laboriosa e che richiede tempo. Cellule coltivate forniscono una piattaforma più conveniente per lo screening; Tuttavia, essi sono in grado di mantenere la diversità cellulare, organizzazione architettonica e interazioni cellulari trovati in vivo. Quindi, è essenziale per sviluppare nuovi strumenti per studiare la fisiologia e l'organogenesi pancreatica.
Cellule epiteliali pancreatiche si sviluppano in stretta associazione con mesenchima fin dall'inizio dell'organogenesi come cellule organizzano e si differenziano nell'organo adulto complesso, fisiologicamente competente. Il mesenchima pancreatico fornisce segnali importanti per lo sviluppo del sistema endocrino, molti dei quali non sono buono capiti ancora, così difficile ricapitolare durante la coltura in vitro . Qui, descriviamo un protocollo alla cultura del mouse complesso tridimensionale, cellulare organoids che conservano mesenchima, chiamato pancreatoids. Il germoglio pancreatico murino e 10.5 è sezionato, dissociato e coltivato in un ambiente senza impalcatura. Questi galleggianti cellule assemblarsi con mesenchima avvolgente il pancreatoid in via di sviluppo e un robusto numero delle beta-cellule endocrine, sviluppando insieme l'acinose e cellule del condotto. Questo sistema può essere utilizzato per studiare le interazioni cellula-cellula cellula determinazione di destino, organizzazione strutturale e morfogenesi, durante l'organogenesi, o per la droga, piccola molecola o screening genetico.
Introduction
Delineare i meccanismi dello sviluppo normale e la fisiologia è fondamentale per capire l'eziologia di malattia e coltivare in ultima analisi, metodi di trattamento. Mentre la coltura e la differenziazione delle cellule staminali permette analisi di alto-rendimento e veloce di sviluppo, è limitata dal corpo esistente di conoscenza dei meccanismi che regolano il destino delle cellule e artificialmente ricapitola lo sviluppo in un relativamente omogenea, bidimensionale stato1,2. Non solo è in vivo sviluppo influenzato dai fattori estrinseci, con diversi tipi di cellule nella nicchia e milieu fornendo segnali paracrini e supporto organizzativo per guidare l'organogenesi, ma la funzione di queste cellule si basa anche sulla loro dintorni per orientamento3,4,5. Dato l'importanza di queste indicazioni esterne, le limitazioni dei protocolli di differenziazione e la natura laboriosa di in vivo modelli murini, nuovi sistemi sono necessari studiare sperimentalmente fisiologia e processi di base inerente allo sviluppo.
L'emersione dei protocolli per generare organoids tridimensionale, complesso fornisce un sistema conveniente e congruo per studiare l'organogenesi, la fisiologia, l'efficacia dei farmaci e anche patogenesi. Che istituisce organoids murino per diversi sistemi come lo stomaco6 e intestino7 hanno ampliato la nostra comprensione dell'organogenesi, fornendo uno strumento per studiare la complessità inerente allo sviluppo con meno restrizioni rispetto a vivo e modelli in vitro . A causa di questi avanzamenti nella murino organoid formazione e l'avvento di pluripotenti umane derivano cellule, intestinale umano8, retinica9, renale10,11, e cerebrale12 organoids sono state prodotte e questo repertorio è limitato solo dalla conoscenza esistente per quanto riguarda i meccanismi di sviluppo.
Di particolare interesse è la generazione dei organoids del pancreas, come una miriade di malattie affligge tipi differenti delle cellule del pancreas, compreso le cellule acinose e condotti in insufficienza pancreatica exocrine13, cellule acinose in pancreatite14, e cellule beta nel diabete15. Acquisire conoscenze relative allo sviluppo di questi tipi differenti delle cellule potrebbe aiutare a comprendere la loro patologia e può, inoltre, agire come una piattaforma per lo screening di stupefacenti personalizzati o trapianto. In precedenza, Greggio et al ha sviluppato un metodo per creare organoids pancreatico murino che ricapitolare in vivo morfogenesi e sviluppare strutture organizzate, tridimensionale, complesse composte da tutti i principali delle cellule epiteliali del pancreas tipi di16,17. Si tratta di un importante passo avanti nel campo del pancreas, soprattutto come fare le cellule in vitro possibile attivare indagini biologiche dello sviluppo della cellula beta. Tuttavia, una scarsità di cellule endocrine formata in questo protocollo, a meno che il organoids sono stati trapiantati in tessuto, dove la nicchia potrebbe interagire e fornire spunti didattici17. Il mesenchima costituisce la più grande parte della nicchia, pesantemente avvolgente dell'epitelio in via di sviluppo dalle fasi iniziali dell'organogenesi a fasi successive, tra cui endocrino delaminazione e differenziazione3,4, 18. L'interazione del mesenchyme con il pancreas in via di sviluppo è l'ennesimo esempio di segnalazione estrinseca e l'importanza di mantenere in vivo cellulare complessità per studiare l'organogenesi.
Qui, descriviamo come generare tridimensionale organoids pancreatico, chiamato pancreatoids, da progenitori pancreatico murino dissociate e 10.5. Questi pancreatoids conservare mesenchima nativo, auto-assemblarsi in condizioni di libero di fluttuare e generare tutti i tipi principali delle cellule del pancreas, compreso un robusto numero di cellule endocrine beta19. Questo approccio è più adatto per l'analisi dello sviluppo endocrino, come protocolli precedenti mancano robusta differenziazione endocrina. Tuttavia, utilizzando il protocollo per organoids pancreatico come descritto da Greggio et al è più adatto per analisi di ramificazione epiteliale del pancreas e morfogenesi, come ramificazione è più limitato a pancreatoids.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo metodo sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato del Baylor College of Medicine.
1. preparazione del Mouse giorno embrionale 10.5 progenitori del pancreas
Nota: Questo protocollo non ha bisogno di essere seguiti in condizioni sterili fino al passaggio 2, tuttavia è ottima per sterilizzare strumenti di dissezione e spruzzare prima di etanolo al 70% di utilizzare.
- Per impostare per dissezione, riempire un secchio di ghiaccio e posizionare un contenitore di tampone fosfato salino (PBS) nel ghiaccio. Pulire due pinze a punta fine e forbici per dissezione con etanolo al 70%. Situato vicino alla zona di dissezione, un contenitore con almeno tre borosilicato capillare tubi, una pipetta di bocca, un accendino e filtrata puntali per pipette 1.000 µ l.
- Preparare almeno 1 mL di dispase freddo di 1,25 mg/mL diluito in acqua sterilizzata e posto nel secondo pozzetto di una piastra ben 12 su ghiaccio. Mettere PBS nel primo, terzo e quarto pozzi del 12 ben piatto. Posizionare 1 mL di 0.05% tripsina in un 1,5 mL tubo sul ghiaccio. Pre-riscaldare un agitazione incubatore a 37 oC.
- Eutanasia e 10.5 topi temporizzato-incinta conformemente agli orientamenti IACUC. Spruzzare l'addome con etanolo al 70% per pulire la regione prima di effettuare un'incisione a forma di V nella zona genitale del mouse con delle forbici, pinze e continuarlo fino a diaframma.
Nota: L'aspetto di un plug vaginale in questo protocollo indica giorno 0,5. Utilizzando 5 - 6-settimana-vecchi topi, un aumento di peso di più di 2 g agisce come misura secondaria di impregnazione di successo.- Con attenzione asportare l'utero praticando un'incisione le porzioni superiore e laterale dell'utero, tirando l'organo verso l'alto dal mouse e a seguito di questa incisione verso la regione genitale prima di ripetere sul lato opposto. Posto in un 10cm Petri con il PBS freddo.
Nota: È possibile ottenere organoids da cellule e11.5 dissociato, tuttavia a differenza del pancreatoids e 10.5, questi organoids non sono ancora caratterizzate e così non possono mantenere la capacità di differenziarsi in tutti i tre lignaggi principali del pancreas.
- Con attenzione asportare l'utero praticando un'incisione le porzioni superiore e laterale dell'utero, tirando l'organo verso l'alto dal mouse e a seguito di questa incisione verso la regione genitale prima di ripetere sul lato opposto. Posto in un 10cm Petri con il PBS freddo.
- Sotto un microscopio chiaro dissezione, collocare la capsula di Petri e aprire con cautela il tessuto uterino posizionando due pinze tra ciascun embrione e peeling tessuto lontano il sacco vitellino. Trasferire gli embrioni afferrando il sacco vitellino delicatamente con forcipe e posto in un 10cm Petri con fresco, PBS freddo. Mettere la capsula di Petri sul ghiaccio.
Nota: È importante rimuovere heedfully embrioni, preferibilmente mantenuti entro il sacco vitellino, come rimozione forzata può tirare il cordone ombelicale, lo strappo dei tessuti dell'embrione e compromettere l'integrità strutturale. - Posto più PBS gocce su un coperchio di scatola di Petri di 10 cm. Utilizzare queste goccioline per trasferire l'embrione durante la dissezione come tessuti extraembryonic vengono rimossi per assicurare la visibilità. Trasferire un embrione a una goccia di PBS e rimuovere delicatamente dal sacco vitellino usando il forcipe, mentre i rimanenti embrioni soggiorno in PBS su ghiaccio (Figura 1A). Rimuovere la testina prima di spostare l'embrione di un nuovo calo di PBS utilizzando forcipe a scoop leggermente l'embrione, a non danneggiare il tessuto (Figura 1B).
Nota: Il tessuto potrebbe essere necessario essere trasferiti più frequentemente alle goccioline di PBS fresche rispetto a quelli descritti qui, a seconda l'opacità del liquido.- Una nuova caduta di PBS, rimuovere i germogli di zampa anteriore usando il forcipe (Figura 1B). Collocare la pinza nell'apertura dove era presente di arto e delicatamente strappare solo il tessuto più esterno anteriormente (Figura 1B). Ruotare l'embrione e ripetere in direzione posteriore, fermandosi sul nascere hindlimb. A questo punto, il tratto gastrointestinale dovrebbe essere visibile (Figura 1B).
- La regione posteriore del tratto gastrointestinale ha una leggera curva (Figura 1F). Inserire la pinza dietro questa curva nell'apertura tra il tratto gastrointestinale e la regione spinale della parete del corpo. Staccare il tratto gastrointestinale, lavorando lentamente verso l'alto fino a raggiungere la regione più anteriore dove la regione cardiaca si connette (Figura 1B-E).
FACOLTATIVO: Rimuovere il cuore primordiale e le gemme del fegato dalle regioni ventrali del tratto gastrointestinale, lasciando solo il tubo continuo dell'intestino. Le prime volte che viene eseguito questo protocollo potrebbe essere più facile lasciare il cuore e il fegato come punti di riferimento ventrale fino la morfologia del tratto gastrointestinale e il germoglio pancreatico dorsale sono più familiare (Figura 1C e D ). - Trasferire il tratto gastrointestinale la gocciolina di PBS.
- Prendere il forcipe e pizzicare delicatamente il tessuto sotto il germoglio sporgente e l'intestino e sollevare leggermente il tessuto esterno fuori (Figura 1D-F).
Nota: Il germoglio pancreatico dorsale si trova tra lo stomaco e l'intestino (Figura 1C-G). Il germoglio pancreatico sotto dovrebbe apparire come una struttura rotonda, tassellata (Figura 1G). - Collocare la pinza dove il germoglio si connette per l'intestino e pizzico verso l'alto per allentare il germoglio (Figura 1G). Lavare una volta in una nuova bolla di PBS prima del trasferimento sul nascere nel primo pozzetto della piastra ben 12 in PBS freddo sul ghiaccio. Ripetere fino a quando tutti i germogli sono raccolti dagli embrioni e collocati nel primo pozzetto della piastra ben 12.
- Mettere il piatto ben 12 sotto il microscopio di dissezione luce. Contare il numero di gemme pancreatici con successo sezionati per poi calcolare il rapporto di divisione.
- Posto un filtrato 1.000 puntale µ l nella pipetta bocca con un tubo capillare associata. Fiamma sterilizzare il tubo capillare e creare una curva del tubo per la facilità d'uso. Utilizzare il capillare per trasferire i germogli per la seconda soluzione contenente dispase freddo per 2 min prima del trasferimento al terzo pozzo con il PBS pulito (Figura 1G).
Nota: Durante il trasferimento germogli da dispase PBS, evitare di toccare il tessuto fino alla punta del capillare. Se il tessuto si incastra sulla punta del tubo, pipettare su e giù o agitare nella soluzione PBS pulita fino a quando allentato. - Pipettare germogli su e giù e trasferire al quarto pozzo con PBS pulito. Infine, utilizzando il trasferimento capillare periferica germogli per la provetta da 1,5 mL con 0,05% tripsina. Collocare la provetta nel pre-riscaldato 37 oC shaker e agitare a 1.500 giri/min per 4 min.
- Vortex per circa 10 s, quindi, inserire immediatamente il tubo in una centrifuga e spin per 5 min a 200 g. Togliere tutto ma circa 50 µ l di soluzione con cautela per non disturbare le cellule centrifugate (Figura 1G).
- Posto un filtrato 1.000 puntale µ l nella pipetta bocca con un tubo capillare associata. Fiamma sterilizzare il tubo capillare e creare una curva del tubo per la facilità d'uso. Utilizzare il capillare per trasferire i germogli per la seconda soluzione contenente dispase freddo per 2 min prima del trasferimento al terzo pozzo con il PBS pulito (Figura 1G).
2. coltura dissociati progenitori per formare Pancreatoids
Nota: Il seguente deve essere eseguito in un ambiente sterile in un cappuccio di coltura del tessuto standard, utilizzando le procedure sterili standard.
- Per ogni gemma raccolto, aggiungere 400 µ l organogenesi media16,17 (tabella 1) le cellule centrifugate. Vortice di impulso tre volte e piastra 100 µ l di un attacco basso 96 ben piatto, spaccare gustative in un rapporto di 1:4 (Figura 1G).
- Controllare al microscopio per visualizzare dissociato cellule galleggiano liberamente (Figura 1H). Posizionare la piastra di coltura in un incubatore a 37 oC con 5% CO2 su un agitatore meccanico a media velocità.
- Monitorare lo stato di pancreatoids al giorno. Sostituire con 100 µ l di media fresca ogni 3 giorni, attentamente pipettaggio media sotto controllo microscopico nella cappa di rimuovere lasciando pancreatoid nel pozzo. In alternativa, fresca 100 µ l di media può essere aggiunto a un nuovo pozzo e pancreatoid trasferiti utilizzando il tubo capillare di borosilicato collegato a bocca pipetta e 1000 µ l filtrata punta della pipetta.
3. il trattamento Pancreatoids per l'Imaging immunofluorescente
- Per elaborare pancreatoids per immagini immunofluorescenti, innanzitutto preparare 4% paraformaldeide/PBS, soluzione pH7.4 (PFA). Mettere 50 µ l di PFA in pozzi di un 96 piastra ben il 4%.
- Utilizzando i tubi capillari borosilicato e pipetta in bocca con la punta della pipetta filtrata 1.000 µ l, trasferimento pancreatoids da terreno di coltura tenendo il pozzo fresco con 4% mezzi come piccoli come possibile PFA. Impostare il rocker a temperatura ambiente per 15 min.
- Trasferimento di pancreatoids da 4% roccia PFA in un pozzo con 100 µ l di PBS fresco, a temperatura ambiente per 5-10 min ripetere per un totale di tre lavaggi di PBS freschi.
Nota: Il protocollo può essere sospesa qui, con pancreatoids memorizzati in 100 µ l di PBS a 4 oC fino ad una settimana.
- Per l'imaging di wholemount (consigliato se gli anticorpi sono approccio alternativo adatto nella sezione 3.3. e microscopia in 3.4.), trasferimento da PBS in 50 µ l di siero di 5% asino in 1X PBS con 0,1% detergente non ionico (PBST) al blocco. Rock tutta la notte a 4 oC o in alternativa per 4 h a temperatura ambiente.
- Trasferimento pancreatoids a un nuovo pozzo che contiene gli anticorpi primari diluiti in 50 µ l di siero di 5% asino in 1 x PBST. In modo ottimale, roccia per 24 h a 4 oC (almeno 12 h ma fino a 36 h).
Nota: Gli anticorpi elencati nella Tabella materiali contro Chitaga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) e Pdx1 (1: 100) sono adatti per la colorazione del wholemount; altri anticorpi possono richiedere ottimizzazione. - Trasferimento pancreatoids ad un pozzo che contiene 100 µ l di PBST fresca per lavare e rock per 30 min a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio per un totale di tre lavaggi PBST freschi.
- Trasferimento pancreatoids a un nuovo pozzo contenente anticorpi secondari diluiti in 50 µ l di siero di 5% asino in 1 x PBST. Proteggere la piastra dalla luce e posto in 4 oC, a dondolo per in modo ottimale 24 h (almeno 12 h ma fino a 36 h).
Nota: Tutti gli anticorpi secondari elencati nella Tabella materiali e DAPI controcolorazione nucleare sono adatti per la colorazione del wholemount. - Trasferimento pancreatoids a un nuovo pozzo che contiene 100 µ l di 1x PBST e roccia a temperatura ambiente per 30 min. Ripetere per un totale di tre lavaggi in 1 x PBST. Nel terzo e ultimo lavaggio, aggiungere 300 nM DAPI.
- Infine, inserire in 100 µ l di PBS pulito e conservare a 4 oC al riparo dalla luce per fino ad una settimana prima dell'imaging mediante microscopia confocale, sebbene i migliori risultati provengono da formazione immagine immediatamente dopo la colorazione. Per impedire il movimento di pancreatoids durante la formazione immagine, ma evitare l'essiccazione, inserire ogni pancreatoid in una goccia di 20 µ l di PBS. Se pancreatoids non rimangono ancora, ridurre il volume di PBS.
- Trasferimento pancreatoids a un nuovo pozzo che contiene gli anticorpi primari diluiti in 50 µ l di siero di 5% asino in 1 x PBST. In modo ottimale, roccia per 24 h a 4 oC (almeno 12 h ma fino a 36 h).
- Per sezioni congelate, trasferire pancreatoids da PBS in soluzione di saccarosio 30% durante la notte alle 4 oC.
- Aggiungi media incorporamento in una bolla sotto un microscopio di dissezione. Usando il forcipe sotto controllo microscopico, ammollo pancreatoids spingendo delicatamente attraverso i media che utilizza più volte per rimuovere saccarosio residua prima di trasferire a un blocco di tessuto con media incorporamento congelati.
- Posizionare il blocco di tessuto sul ghiaccio secco fino a quando congelati e sezione del criostato a 8 µm.
Nota: Sezioni possono essere conservate a-80 oC o immunostained immediatamente. - Consentire le sezioni da-80 oC a scongelare a temperatura ambiente per circa 5 min fino a secco. Disegnare una barriera idrofoba utilizzando la penna di pap idrofobo intorno il tessuto e il blocco usando 5% asino siero diluito in 1 x PBST per 30 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere e sostituire immediatamente con gli anticorpi primari diluiti in 5% di siero di asino diluito in 1 x PBST pernottamento in 4 oC.
- Rimuovere la soluzione primaria e lavare tessuti tre volte con 1 x PBST per 10 minuti ciascuno. In seguito, aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluito in 5% di siero di asino diluito in 1 x PBST per 1 h a temperatura ambiente e proteggere i vetrini dalla luce.
- Rimuovere la soluzione secondaria e lavare i vetrini tre volte in 1 x PBST per 10 minuti ciascuno. Il lavaggio finale, aggiungere 300 nM DAPI.
- Rimuovere i supporti e aggiungere mezzi di montaggio e un vetrino coprioggetti. Archivio scivola lontano dalla luce in 4 oC fino al momento della battuta.
4. isolamento di RNA da Pancreatoids per analisi della trascrizione
- Raccogliere pancreatoids utilizzo capillare di borosilicato collegato a una pipetta di bocca con una punta di pipetta µ l 1.000 filtrata per la sterilità e posto in 500 µ l di soluzione di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinium acido in una provetta da 1,5 mL. Conservare a-80 oC o procedere immediatamente all'isolamento del RNA.
- Per l'isolamento di RNA, scongelare i campioni su ghiaccio se necessario e aggiungere 100 µ l di cloroformio. Vortice bene e posto in 4 oC per 15 min. pre-raffreddare una centrifuga a 4 oC.
- Inserire tubi di centrifuga e spin per 20 min a 12.000 g a 4 oC.
- Estrarre con cautela le provette per non disturbare la separazione degli strati. Utilizzando una pipetta di 200 µ l, raccogliere la soluzione acquosa limpida e inserire in una nuova provetta da 1,5 mL, lasciando dietro di sé una piccola quantità di buffer dal livello di proteina bianco e rosa strato di DNA. Non toccare la punta della pipetta per nulla in questo processo e non toccare le pareti del tubo da 1,5 mL.
- Aggiungere 500 µ l di isopropanolo 100% nella nuova provetta contenente lo strato acquoso e vortice. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 20 minuti, più a lungo sul ghiaccio, o per precipitazione massima di lasciare durante la notte-20 oC.
- Centrifugare a 12.000 g per 15 min a 4 oC a pellet il RNA. Rimuovere l'isopropanolo senza disturbare il pellet.
Nota: Come pancreatoids sono piccole, è probabile che la pallina non sarà visibile. - Freddo, aggiungere 75% etanolo e capovolgendo il tubo. Posto nella centrifuga e spin a 9.000 x g per 10 min a 4 oC. Rimuovi l'etanolo e spin per 2 min a 9.000 x g.
- Utilizzare una pipetta 200 µ l per rimuovere qualsiasi residuo etanolo nel tubo, senza contattare il pellet risiede nella regione. Lasciare aperto il tappo sul tubo per 5-10 min a temperatura ambiente per garantire la evaporazione di etanolo residuo.
- Risospendere il pellet nel Vortex in 20 µ l di acqua pulita, privo di nucleasi.
Opzionale: Calore il RNA a 65 oC per 3 min e immediatamente tornare al ghiaccio. RNA possa essere conservato a-80 oC o immediatamente utilizzato per trascrizione inversa e qPCR.
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Representative Results
La dissezione attenta degli embrioni del mouse alle e 10.5 dal corno uterino dovrebbe produrre embrioni intatti in PBS per ulteriore dissezione (Figura 1A). Il tratto gastrointestinale può essere rimosso in modo efficiente dall'embrione (Figura 1B), permettendo di discernimento del germoglio pancreatico dorsale alla giunzione dell'intestino e dello stomaco (Figura 1C-F). In precedenza è stato caratterizzato il germoglio pancreatico e 10.5; progenitori dovrebbero esprimere Pdx1, Sox9, Ptf1a e Hes120,21,22,23. A seguito di fasi di lavorazione del tessuto, dissociate pancreatiche cellule singole o piccoli gruppi di cellule possono essere visualizzate da microscopia chiara (Figura 1G-H).
In media di organogenesi, queste cellule digalleggiante, senza impalcatura assemblarsi e organizzano in pancreatoids tridimensionale che crescono e persistono per almeno dieci giorni nella cultura (Figura 2A). I pancreatoids hanno somiglianze morfologiche al pancreas in vivo , con ramificazione morfogenesi che si verificano. Utilizzando topi transgenici, diversi tipi di cellule o processi possono essere monitorati in tempo reale. Ad esempio, utilizzando topi24 Ins1-eGFP per contrassegnare la formazione di cellule endocrine beta, pancreatoids può essere imaged nel quotidiano per visualizzare lo sviluppo delle cellule beta (Figura 2B). Inoltre, alterando le condizioni di coltura, aggiungendo piccole molecole, farmaci, o manipolare il genoma, non solo può essere valutata la determinazione di destino delle cellule ma cambiamenti nella struttura e morfologia possono anche essere studiate. Qui vi mostriamo l'applicazione della proteina chinasi C attivatore phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) alle alte concentrazioni (160 nM), che altera la morfologia di sviluppare pancreatoids, portando a vagamente associato cellule epiteliali e ramificazione è aumentato 19 (Figura 2C).
Per valutare l'associazione del tessuto pancreatico mesenchima con cellule epiteliali pancreatiche, immunostaining può essere eseguita per gli indicatori di ogni tessuto. Immunostaining del marcatore del condotto,25,DBA26, con un marcatore endocrino, Chitaga27e nuclei segnati da DAPI rivelano multi-lignaggio formazione in pancreatoids (Figura 3A). Un marcatore del mesenchima, vimentina, co-macchiato con un marcatore di cellule progenitrici del pancreas (da e 9.0 a circa e15.5) Pdx1, Mostra che il mesenchyme avvolge il pancreatoid (Figura 3B). Immunostaining è utilizzabile anche per esaminare morfologia, con strutture di ramificazione rivelatrice Pdx1, nonché diversi marcatori di tipi delle cellule di interesse. In Figura 3C, visualizziamo lo sviluppo delle cellule beta di macchiatura per il marcatore epiteliale Pdx1 e l'indicatore delle cellule beta ins Using qPCR analisi, trascrizioni dei progenitori e differenziazione delle cellule un essere valutati, quali i geni di cellule progenitrici PDX1 e Hes1 e differenziati marcatori Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1 e Ins1 (Figura 4).
Figura 1: struttura della dissezione, dissociazione e placcatura dei progenitori pancreatici e 10.5 per la generazione di pancreatoid. (A) l'immagine di campo chiaro dell'embrione e 10.5. (B) lo schema di procedura di dissezione, partendo in alto a sinistra. Il rosso, linee tratteggiate indicano le regioni da tagliare, mentre la regione verde è il tratto gastrointestinale. In primo luogo, la testa viene rimossa seguita dalla rimozione dei germogli di zampa anteriore e l'apertura del lato dell'organismo. (C) il tratto gastrointestinale è accuratamente rimosso, con i germogli di cuore e fegato che sporge dalla regione ventrale del tratto. Stomaco, intestino e germoglio pancreatico dorsale possono essere visualizzati, come illustrato nell'immagine campo chiaro. (D) rimozione del cuore e del fegato germogli. Schema elettrico è a sinistra e l'immagine di campo chiaro è sulla destra. (E) Pinching del tessuto intorno il germoglio pancreatico dorsale per esporre il germoglio per dissezione. Schema elettrico è a sinistra e l'immagine di campo chiaro è sulla destra. (F) il tratto gastrointestinale con il germoglio pancreatico dorsale sotto microscopia in campo chiaro. Nell'immagine a sinistra, la curva nell'intestino è visibile, dove forcipe può essere collocato prima di scollegare il tratto gastrointestinale dalla regione spinale. Sulla destra, l'immagine di campo chiaro ad alto ingrandimento Mostra entrambe le gemme del pancreas dorsale e ventrale. (G) rimozione del germoglio pancreatico dorsale e l'elaborazione del tessuto prima di dissociazione, risospensione in media di organogenesi e placcatura. (H) l'immagine di campo chiaro Mostra cellule dissociate immediatamente dopo il placcaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Pancreatoids di monitoraggio nel tempo. (A) immagini di campo chiaro di pancreatoids al giorno 1, giorno 2 e giorno 3. Scala bar = 100 um. (B) manipolazione delle condizioni di coltura per indagare la morfogenesi del pancreas. Qui, l'aggiunta di alti livelli di PMA conduce a struttura epiteliale allentato e ramificazione aumentata, come visualizzate da microscopia di campo chiaro ai giorni 1 e 2. Scala bar = 100 µm. (C) Ins1-eGFP mouse pancreatoids al giorno 4, giorno 5, giorno 6, 7 giorno e giorno 9, con lo sviluppo delle cellule beta indicato di eGFP in verde. Scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Immunostaining di pancreatoids. (A) Immunostaining pancreatoid giorno 5 per contrassegnare dotti dalla DBA in cellule rosse, endocrine da Chitaga in verde e i nuclei contrassegnati di DAPI in blu. (B) Immunostaining pancreatoid al 7 ° giorno per contrassegnare mesenchima di vimentina in rossi e pancreatici progenitori di Pdx1 in verde. (B) Immunostaining pancreatoid al giorno 7 per contrassegnare le beta cellule di insulina nei progenitori rossi e pancreatici di Pdx1 in verde. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Analisi della trascrizione. PCR quantitativa di giorno 7 pancreatoids per gli indicatori dei progenitori e differenziazione delle cellule. Confronto in vivo murino del tessuto è mostrato in Scavuzzo et al. (2017). risultati sono normalizzati a Gapdh. N = 2, barre della scala sono SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componente | Abbreviazione | Concentrazione finale |
| Penicillina-streptomicina | P/S | 1% |
| Media FBS-senza supplemento | 10% | |
| Beta-mercaptoetanolo | bME | 0,1 mM |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate | PMA | 16 nM |
| Inibitore di Y-27632 o ROCK | RI | 10 uM |
| Fattore di crescita epidermico | FEG | 25 ng/mL |
| R-Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| fattore di crescita del fibroblasto siliceo, fattore di crescita fibroblastico 1 | aFGF, FGF1 | 25 ug/mL |
| Sale di sodio eparina | Eparina | 2 U/mL |
| Fattore di crescita fibroblastico 10 | FGF10 | 100 ng/mL |
| Dulbecco per volta Eagle Medium/nutriente miscela F-12 | DMEM/F12 | a 5 mL |
Tabella 1. Media di organogenesi.
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Discussion
La progressione dei modelli della coltura cellulare è fondamentale per correttamente modello sviluppo, produrre tipi cellulari clinicamente rilevanti, prova l'efficacia dei farmaci o trapianto anche ai pazienti. Tuttavia, artificialmente ricapitola lo sviluppo in un piatto è impegnativo come siamo ancora lontani dal comprendere i meccanismi della organogenesi e fisiologia in vivo. Così le cellule in vitro sono inefficacemente generato, non completamente funzionale, incapace di essere mantenuti per lunghi periodi di tempo, o altre anomalie da cellule paragonabile nel corpo del porto. Infatti, molti tipi differenti delle cellule interagiscono mentre si verificano cambiamenti complessi morfogenetici per influenzare lo sviluppo e la fisiologia. Guadagnando una comprensione di come lo sviluppo procede combinando la comodità di in vitro sistemi pur conservando la complessità dello sviluppo in vivo sarebbero impartire un prezioso strumento per la ricerca biomedica.
Lo sviluppo dei organoids è una strada promettente verso la complessità dello sviluppo di modellazione. In questo protocollo, descriviamo come fare organoids pancreatico, chiamato pancreatoids, che conservano nativo mesenchima e robustamente generare cellule endocrine, seppur pancreatoids non manifestano reattività del glucosio. Questo strumento può essere utilizzato per studiare i meccanismi di sviluppo così come la funzionalità in un sistema di coltura che mantiene l'eterogeneità del tessuto trovato in vivo. Inoltre, questo può essere utilizzato per gli schermi di genetici o a schermo piccole molecole o farmaci. Ciò è particolarmente interessante, come test candidati farmaci in sistemi di colture cellulari relativamente omogeneo possono eludere gli effetti di questi composti su altri tipi di cellule strettamente correlati.
Ci sono diversi passaggi critici durante questo protocollo. In primo luogo, è importante quanto la rimozione accurata di embrioni dall'utero estraendo gli embrioni con forza può strappare la regione addominale e rendono difficile discernere il tratto gastrointestinale per ottenere il germoglio pancreatico (punto 1.3). In secondo luogo, pulita la dissezione del germoglio pancreatico dal tratto gastrointestinale è critica, come prelievo di tessuto in eccesso può condurre alla differenziazione di altri tipi cellulari (punto 1.4.4). Per fare questo, è importante pizzicare sotto il germoglio pancreatico e sollevare il tessuto sovrapposizione prima di isolare il germoglio pancreatico. Infine, quando si spostano germogli dal dispase torna in PBS per lavare, è indispensabile utilizzare un tubo capillare di borosilicato e di non lasciare che il tessuto toccano il bordo dell'apertura del tubo, in caso contrario, il tessuto si attacchi all'estremità del tubo (punto 1.5.1). Per evitare questo problema, è possibile iniziare soluzione pipettaggio bocca prima di passare verso il germoglio, permettendo il germoglio di passare nel tubo anziché all'esterno.
Questo metodo permette la formazione di cellule endocrine in un pancreatoid 3D, tuttavia, la ramificazione epiteliale è più limitata rispetto a altri esistenti protocolli16,17. Ulteriormente, mentre endocrine producenti insulina cellule forma, non esibiscono la reattività del glucosio. Quindi, ulteriore indagine la maturazione di queste cellule fornirà preziose informazioni sia nella generazione di pancreatoids funzionale, così come nel campo della generazione di beta cellule in generale.
La generazione di pancreatoids che si sviluppano le cellule endocrine, e, in futuro, che ottenere la risposta del glucosio, con potenziali implicazioni per il trattamento del diabete. Il diabete è un ottimo candidato per la terapia rigenerativa, come le cellule beta pancreatiche sono persi o disfunzionale e sostituendo queste cellule potenzialmente può alleviare le complicazioni della malattia. Progressi compiuti nella differenziazione hPSCs nelle beta cellule, tuttavia, nel diabete, ci sono spesso disfunzioni per altri tipi di cellule nel pancreas insieme con le cellule beta, tra cui le cellule alfa o cellule acinose28,29, 30,31,32. Così, generando nuovo tessuto pancreatico per trapianto può sostituire completamente il tessuto afflitto. Con le ulteriori indagini di murino pancreatoid formazione e nel funzionamento, la traiettoria dello sviluppo può essere imitata per generare umano pancreatoids fuori hPSCs. Questi pancreatoids umana può essere utilizzato per la medicina personalizzata alla schermata per la risposta ai farmaci in un contesto specifico per ogni paziente e per la terapia rigenerativa.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Jolanta Chmielowiec vi ringraziamo utile discussione per quanto riguarda il protocollo e il manoscritto. Ringraziamo anche Benjamin Arenkiel per l'accesso al microscopio confocale. Questo lavoro è stato supportato da NIH (P30-DK079638 a M.B.) e T32HL092332-13-m.a.s. e M.B., il fondamento medico di McNair (a M.B.) e il nucleo confocale al BCM intellettuale e centro di ricerca di inabilità inerenti allo sviluppo (NIH U54 HD083092 dal Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
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