Summary
Здесь мы представляем протокол для создания инсулина, выражая 3D мышиных pancreatoids от свободного плавания e10.5 отделить поджелудочной железы прародителями и связанные мезенхимы.
Abstract
Поджелудочная железа является сложный орган, состоящий из многих различных типов клеток которые работают вместе, чтобы регулировать гомеостаз глюкозы крови и пищеварение. Эти типы клеток включают фермента секретирующих железистый клетки, arborized протоковой системы, отвечают за транспортировку ферментов, кишки и производство гормонов эндокринных клеток.
Эндокринных бета клетки являются единственной ячейки тип в теле, которые производят инсулин, чтобы снизить уровень глюкозы в крови. Диабет, заболевание, характеризующееся потерей или дисфункции бета клеток, достигает масштабов эпидемии. Таким образом важно разработать протоколы для расследования развития бета клеток, который может использоваться для целей отбора для получения наркотиков и на основе ячеек терапии. В то время как экспериментальное исследование мыши развития имеет важное значение, в vivo исследования являются трудоемким и длительным. Культивируемых клеток обеспечивают более удобную площадку для скрининга; Однако, они не в состоянии поддерживать сотовой разнообразия, архитектурные организации и клеточных взаимодействия нашли в vivo. Таким образом крайне важно разработать новые инструменты для изучения физиологии и поджелудочной железы органогенеза.
Эпителиальных клеток поджелудочной железы развивать в тесной связи с Мезенхима с самого начала органогенеза как клетки организовать и дифференцироваться в сложных, физиологически компетентный орган, взрослых. Поджелудочной железы Мезенхима обеспечивает важные сигналы для эндокринной развития, многие из которых не вполне понятны, таким образом трудно резюмировать во время культуры в пробирке . Здесь мы описываем протокол к organoids трехмерную, сотовые комплекс мыши культуры, которые сохраняют мезенхимы, называется pancreatoids. E10.5 мышиных поджелудочной железы бутон расчлененный, отделить и культивировали в среде леса бесплатно. Эти плавающие клетки самостоятельно собрать с мезенхимы, обволакивающий развивающихся pancreatoid и надежный количество эндокринной бета клеток, развивающихся вместе с железистый и проток клетки. Эта система может использоваться для изучения взаимодействия клеток определение судьбы, структурной организации и морфогенеза, ячеек во время органогенез, или наркотиков, малые молекулы, или генетического скрининга.
Introduction
Определяющие механизмы нормального развития и физиологии имеет первостепенное значение для понимания этиологии заболевания и в конечном счете культивировать методов лечения. В то время как культивирование и дифференциации стволовых клеток позволяет быстро и высок объём анализ развития, он ограничивается существующего свода знаний о механизмах, регулирующих клеток судьба и искусственно резюмирует развития в относительно однородная, двумерные состояние1,2. Не только в естественных условиях развития пострадавших от внешних влияний, с различных типов клеток в нишу и окружение оказывает паракринными сигналов и организационной поддержки для руководства органогенез, но функция этих клеток также опирается на их окружение для руководства3,4,5. Учитывая важность этих внешних сигналов, ограничения протоколов дифференциации и трудоемкий характер в vivo моделей мышей, новых систем необходимы для экспериментально изучения основных процессов развития и физиологии.
Появление протоколов для создания трехмерных, сложных organoids обеспечивает удобный и конгруэнтных системы к изучению органогенеза, физиологии, эффективность препарата и даже патогенеза. Создание мышиных organoids для различных систем, таких как желудок6 и кишечника7 расширили наше понимание органогенез, обеспечивая инструмент для изучения развития сложностей с меньше ограничений, чем в естественных условиях и в пробирке модели. За эти достижения в мышиных органоид формирования и появлением человеческих плюрипотентных стволовых клеток человека кишечные8, сетчатки9, почечной10,11, и мозгового12 organoids были произведены и это репертуар ограничивается только существующих знаний относительно механизмов развития.
Особый интерес это поколение organoids поджелудочной железы, как множество заболеваний страдает различных поджелудочной железы типов клеток, включая железистый клетки и протоки поджелудочной экзокринной недостаточности13, железистый клетки в панкреатита14, и бета-клетки в диабет15. Получение знаний о разработке этих различных типов клеток может помочь в понимании их патологии и может Кроме того, выступать в качестве платформы для персональной наркотиков скрининг или трансплантации. Ранее Greggio et al. разработали метод для создания мышиных поджелудочной железы organoids пилки в vivo морфогенеза и развивать организованной, трехмерные, сложные структуры, состоящий из всех основных эпителиальных клеток поджелудочной железы типы16,17. Это является крупным шагом вперед в области поджелудочной железы, особенно делая клетки в пробирке может позволить биологические исследования развития бета клеток. Однако нехватка эндокринных клеток формируется в этом протоколе если organoids были пересажены в ткани, где нишу могли взаимодействовать и предоставляют учебные подсказки17. Мезенхима представляет собой наибольшую часть ниши, сильно обертывающей развивающихся эпителия от ранних стадиях органогенеза на более поздних этапах, включая эндокринной расслаивания и дифференциации3,4, 18. Взаимодействие между Мезенхима развивающихся поджелудочной железы является еще одним примером внешней сигнализации и важность сохранения в vivo сотовой сложности для изучения органогенеза.
Здесь мы опишем, как для создания трехмерных поджелудочной железы organoids, называют pancreatoids, от диссоциированных e10.5 мышиных поджелудочной железы прародителями. Эти pancreatoids сохранить родной мезенхимы, самостоятельно собрать в условиях свободного плавания и создать все типы основных клеток поджелудочной железы, включая надежные количество эндокринной бета-клетки19. Этот подход лучше всего подходит для анализа развития эндокринной, как предыдущие протоколы отсутствуют надежные эндокринной дифференциации. Однако используя протокол для поджелудочной железы organoids как описано в Greggio, et al. лучше подходит для анализа поджелудочной железы эпителиальных ветвления и морфогенеза, как ветвление более ограничен в pancreatoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные в этом методе эксперименты на животных были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета из колледж Бейлор.
1. Подготовка мыши эмбриональные день 10.5 поджелудочной железы прародителями
Примечание: Этот протокол не нужно следовать в стерильных условиях до шага 2, однако он является оптимальным для стерилизации инструменты диссекции и спрей с 70% этанол до использования.
- Чтобы настроить для вскрытия, заполнить ведро льда и поместите контейнер-фосфатный буфер (PBS) во льду. Очистите два штрафа наконечником щипцы и Рассечение ножницами с 70% этиловом спирте. В районе рассечение, контейнер с по крайней мере три боросиликатное капиллярной трубки, рот пипеткой, зажигалку и фильтруют 1000 мкл наконечники.
- Подготовьте по крайней мере 1 мл холодной dispase 1,25 мг/мл разбавленной в стерилизованные воды и место в втором колодец 12 хорошо плиты на льду. Положите PBS в первый, третий и четвертый хорошо тарелка скважин из 12. Место 1 мл 0,05% трипсина в 1,5 мл тюбик на льду. Предварительно теплой пожимая инкубатор на 37 oC.
- Усыпить приурочен беременных мышей e10.5 IACUC руководящим принципам. Spray живота с 70% этанола для очистки региона прежде чем V-образный разрез в области половых органов, мыши, используя ножницы, пинцет и продолжать его до диафрагмы.
Примечание: Появление Вагинальные вилка в этом протоколе указывает день 0,5. С помощью 5 - 6 week-old мышей, веса более чем на 2 g действует как вторичные меры успешного оплодотворения.- Тщательно акцизных матки, делая надрез на верхней боковой части матки, потянув орган вверх от мыши и после этого разреза до области половых органов, прежде чем повторять на противоположной стороне. Поместите его в 10 см Петри с холодной PBS.
Примечание: Это возможно получить organoids отделить e11.5 клеток, однако в отличие от e10.5 pancreatoids, эти organoids не характеризуются и таким образом не может сохранить способность дифференцировать во всех трех основных линий поджелудочной железы.
- Тщательно акцизных матки, делая надрез на верхней боковой части матки, потянув орган вверх от мыши и после этого разреза до области половых органов, прежде чем повторять на противоположной стороне. Поместите его в 10 см Петри с холодной PBS.
- Под микроскопом света рассечение поместите чашку Петри и тщательно открыть маточных тканей, поместив две щипцы между каждого эмбриона и пилинг ткани от желточного мешка. Трансфер эмбрионов, держа желточный мешок осторожно с щипцами и место в 10 см Петри блюдо со свежими, холодный PBS. Место на Петри блюдо на льду.
Примечание: Важно для удаления heedfully эмбрионы, желательно поддерживать в пределах желточного мешка, как насильственное удаление может тянуть пуповины, разрыв ткани эмбриона и ущерба для структурной целостности. - Место несколько капель PBS на крышке Петри 10 см. Используйте эти капельки для передачи эмбриона во время вскрытия, как extraembryonic тканей удаляются для обеспечения видимости. Переноса эмбриона на PBS падение и аккуратно извлеките из желточного мешка, с помощью щипцов, а оставшиеся эмбрионы остаться в PBS на льду (рис. 1А). Удалите головы до переезда в новое падение PBS с помощью щипцов для слегка совок эмбриона, не повреждения ткани (рис. 1Б) эмбриона.
Примечание: Ткани может потребоваться более часто передаваться свежие PBS капельки, чем описано здесь, в зависимости от непрозрачность жидкости.- В новое падение PBS удалите бутоны передних конечностей с помощью щипцов (рис. 1Б). Место щипцами в отверстие где конечности бутон присутствовал и нежно слезы только наиболее внешней ткани кпереди (рис. 1Б). Вращать эмбриона и повторять в направлении задней, останавливаясь на бутон задних конечностей. На данный момент желудочно-кишечного тракта должна быть видна (рис. 1Б).
- Задней части желудочно-кишечного тракта имеет небольшой изгиб (Рисунок 1F). Вставьте щипцами за этот изгиб в проеме между желудочно-кишечного тракта и спинного регионе стенки тела. Отсоедините желудочно-кишечного тракта, работают медленно вверх до наиболее передней региона где регионе сердца соединяется (рис. 1B-E).
Дополнительно: Удаление изначального сердца и печени почки из брюшной регионов желудочно-кишечного тракта, оставляя только непрерывное кишечника трубки. Первые несколько раз, выполняется этот протокол может быть проще оставить сердца и печени, как брюшной достопримечательности до морфология пищеварительного тракта и спинной поджелудочной железы бутон более знакомые (рис. 1C и D ). - Передать свежие капли PBS желудочно-кишечного тракта.
- Возьмите щипцами и осторожно Сожмите ткани под выступающие почки и кишечник и слегка приподнять внешние ткани выключение (рис. 1D-F).
Примечание: Спинной поджелудочной железы бутон расположен между желудка и кишечника (рис. 1C-G). Поджелудочной железы Бад под должен выглядеть как круглые, Нобби структуру (рис. 1G). - Место щипцы, где бутон подключается к кишечника и щепотку вверх, чтобы ослабить бутон (рис. 1G). Мыть один раз в новый пузырь PBS перед передачей бутон в первых колодец 12 хорошо пластины в холодной PBS на льду. Повторяйте, пока все шишки собираются от эмбрионов и помещены в первой скважины 12 хорошо пластины.
- Место 12 хорошо блюдо под микроскопом света рассечение. Подсчитать количество поджелудочной железы рецепторы, успешно разобрал позднее рассчитать коэффициент разделения.
- Место отфильтрованных 1000 мкл пипеткой кончик в рот пипеткой с капиллярной трубки прилагается. Пламя стерилизовать капиллярной трубки и создайте изгиб в трубе для простоты использования. Используйте капилляра для передачи почки в второе решение хорошо содержащие холодной dispase 2 мин до передачи третьего колодец с чистой PBS (рис. 1G).
Примечание: При передаче почки от dispase для PBS, не прикасайтесь к ткани, чтобы кончик капиллярной трубки. Если ткани получает застрял на кончик трубки, Пипетка вверх и вниз или встряхните в чистой PBS решения пока не ослабла. - Пипетка бутоны вверх и вниз и передавать четвертый колодец с чистой PBS. Наконец, с использованием капиллярной устройство передачи почки до 1,5 мл тюбик с 0,05% трипсина. Трубка в подогретым шейкер 37 oC и поколебать на 1500 об/мин на 4 мин.
- Вортекс для приблизительно 10 s немедленно поместить трубку в центрифуге и спина для 5 минут при 200 г. удалить все но приблизительно 50 мкл раствора осторожно, чтобы не беспокоить центрифугировали клеток (рис. 1G).
- Место отфильтрованных 1000 мкл пипеткой кончик в рот пипеткой с капиллярной трубки прилагается. Пламя стерилизовать капиллярной трубки и создайте изгиб в трубе для простоты использования. Используйте капилляра для передачи почки в второе решение хорошо содержащие холодной dispase 2 мин до передачи третьего колодец с чистой PBS (рис. 1G).
2. выращивание диссоциированных прародителями сформировать Pancreatoids
Примечание: Следующие должно выполняться в стерильной атмосфере в стандартной культуры ткани капюшоном, с использованием стандартных процедур стерильные.
- За каждые собранные бутон добавьте 400 мкл органогенеза СМИ16,17 (Таблица 1) центрифугировали клетки. Пульс вихря три раза и пластины 100 мкл на хорошо низкого прикрепления 96 хорошо пластины, расщепление почки в соотношении 1:4 (рис. 1G).
- Проверить под микроскопом, чтобы визуализировать отделить клетки, свободно плавающая (рис. 1H). Место культуры блюдо в 37 oC инкубатор с 5% CO2 на рокер на средней скорости.
- Ежедневно следить за ходом pancreatoids. Замените 100 мкл свежие СМИ каждые 3 дня, тщательно дозирования СМИ под контролем микроскопических в капюшоне удалить оставляя pancreatoid в скважине. Кроме того свежие µL 100 средств массовой информации могут добавляться к новой скважины и pancreatoid, переданных с использованием придает рот пипеткой и 1000 мкл капиллярной трубки боросиликатное фильтруемый наконечник пипетки.
3. обработка Pancreatoids для Immunofluorescent изображений
- Для обработки pancreatoids для immunofluorescent изображений, сначала Подготовьте параформальдегида 4% / PBS, pH7.4 (PFA) решение. Место 50 мкл 4% ПФА в скважинах 96 хорошо пластины.
- С помощью капиллярной трубки боросиликатное и рот пипеткой с кончиком отфильтрованных пипеткой 1000 мкл, передачи pancreatoids из питательной среды, с учетом как мало средств массовой информации как можно более свежие колодец с 4% PFA. Установите на коромысле при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Передача pancreatoids от 4% ПФА в колодец с 100 мкл свежих PBS, рок при комнатной температуре на 5-10 мин повторить в общей сложности три свежие PBS моет.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, с pancreatoids, хранящиеся в 100 мкл PBS на 4 oC на срок до одной недели.
- Для wholemount изображений (рекомендуется, если антитела являются подходящим, альтернативный подход в разделе 3.3. и микроскопии в 3.4.), передача от PBS в 50 мкл осла 5% сыворотки в однократном ПБС с 0.1% неионогенных моющего средства (PBST) для блока. Рок на ночь при 4 oC или в качестве альтернативы для 4 ч при комнатной температуре.
- Передачи pancreatoids новой скважины, содержащие первичных антител, разводят в 50 мкл осла 5% сыворотки в 1 x PBST. Оптимально рок за 24 ч в 4 oC (по крайней мере 12 h но до 36 ч).
Примечание: Антитела, перечисленных в Таблица материалов против КВУА (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) и Pdx1 (1: 100) подходят для окрашивания wholemount; другие антител может потребоваться оптимизация. - Перевод pancreatoids в колодец, содержащей 100 мкл свежие PBST мыть и рок на 30 минут при комнатной температуре. Повторите этот шаг для в общей сложности три свежие PBST смывки.
- Передачи pancreatoids новой скважины, содержащие вторичные антитела, разводят в 50 мкл осла 5% сыворотки в 1 x PBST. Защищают пластину от света и место в 4 oC, качалки для оптимально 24 h (по крайней мере 12 h но до 36 ч).
Примечание: Все вторичные антитела, перечисленные в Таблице материалов и DAPI ядерной изображение подходят для окрашивания wholemount. - Передачи pancreatoids новой скважины, содержащей 100 мкл 1 x PBST и горные породы при комнатной температуре в течение 30 мин повторить в общей сложности три автомойки в 1 x PBST. В третьей и заключительной мыть, добавьте 300 Нм DAPI.
- Наконец место в 100 мкл чистой PBS и хранить при 4 oC, защищены от света на срок до недели перед воображения confocal микроскопии, хотя наилучшие результаты приходят от изображений сразу же после окрашивания. Чтобы предотвратить движение pancreatoids во время визуализации, но предотвратить высыхание, поместите каждый pancreatoid в 20 мкл капли PBS. Если pancreatoids не оставаться еще, Уменьшите объем PBS.
- Передачи pancreatoids новой скважины, содержащие первичных антител, разводят в 50 мкл осла 5% сыворотки в 1 x PBST. Оптимально рок за 24 ч в 4 oC (по крайней мере 12 h но до 36 ч).
- Для замороженных секций передачи pancreatoids от PBS в 30% раствор сахарозы на ночь при 4 oC.
- Добавление вложения средств массовой информации в пузырь под микроскопом рассечение. С помощью щипцов под контролем микроскопические, Замочите pancreatoids, осторожно нажав через вложения средств массовой информации несколько раз для удаления остаточных сахарозы перед передачей в ткани блок с замороженных вложения средств массовой информации.
- Поместите блок ткани на сухой лед пока заморожен и раздел на криостата на 8 мкм.
Примечание: Секции могут храниться на-80 oC или immunostained немедленно. - Разрешить секций от-80 oC, чтобы разморозить при комнатной температуре примерно 5 минут до полного высыхания. Нарисуйте гидрофобный барьер с использованием пера гидрофобные ППА вокруг ткани и блока с помощью 5% осла сыворотку разводят в 1 x PBST за 30 мин при комнатной температуре.
- Удалите средства массовой информации и немедленно замените первичных антител, разводят в 5% осла сыворотку разводят в 1 x PBST ночь в 4 oC.
- Удаление первичного решения и Вымойте тканей три раза с 1 x PBST за 10 мин. После этого, добавьте вторичное антитело раствор разбавляют в 5% осла сыворотку разводят в 1 x PBST за 1 ч при комнатной температуре и защищать слайды от света.
- Удаление дополнительного решения и мыть слайды три раза в 1 x PBST за 10 мин. В окончательном мыть, добавьте 300 Нм DAPI.
- Удалите средства массовой информации и добавить монтажа СМИ и coverslip. Хранить слайды от света в 4 oC до готовности к изображению.
4. изоляция РНК от Pancreatoids для анализа Стенограмма
- Сбор pancreatoids с использованием боросиликатного капилляров, прикрепленных к рот пипеткой с отфильтрованных 1000 мкл кончиком пипетки стерильности и место в 500 мкл раствора кислоты Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ в 1,5 мл. Хранить в-80 oC или немедленно приступить к РНК изоляции.
- Для изоляции РНК оттепель образцы на льду, в случае необходимости и 100 мкл хлороформ. Вихревой хорошо и место в 4 oC на 15 мин предварительно охлаждения центрифуги для 4 oC.
- Место труб в центрифуге и спина для 20 минут, 12000 g на 4 oC.
- Осторожно удалите трубки не беспокоить разделение слоев. С помощью пипетки 200 мкл, собирать четкие водный раствор и место в новой 1,5 мл трубку, оставив небольшое количество буфер из слоя белых белок и розовый слой ДНК. Не прикасаться кончиком пипетки для что-нибыдь в этом процессе и не касайтесь стен 1,5 мл трубки.
- Добавьте 500 мкл 100% изопропиловый спирт новых трубка, содержащая водный слой и вихря. Пусть сидят при комнатной температуре за 20 мин, больше на льду, или максимум осадков оставить на ночь в-20 oC.
- Центрифуга на 12000 g 15 мин на 4 oC на гранулах РНК. Удаление изопропанола не нарушая гранулы.
Примечание: Как pancreatoids малы, вполне вероятно, гранулы не будет видна. - Добавьте холодной, 75% этанола и перевернуть трубку несколько раз. В центрифуге и спина на 9000 x g 10 мин на 4 oC. Remove этанола и спина на 2 мин на 9000 x g.
- Использование пипетки 200 мкл для удаления любых оставшихся этанола в трубе, не обращаясь в регионе, что гранулы проживает в. Закрывайте крышку на трубе для 5-10 мин при комнатной температуре для обеспечения испарения остаточной этанола.
- Ресуспензируйте Пелле в по vortexing в 20 мкл воды чистой, свободной от нуклеиназы.
Опционально: Тепла РНК в 65 oC на 3 мин и немедленно вернуться в лед. РНК могут храниться на-80 oC или непосредственно использоваться для обратной транскрипции и ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тщательное вскрытие зародышей мыши на e10.5 из рога матки должна принести неповрежденных эмбрионов в PBS для дальнейшего диссекции (рис. 1А). Желудочно-кишечного тракта можно эффективно удалить из эмбриона (рис. 1Б), позволяя проницательность спинной поджелудочной железы бутон на стыке кишечника и желудка (C-Fрис. 1). Ранее была охарактеризована бутон e10.5 поджелудочной железы; прародителями следует выразить Pdx1, Sox9, Ptf1a и Hes120,21,22,23. Следующие шаги обработки ткани диссоциированных клеток поджелудочной железы одной или небольшими группами клеток могут быть визуализированы на световой микроскопии (рис. 1G-H).
В органогенеза СМИ эти клетки свободно плавающего, леска бесплатно самостоятельно собрать и организовать в трехмерной pancreatoids, которые растут и сохраняться в течение по крайней мере десять дней в культуре (рисA). Pancreatoids имеют морфологические сходства в vivo поджелудочной железы, с ветвлением морфогенеза происходит. Использование трансгенных мышей, различных типов клеток или процессы могут контролироваться в режиме реального времени. Например используя Ins1-eGFP24 мышей в ознаменование формирования эндокринной бета-клеток, pancreatoids может отражаться в ежедневно для визуализации развития бета клеток (рис. 2B). Кроме того путем изменения условий культуры, добавив малых молекул, наркотиков или манипулирования генома, не только определение судьбы клетки могут быть оценены, но можно также исследовать изменения в структуре и морфологии. Здесь мы покажем применение протеин киназы C активатор phorbol 12-миристат 13-ацетата (PMA) при высоких концентрациях (160 Нм), который изменяет морфологию развивающихся pancreatoids, ведущих к слабо связанные эпителиальных клеток и повышением ветвления 19 (рис. 2C).
Чтобы оценить ассоциации ткани поджелудочной железы Мезенхима с эпителиальных клеток поджелудочной железы, иммуноокрашивания может выполняться для маркеров каждой ткани. Иммуноокрашивания воздуховод маркера, DBA25,26, с эндокринной маркер, КВУА27и ядер, отмечен DAPI раскрыть мульти линии формирования в pancreatoids (рис. 3А). Мезенхима маркер, виментин, совместно витражи с маркером поджелудочной железы Прародителя (от e9.0 до приблизительно e15.5) Pdx1, показывает, что Мезенхима окутывает pancreatoid (рис. 3B). Иммуноокрашивания может также использоваться для изучения морфологии, с Pdx1 выявление структуры ветвления: выражение, а также различные маркеры типов клеток интерес. На рис. 3C, мы визуализируем развития бета клеток путем пятнать для эпителиальных маркер Pdx1 и маркер бета клеток соц.страх использование ПЦР анализ, стенограммы прародителей и дифференциации клеток быть оценены, как прародитель генов Pdx1 и Hes1 и дифференцированные маркеры, Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1 и Ins1 (рис. 4).
Рисунок 1: наброски рассечение, разобщенность, и покрытие поджелудочной железы прародителей e10.5 для pancreatoid поколения. (A) brightfield изображение e10.5 эмбриона. (B) схема процедуры вскрытия, начиная в левом верхнем углу. Красный, пунктирные линии указывают на регионы, чтобы сократить, в то время как зеленый регион является желудочно-кишечного тракта. Во-первых руководитель удаляется после удаления почки передних конечностей и открытие в части организма. (C) желудочно-кишечного тракта тщательно удаляется, с сердца и печени, почки, торчащий из брюшной региона тракта. Желудка, спинной бутон поджелудочной железы и кишечника могут быть визуализированы, как показано на рисунке brightfield. (D) удаление сердца и печени почки. Схема находится на левой стороне и brightfield изображение справа. (E) Pinching ткани вокруг спинной поджелудочной железы почки подвергать зародыше дисекция. Схема находится на левой стороне и brightfield изображение справа. (F) желудочно-кишечного тракта с спинной поджелудочной железы Бад под brightfield микроскопии. В изображении слева изгиб в кишечнике является видимым, где щипцы могут быть размещены при отключении желудочно-кишечного тракта от спинного регионе. Высокое увеличение brightfield рисунке справа, дорсальной и вентральной поджелудочной железы рецепторы. (G) удаление спинной поджелудочной железы бутон и обработки ткани до диссоциации, ресуспендирования в органогенеза СМИ и покрытие. (H) brightfield изображение показывает диссоциированных клетки сразу же после покрытия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Мониторинг pancreatoids со временем. (A) Brightfield изображения pancreatoids в день 1, день 2 и 3 день. Масштаб баров = 100 мкм. (B) манипуляции культуры условий расследовать поджелудочной железы морфогенеза. Здесь помимо высокого уровня PMA приводит к ослабил эпителиальные структуры и увеличение ветвления, как визуализированное brightfield микроскопии в день 1 и 2. Масштаб баров = 100 µm. (C) Ins1-eGFP мыши pancreatoids в день 4, 5 день, день 6, 7 день и день 9, с развитием бета-клеток обозначается eGFP зеленым цветом. Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Иммуноокрашивания pancreatoids. (A) иммуноокрашивания pancreatoid в день 5 Марк воздуховодов, DBA в красный, эндокринных клеток КВУА в зеленый и ядер, отмечен DAPI синим цветом. (B) иммуноокрашивания pancreatoid на 7 день в ознаменование Мезенхима виментин в красный и поджелудочной железы прародителями, Pdx1 зеленым цветом. (B) иммуноокрашивания pancreatoid в день 7 для обозначения бета-клеток, инсулин в красный и поджелудочной железы прародителями, Pdx1 зеленым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Анализ текста. Количественная ПЦР день 7 pancreatoids для маркеров прародителями и дифференциации клеток. Сравнение в vivo мышиных ткани показано в Scavuzzo и др. (2017). Результаты нормализуются к Gapdh. N = 2, масштаб гистограммы являются SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Компонент | Аббревиатура | Конечная концентрация |
| Пенициллин стрептомицином | P/S | 1% |
| FBS-свободных СМИ дополнение | 10% | |
| Бета меркаптоэтанол | bME | 0,1 мм |
| Phorbol 12-миристат 13-ацетат | PMA | 16 Нм |
| Y-27632 или рок ингибитор | РИ | 10 мкм |
| Эпидермального фактора роста | EGF | 25 нг/мл |
| R-Spondin1 | - | 500 нг/мл |
| кислотные фактор роста фибробластов, фактор роста фибробластов 1 | aFGF, FGF1 | 25 мкг/мл |
| Гепарин натрия соли | Гепарин | 2 ед/мл |
| Фактор роста фибробластов 10 | FGF10 | 100 нг/мл |
| Дульбекко изменение Eagle среднего/питательной смеси F-12 | DMEM/F12 | по 5 мл |
Таблица 1. Органогенез СМИ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Прогрессирование клетки культуры моделей имеет решающее значение для правильной модели развития, производят типы клинически значимых клеток, эффективность препарата испытания или даже трансплантации пациентам. Однако, искусственно изложив развития в блюдо сложной, как мы все еще далеки от понимания механизмов, органогенез и физиологии в vivo. Таким образом в vitro клетки неэффективно сгенерированный, не полностью функциональный, может сохраняться в течение длительного времени, или гавани другие отклонения от сопоставимых клеток в организме. Это потому что много различных типов клеток взаимодействовать при сложных морфогенетических изменения происходят влиять на развитие и физиологии. Понять процесс развития путем объединения удобство в vitro систем, сохраняя при этом сложность в естественных условиях развития придаст ценным инструментом для биомедицинских исследований.
Разработка organoids является перспективным проспекту моделирование сложного характера развития. В этом протоколе мы наметим как сделать поджелудочной железы organoids, называется pancreatoids, которые сохраняют родной мезенхимы и энергично генерировать эндокринные клетки, хотя pancreatoids не проявляют оперативность глюкозы. Этот инструмент может использоваться для изучения механизмов развития, а также функциональность в системе культуры, которая поддерживает гетерогенность ткани, найдено в естественных условиях. Кроме того это может использоваться для генетических экранов или экран малых молекул или наркотиков. Это особенно интересно, как тестирования кандидата наркотиков в относительно однородных клеток культуры систем могут обойти последствия этих соединений на других типах тесно связанных клеток.
Существует несколько важных шагов в ходе настоящего Протокола. Во-первых, тщательное удаление эмбрионов из матки имеет важное значение как решительно вырывает эмбрионы могут рип области живота и сделать его трудно разглядеть желудочно-кишечного тракта для получения поджелудочной железы бутон (шаг 1.3). Во-вторых, чистый рассечение поджелудочной железы бутон из желудочно-кишечного тракта является критическим, как принимая избыточной ткани может привести к дифференциации других типов клеток (шаг 1.4.4). Для этого важно, щепотка ниже поджелудочной железы бутон и отменить наложение ткани до изоляции поджелудочной железы бутон. Наконец при движении почки от dispase обратно в PBS мыть, важно использовать капиллярной трубки боросиликатное и не позволить ткани коснуться края трубки открытия, в противном случае, ткани будет придерживаться кончик трубки (шаг 1.5.1). Чтобы избежать этого, начните рот дозирования решение перед переходом к бутон, позволяя Бутон пойти в трубу, а не снаружи.
Этот метод разрешает эндокринных клеток в 3D pancreatoid, однако, эпителиальные ветвления является более ограниченным, чем другие существующие протоколы16,17. Кроме того в то время как инсулин продуцирующих эндокринных клеток формы, они не проявляют оперативность глюкозы. Таким образом дальнейшее расследование созревание этих клеток даст ценную информацию как в поколение функциональных pancreatoids, а также в области поколения бета клетки в целом.
Поколения pancreatoids, развивать эндокринные клетки, и в будущем, что получение глюкозы отзывчивость, имеет потенциальные последствия для лечения диабета. Диабет является кандидатом для восстановительной терапии, как бета-клетки поджелудочной железы потеряли или неблагополучных и заменив эти клетки потенциально может облегчить осложнений заболевания. Прогресс был достигнут в дифференциации hPSCs в бета-клетки, однако, при сахарном диабете, есть часто дисфункций в другие типы клеток в поджелудочной железе вместе с бета-клеток, включая альфа-клетки или железистый клетки28,29, 30,,31-32. Таким образом создавая новые ткани поджелудочной железы для трансплантации может полностью заменить страдают ткани. С дополнительные расследования мышиных pancreatoid формирования и функционирования можно имитировать траектории развития для создания человеческого pancreatoids из hPSCs. Эти человеческие pancreatoids может использоваться для персонализированной медицины экран для реагирования к лекарствам в контексте конкретного пациента и для восстановительной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Jolanta Chmielowiec за полезной дискуссии относительно протокола и рукописи. Мы также благодарим Бенджамин Arenkiel для доступа к конфокального микроскопа. Эта работа была поддержана NIH (P30-DK079638 к м.б.) и T32HL092332-13 M.A.S. и м.б., Макнэйр медицинского фонда (м.б.) и конфокальный ядро на BCM интеллектуальной и отклонениями в развитии научно-исследовательский центр (низ U54 HD083092 от Юнис Кеннеди Шрайвер Национальный Институт детского здоровья и развития человеческого потенциала).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al.
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D.
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
