Summary
Burada, serbest dalgalı e10.5 ayrışmış pankreas ataları ve ilişkili Mezenşim 3D fare pancreatoids ifade insülin üretmek için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Pankreas karmaşık bir organ kan glikoz homeostazı ve sindirimi düzenler için birlikte çalışan birçok farklı hücre türleri modülüdür. Bu hücre türleri acinar hücreleri, bir arborized duktal sistem gut ve hormon üreten endokrin hücrelere sorumlu enzimleri ulaşım için enzim salgılayan içerir.
Endokrin beta hücreleri tek hücre tipi vücuttaki insülin kan şekeri düzeylerini düşürmek için üretmek vardır. Diyabet, bir kayıp veya beta hücre fonksiyon bozukluğu ile karakterize bir hastalık salgın boyutlarına ulaşıyor. Böylece, araştırmak amacıyla filtreleme için ilaç ve tedavi hücre tabanlı türetmek için kullanılan beta-hücre gelişimi için iletişim kuralları kurmak için önemlidir. Fare geliştirme deneysel incelenmesi gerekli olmakla birlikte, in vivo çalışmalar zahmetli ve zaman alıcı vardır. Kültürlü hücreleri filtreleme için daha uygun bir platform sağlamak; Ancak, hücresel çeşitlilik, mimari organizasyon ve hücresel etkileşimlerin bulundu korumak edemiyoruz içinde vivo. Böylece, pankreas organogenesis ve Fizyoloji araştırmak için yeni araçlar geliştirmek esastır.
Hücreleri düzenleyebilir ve karmaşık, fizyolojik olarak yetkili yetişkin organ ayırt pankreas epitel hücreleri Mezenşim organogenesis başlangıcından ile yakın ilişki içinde geliştirmek. Pankreas Mezenşim birçoğu de henüz, böylece sırasında vitro kültür özetlemek zor anlaşılır değil önemli sinyalleri endokrin gelişmesi için sağlar. Burada, biz pancreatoids olarak adlandırdığı Mezenşim korumak kültür üç boyutlu, hücresel karmaşık fare organoids için bir iletişim kuralı tanımlamak. E10.5 fare pankreas bud disseke, ayrışmış ve iskele-Alerjik bir ortamda kültürlenir. Bunlar yüzen hücreleri gelişmekte olan pancreatoid ve endokrin beta hücreleri gelişmekte olan acinar ve kanal hücreleri ile birlikte sağlam bir dizi Zarflama Mezenşim ile kendini topla. Bu sistem organogenesis sırasında ya da uyuşturucu, küçük molekül veya genetik tarama için hücre kader tayini, yapısal organizasyonu ve morfogenez, hücre-hücre etkileşimleri eğitim için kullanılabilir.
Introduction
Normal gelişim ve fizyolojisi mekanizmaları operasyona hastalığı nedenleri anlamak ve sonuçta tedavi yöntemleri yetiştirmek için her şeyden önemlidir. Kültür ve kök hücre ayırt gelişimin hızlı ve yüksek üretilen iş analizi olanak sağlarken, bilgi ile ilgili hücre kader düzenleyen mekanizmalar mevcut vücut ile sınırlıdır ve yapay olarak gelişiminde beyannamedir bir nispeten homojen, iki boyutlu durum1,2. Sadece dışsal etkiler, farklı hücre tipleri niş ve çevre ile etkilenen vivo içinde geliştirme sağlayan parakrin sinyalleri ve örgütsel destek organogenesis rehberlik etmek, ama Ayrıca bu hücrelerin işlevini kullanır onların çevresi için rehberlik3,4,5. Bu dış yardımlar önemi, farklılaşma protokolleri sınırlamalar ve in vivo fare modelleri zahmetli doğası göz önüne alındığında, yeni sistemleri temel gelişimsel süreçleri ve Fizyoloji deneysel olarak araştırmaya ihtiyaç vardır.
Üç boyutlu, karmaşık organoids oluşturmak için iletişim kuralları ortaya çıkması organogenesis, fizyoloji, uyuşturucu etkinlik ve hatta patogenezinde. eğitim için uygun ve uyumlu bir sistem sağlar Mide ve bağırsak6 7 gibi farklı sistemleri organogenesis anlayışımızı genişlettik için fare organoids kurulması, gelişimsel karmaşıklığı vivo içinde daha az kısıtlamalarla çalışma için bir araç sağlayan ve vitro modelleri. Fare organoid bu gelişmeler nedeniyle oluşumu ve insan pluripotent gelişiyle kök hücreleri, insan bağırsak8, Retina9, böbrek10,11ve serebral12 organoids üretilen ve bu repertuar sadece gelişiminin mekanizmaları ile ilgili mevcut bilgi ile sınırlıdır.
Pankreas farklı hücre tipleri, ekzokrin pankreas yetmezliği13, pankreatit14, acinar hücrelerde acinar hücreleri ve kanalları dahil olmak üzere sayısız hastalıklar veba gibi özel ilgi pankreas organoids olduğunu ve Beta hücreleri diyabet15dakika sonra. Bu farklı hücre tipleri geliştirilmesi ile ilgili bilgi kazanıyor onların patoloji anlamada yardımcı olabilir ve ayrıca, kişiselleştirilmiş uyuşturucu tarama veya nakli için bir platform olarak hareket edebilir. Daha önce Greggio ve ark. vivo içinde morfogenez özetlemek ve tüm büyük pankreas epitel hücre oluşur organize, üç boyutlu, karmaşık yapıları geliştirmek fare pankreas organoids oluşturmak için bir yöntem geliştirdi 16,17türleri. Bu pankreas alanında önemli bir adım, özellikle yapım hücreleri vitro beta-hücre gelişimi biyolojik incelenmesi etkinleştirebilirsiniz. Ancak, organoids nerede etkileşim burnu ile Öğretim İpuçları17sağlamak dokusu içine nakledilen sürece bir kıtlık endokrin hücre bu protokol için kurdu. Mezenşim ağır endokrin delaminasyon ve farklılaşma3,4de dahil olmak üzere daha sonraki aşamaları için organogenesis erken aşamalarında gelen epitel gelişmekte olan Zarflama niş, en büyük kısmını teşkil eder, 18. Mezenşim etkileşim gelişmekte olan pankreas henüz dışsal sinyal ve in vivo hücresel karmaşıklık sürdürmenin önemini organogenesis çalışmak için başka bir örnektir.
Burada, pancreatoids, Disosiye e10.5 fare pankreas ataları olarak adlandırdığı üç boyutlu pankreas organoids oluşturmak nasıl açıklar. Bu pancreatoids yerel Mezenşim korumak, serbest dalgalı koşullarda kendini birleştirin ve endokrin beta hücreleri19sağlam bir dizi de dahil olmak üzere tüm büyük pankreas hücre tipleri oluşturmak. Önceki iletişim kuralları sağlam endokrin farklılaşma bulunmadığından bu yaklaşım endokrin geliştirme, analiz için uygundur. Ancak, pankreas organoids için iletişim kuralını kullanarak vd. daha iyi pankreas epitel dallanma ve morfogenez, analiz için uygun Greggio tarafından açıklandığı gibi dallanma olarak daha pancreatoids içinde sınırlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu yöntemde açıklanan tüm hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Baylor Tıp Fakültesi tarafından kabul edildi.
1. fare embriyonik gün 10,5 pankreas ataları hazırlanması
Not: diseksiyon .aletleri sterilize ve kullanmadan ile % 70 etanol önce sprey uygunudur ancak bu protokolü kadar adım 2, steril koşullarda izlenecek gerekmez.
- Diseksiyon için ayarlamak için bir buz kovası doldurun ve buzun içinde bir kap fosfat tamponlu tuz (PBS) yerleştirin. İki ince uçlu forseps ve diseksiyon makası % 70 etanol ile temizleyin. Yakın olan diseksiyon alanına ayarla, en az üç borosilikat kapiller içeren bir kapsayıcı, bir ağız pipet, bir çakmak, tüpler ve 1000 µL pipet ipuçları filtre.
- En az 1 mL steril su ve buz üzerinde 12 iyi plaka ikinci iyi yerde seyreltilmiş 1.25 mg/mL soğuk dispase hazırlayın. PBS birinci, üçüncü ve dördüncü koymak wells 12 de plaka. Yer 1 mL % 0.05 tripsin 1,5 ml tüp buz üzerinde. 37 oC. titreyen bir kuluçka önceden ısıtmak
- E10.5 zaman aşımına uğradı-hamile fareler IACUC kurallar uyarınca ötenazi. Karın bir V şeklinde kesi genital bölge, makas ve forseps kullanarak fare yapmadan önce bölgenin temiz ve diyafram kadar devam etmek için % 70 etanol ile sprey.
Not: Bu protokol vajinal bir eklenti görünümü gün 0,5 belirtir. 5 - 6-hafta-yaşlı fareler, kullanma daha--dan 2 g bir kilo alımı başarılı emprenye ikincil bir ölçüsü olarak davranır.- Dikkatli bir şekilde rahim, rahim, karşı tarafta tekrarlanmadan önce yukarı doğru uzak fare ve bu kesi aşağıdaki organ genital bölge aşağı çekerek en üst lateral bölümlerini bir kesi yaparak tüketim. 10 cm soğuk PBS ile Petri kabına yerleştirin.
Not: E10.5 pancreatoids, aksine bu organoids değil henüz karakterize edilmektedir ve bu nedenle tüm üç büyük pankreas soy ayırt etmek için kapasite tutmamayı ancak organoids ayrışmış e11.5 hücrelerinden elde etmek mümkündür.
- Dikkatli bir şekilde rahim, rahim, karşı tarafta tekrarlanmadan önce yukarı doğru uzak fare ve bu kesi aşağıdaki organ genital bölge aşağı çekerek en üst lateral bölümlerini bir kesi yaparak tüketim. 10 cm soğuk PBS ile Petri kabına yerleştirin.
- Bir ışık diseksiyon mikroskop altında Petri kabına yerleştirin ve dikkatle her embriyo arasında iki forseps yerleştirip doku sarısı sac uzak soyulması rahim dokusu açın. Sarısı sac forseps ve yeri 10 cm ile taze, Petri kabına yavaşça ile açgözlü tarafından embriyo transfer soğuk PBS. Petri kabına buza koyun.
Not: Heedfully embriyo, tercihen güçlü kaldırma doku embriyo sökük ve yapısal bütünlüğü tehlikeye göbek kordonu, indirebiliriz sarısı sac içinde muhafaza kaldırmak önemlidir. - Birden çok PBS damla bir 10 cm Petri kabına kapağını yerleştirin. Bu damlacıkları extraembryonic dokularının görünürlük sağlamak için kaldırılır gibi embriyo diseksiyon sırasında aktarmak için kullanın. Bir PBS damla için bir embriyo transfer ve kalan embriyolar PBS buz (Şekil 1A) içinde kalırken forseps, kullanarak sarısı sac yavaşça kaldırın. Baş hafifçe, embriyonun doku (Şekil 1B) hasar için kepçe forseps kullanarak yeni bir PBS damla embriyo geçmeden önce kaldırın.
Not: Doku daha sık taze PBS damlacıkları için burada, sıvı opaklık bağlı olarak açıklanan aktarılması gerekir.- Yeni bir PBS düşüş forseps (Şekil 1B) kullanarak forelimb tomurcukları kaldırın. Yer forseps açılış içine nerede kol bud mevcuttu ve yavaşça sadece en dış doku anteriorly gözyaşı (Şekil 1B). Embriyo döndürmek ve hindlimb bud durdurma arka yönde tekrarlayın. Bu noktada, gastrointestinal sistem görünür (Şekil 1B) olmalıdır.
- Gastrointestinal sistem arka bölge (Şekil 1F) hafif bir viraj var. Bu bend arkasında forseps açılış gastrointestinal sistem ve vücut duvar spinal bölge arasında ekleyin. En ön bölge nerede kalp bölge (Şekil 1B-E) bağlanan ulaşılana kadar yavaş yavaş yukarı doğru çalışma gastrointestinal sistem bağlantısını kesin.
İsteğe bağlı: ilkel kalp ve karaciğer tomurcukları gastrointestinal sistem sadece sürekli gut tüp bırakarak, ventral bölgelerden kaldırma. Bu iletişim kuralı gerçekleştirilir ilk birkaç kez kalp ve karaciğer morfolojisi, gastrointestinal sistem ve dorsal pankreas tomurcuk kadar ventral yerlerinden daha fazla olduğu gibi bırakmak daha kolay olabilir tanıdık (Şekil 1C ve D ). - Gastrointestinal sistem taze PBS damlacık aktarın.
- Forseps alıp hafifçe çıkıntılı bud ve bağırsak altında doku çimdik ve biraz (Şekil 1D-F) kapalı dış doku kaldırın.
Not: Dorsal pankreas bud mide ve bağırsak (Şekil 1C-G) arasında yer almaktadır. Altında belgili tanımlık pankreas gonca gibi yuvarlak, budaklı yapı (Şekil 1G) bakmak gerekir. - Forseps nereye belgili tanımlık gonca bağırsak ve yukarı doğru bud (Şekil 1G) gevşetmek için çimdik bağlanır koyun. Bir kez yeni bir PBS balonun içinde belgili tanımlık gonca soğuk PBS 12 iyi plaka ilk kuyunun içine buzda aktarmadan önce yıkayın. Tüm tomurcukları embriyo toplanan ve 12 iyi plaka ilk kuyuda yerleştirilir kadar yineleyin.
- Işık diseksiyon mikroskop altında 12 iyi çanak yerleştirin. Pankreas tomurcukları başarıyla sonra split oranını hesaplamak için disseke saymak.
- Yer bir filtre uygulanmış 1.000 µL pipet ucu içine ağzını pipet kılcal tüp ile bağlı. Alev kılcal tüp sterilize ve kullanım kolaylığı için tüp viraj oluşturun. Kılcal temiz PBS (Şekil 1G) ile üçüncü de aktarmadan önce ikinci de içeren soğuk dispase çözüm için 2 dk tomurcukları aktarmak için kullanın.
Not: tomurcukları dispase PBS'ye aktarma sırasında doku Kılcal boru ucuna dokunmaktan kaçının. Eğer doku tüpün ucunda takılıyor, yukarı ve aşağı pipet veya gevşetti kadar temiz PBS çözümde sallamayın. - Tomurcukları yukarı ve aşağı pipet ve temiz PBS ile dördüncü de aktarın. Son olarak, kapiller aygıt aktarması kullanarak tomurcukları 1,5 mL tüp ile % 0.05 tripsin. Önceden ısıtılmış 37 oC shaker tüpü yerleştirin ve 4 dk için 1500 rpm'de sallamak.
- Yaklaşık 10 için girdap s sonra hemen yer tüp bir santrifüj ve spin 200 5 min için g. kaldırmak ama yaklaşık 50 µL çözüm dikkatli centrifuged hücreleri (Şekil 1G) rahatsız değil gibi.
- Yer bir filtre uygulanmış 1.000 µL pipet ucu içine ağzını pipet kılcal tüp ile bağlı. Alev kılcal tüp sterilize ve kullanım kolaylığı için tüp viraj oluşturun. Kılcal temiz PBS (Şekil 1G) ile üçüncü de aktarmadan önce ikinci de içeren soğuk dispase çözüm için 2 dk tomurcukları aktarmak için kullanın.
2. kültür Disosiye ataları Pancreatoids oluşturmak için
Not: Aşağıdaki standart steril prosedürler kullanarak standart doku kültürü Hood, steril bir ortamda gerçekleştirilmesi gerekiyor.
- Toplanan her bud için 400 µL organogenesis medya16,17 (Tablo 1) centrifuged hücrelere ekleme. Girdap üç kez darbe ve plaka 100 µL düşük ek 96 kuyu başına iyi tomurcukları (Şekil 1G) 1:4 oranında bölme plakası.
- Mikroskop altında ilişkisini görselleştirmek için (resim 1H) serbestçe yüzen hücreleri denetleyin. 37 oC kuluçka %5 CO2 orta hızda bir rocker kültür çanak yerleştirin.
- Her gün pancreatoids ilerlemesini izlemek. 100 µL taze medya her 3 günde hood pancreatoid kuyuda bırakarak kaldırmak için mikroskobik kontrol altında dikkatle pipetting medya ile değiştirin. Alternatif olarak, medya taze 100 µL yeni iyi ve pancreatoid kullanarak transfer ağzını pipet ve 1000 µL bağlı borosilikat kılcal tüp pipet ucu filtre ekleyebilirsiniz.
3. işlem Pancreatoids immünfloresan görüntüleme için
- Pancreatoids immünfloresan görüntüler için işlemek için ilk %4 paraformaldehyde/PBS, pH7.4 (PFA) çözüm hazırlamak. Yer 50 µL % 4'lük PFA 96 Wells de plaka.
- Borosilikat kılcal tüpler ve ağzını pipet 1000 µL süzülmüş pipet ucu ile kullanarak, kültür % 4 ile taze kuyuya mümkün olduğu kadar az medya alarak orta pancreatoids transfer PFA. 15 dakika oda sıcaklığında rocker üzerinde ayarlayın.
- Pancreatoids 4'den % aktarım PFA taze PBS, 100 µL ile bir kuyuya rock, oda sıcaklığında 5-10 dakika tekrar olmak üzere toplam üç taze PBS yıkar, için.
Not: Protokol burada, pancreatoids bir hafta kadar PBS 100 µL 4 oC, depolanan ile duraklatılmış.
- Wholemount görüntüleme için (antikorlar bölümünde 3.3 uygun, alternatif bir yaklaşım olup tavsiye. ve 3.4 mikroskobu.), PBS 1 x PBS % 0,1 Noniyonik deterjan (PBST) ile 50 µL % 5 eşek serum içine engellemek için transfer. Gecede 4 oC rock ya da alternatif olarak, oda sıcaklığında 4 h için.
- Birincil antikorlar % 5 eşek serum 1 50 µL içinde seyreltilmiş içeren yeni bir kuyu pancreatoids transfer x PBST. En iyi şekilde, rock 4 oC 24 h (en az 12 h ama en fazla 36 saat) için.
Not: Malzeme tablo Chga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) ve Pdx1 karşı antikorlar listelenen (1: 100) uygun wholemount boyama için; diğer antikorlar optimizasyonu gerektirebilir. - Pancreatoids yıkama ve oda sıcaklığında 30 dakika rock taze PBST 100 µL içeren bir de aktarın. Toplam üç taze PBST yıkama için bu adımı yineleyin.
- İkincil antikorlar % 5 eşek serum 1 50 µL içinde seyreltilmiş içeren yeni bir kuyu pancreatoids transfer x PBST. Plaka ışıktan korumak ve 4 oC, en iyi şekilde 24 saat (en az 12 h ama en fazla 36 saat) için sallanan yer.
Not: Malzeme tablo ve DAPI nükleer counterstain listelenen tüm ikincil antikorlar wholemount boyama için uygundur. - 1 x PBST ve kaya, oda sıcaklığında 1'deki üç yıkar, toplam 30 dk. tekrar 100 µL içeren yeni bir kuyu pancreatoids transfer x PBST. Üçüncü ve son yıkama eklemek 300 nM DAPI.
- Son olarak, temiz PBS ve 4 oC confocal mikroskobu tarafından Imaging önce bir haftaya kadar ışık için en iyi sonuçları görüntüleme hemen sonra boyama geldi rağmen korunuyorsunuz mağazasında 100 µL yerleştirin. Görüntüleme sırasında pancreatoids hareketi engellemek, ancak kurumasını önlemek için her pancreatoid PBS 20 µL damlacık yerleştirin. Pancreatoids hala kalmaz, PBS ses azaltın.
- Birincil antikorlar % 5 eşek serum 1 50 µL içinde seyreltilmiş içeren yeni bir kuyu pancreatoids transfer x PBST. En iyi şekilde, rock 4 oC 24 h (en az 12 h ama en fazla 36 saat) için.
- Donmuş bölümleri için pancreatoids PBS % 30 sükroz çözüm gecede 4 EyC. içine transfer
- Bir kabarcığın diseksiyon mikroskop altında gömme medya ekleyin. Mikroskobik kontrol altında forseps kullanarak, pancreatoids hafifçe gömme medya yoluyla birkaç kez bir doku blok dondurulmuş gömme medya ile aktarmadan önce kalan sükroz kaldırmak için iterek emmek.
- Kuru kadar donmuş buz blokta doku ve Bölüm 8 µm, cryostat yerleştirin.
Not: Bölümler-80 oC veya immunostained hemen depolanabilir. - Kuru kadar yaklaşık 5 min için oda sıcaklığında erimek için-80 oC bölümleri sağlar. Hidrofobik pap kalemi doku ve % 5 eşek serum 1'seyreltilmiş kullanarak blok etrafında bir hidrofobik bariyer çizmek için oda sıcaklığında 30 dk x PBST.
- Medyayı çıkarın ve birincil antikorlar % 5 eşek serumda PBST gecede 4 EyC. 1 x seyreltilmiş seyreltilmiş hemen yerine
- Birincil çözümü kaldırmak ve yıkama doku üç kez ile 1 x PBST 10 dk için. Bunu 1'seyreltilmiş %5 eşek serumda seyreltilmiş ikincil antikor çözüm ekleyin x PBST oda sıcaklığında 1 h için ve slaytlar ışıktan korumak.
- İkincil çözümü kaldırmak ve yıkama slaytlar üç kez 1 ' x PBST 10 dk için. Son yıkama 300 eklemek nM DAPI.
- Medyayı çıkarın ve montaj medya ve bir coverslip ekleyin. Mağaza 4 oC ışıktan uzak görüntü için hazır kadar slaytlar.
4. transkript analiz için Pancreatoids gelen RNA izolasyon
- Borosilikat kılcal bir ağız pipet ile bir filtre uygulanmış 1.000 µL pipet ucu kısırlık ve yer için 500 µL asit guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform çözüm bir 1,5 mL tüp içine bağlı kullanarak pancreatoids toplamak. -80 oC depolamak veya hemen RNA izolasyon için ilerlemek.
- RNA izolasyonu için gerekirse örnekleri buz çözme ve kloroform 100 µL ekleyin. Girdap iyi ve yerinde 4 oC 15 dakika süreyle santrifüj 4 oC. önceden serin
- Tüpler santrifüj ve 20 dk 4 oC., 12.000 g de tur içine koyun
- Tüpler katmanları ayrılması değil rahatsız etmek için dikkatli bir şekilde çıkarın. 200 µL pipet kullanarak, açık sulu çözüm toplamak ve küçük bir miktar beyaz protein katman ve pembe DNA katmanı arabelleğe bırakarak yeni bir 1,5 mL tüp içine yerleştirin. Bu süreçte bir şey için pipet ucu dokunma ve 1,5 mL tüp duvarlara dokunma.
- % 100 isopropanol 500 µL sulu katman ve girdap içeren yeni tüp ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dk, buz üzerinde daha uzun veya en fazla yağış oturmak izin bırakın gecede-20 oC.
- RNA cips için 4 oC de 15 dakika 12.000 g, santrifüj kapasitesi. İsopropanol Pelet bozmadan kaldırın.
Not: pancreatoids küçük olduğu için bu pelet görünür olmaması olasıdır. - Soğuk, % 75 etanol ekleyin ve tüp birkaç kez tersine çevirin. Santrifüje yerleştirin ve 9000 x g 10 dk 4 oC. Kaldır az için etanol ve spin 9000 x g de 2 min için spin.
- 200 µL pipet Pelet bulunan bölge bağlantı kurmadan tüpte kalan herhangi bir etanol kaldırmak için kullanın. Kap buharlaşma kalıntısı etanol sağlamak için oda sıcaklığında 5-10 dk Tube açık bırakın.
- Pelet içinde temiz, nükleaz ücretsiz su 20 µL vortexing tarafından resuspend.
İsteğe bağlı: Isı RNA, 65 oC 3 dk ve hemen buz için dönün. RNA-80 oC depolanan veya hemen ters transkripsiyon ve qPCR için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare embriyolar rahim boynuz dan e10.5, dikkatli diseksiyon PBS hasarsız embriyo için daha fazla diseksiyon (Şekil 1A) verim. Gastrointestinal sistem verimli bir şekilde dorsal pankreas bud bağırsak ve mide (Şekil 1C-F), muhakeme izin embriyo (Şekil 1B), kaldırılabilir. E10.5 pankreas bud daha önce karakterize; ataları Pdx1, Sox9, Ptf1a ve Hes120,21,22,23hızlı. Doku işleme adımlarını Disosiye pankreas tek hücreleri veya hücre küçük gruplar ışık mikroskobu (Şekil 1G-H) tarafından görüntülenmiştir.
Organogenesis medya, bu serbest yüzer, iskele içermeyen hücreler kendi kendine montaj ve büyümek ve Kültür (Şekil 2A) en az on gün devam üç boyutlu pancreatoids organize etmek. Pancreatoids dallanma morfogenez meydana gelen ile vivo pankreas, morfolojik benzerlikleri var. Transgenik fareler kullanarak, farklı hücre tipleri veya işlemleri gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Örneğin, Ins1-eGFP24 fareler endokrin beta hücreleri oluşumu işaretlemek için kullanarak, pancreatoids beta hücre gelişimi (Şekil 2B) görselleştirmek için günlük olarak yansıması. Ayrıca, değiştirmek aşağıdaki sonuçlara yolaçabilir kültür koşulları, ekleyerek küçük moleküller, uyuşturucu veya genom manipüle, sadece hücre kader tayini tespit edilebilir ama yapısı ve morfoloji değişiklikler de soruşturma olmaktır. İşte yüksek konsantrasyonda protein kinaz C harekete geçirmek phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) uygulama göstermektedir (160 nM), hangi pancreatoids, gevşek lider geliştirme morfolojisi değiştirir ve epitel hücreleri ilişkili dallanma arttı 19 (Şekil 2C).
Pankreas epitel hücreleri pankreas Mezenşim dokusu ilişkilendirmesini değerlendirmek için immunostaining her doku işaretleri için gerçekleştirilebilir. Kanal marker, DBA25,26, endokrin bir işaretleyici, Chga27ve DAPI tarafından işaretlenmiş çekirdekleri ile Immunostaining pancreatoids (Şekil 3A) çoklu soy oluşumu ortaya koyuyor. Mezenşim marker, Vimentin, pankreas progenitör işaretçisiyle birlikte lekeli (e9.0 yaklaşık e15.5 için) Pdx1, gösterir Mezenşim pancreatoid (Şekil 3B) zarf. Immunostaining aynı zamanda Pdx1 ifşa dallanma yapıları, hem de hücre tiplerinin ilgi farklı işaretleri ile morfolojisi incelemek için kullanılabilir. Şekil 3' teC, biz epitel marker Pdx1 ve beta hücre işaretçisi Ins. kullanma qPCR analizi, ataları transkript için boyama ve hücreleri ayırt beta hücre gelişimi görselleştirmek bir değerlendirildi, yaratıcı genlerin gibi Pdx1 ve Hes1 ve farklılaştırılmış kaleme Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1 ve Ins1 (Şekil 4).
Resim 1: anahat diseksiyon, ayrılma, ve e10.5 pankreas ataları pancreatoid üretimi için kaplama. (A) aydınlık alan görüntü e10.5 embriyo. (B) sol üst başlayarak diseksiyon prosedürünün şematik. Kırmızı, yeşil bölge gastrointestinal sistem ise kesmeye bölgeleri kesik çizgilerle gösterilir. İlk olarak, baş forelimb tomurcukları kaldırılması ve organizma tarafında açılış ardından kaldırılır. (C) gastrointestinal sistem dikkatle, belgili tanımlık arazi ventral bölgesinden çıkıntılı kalp ve karaciğer tomurcukları ile kaldırılır. Mide, dorsal pankreas bud ve bağırsak, aydınlık alan resimdeki gösterildiği gibi görüntülenmeyecektir. (D) çıkarılması kalp ve karaciğer tomurcukları. Şematik solda ve aydınlık alan görüntü sağ tarafta. Bud diseksiyon için ortaya çıkarmak için (E) Pinching dorsal pankreas bud etrafında doku. Şematik solda ve aydınlık alan görüntü sağ tarafta. (F) aydınlık alan mikroskobu altında dorsal pankreas bud ile gastrointestinal sistem. Soldaki resimde forseps zaman omurilik bölgesinden gastrointestinal sistem ayırma yerleştirilebilir nerede bağırsak bend görülür. Sağ tarafta, her iki dorsal ve ventral pankreas tomurcukları yüksek büyütme aydınlık alan görüntü gösterir. Dorsal pankreas bud ve doku ayrılma, resuspension organogenesis medya, önce işleme ve kaplama (G) kaldırma. (H) aydınlık alan görüntü hemen sonra kaplama Disosiye hücreleri gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Pancreatoids zaman içinde izleme. (A) 1 gün, 2 gün ve gün 3 pancreatoids görüntülerin aydınlık alan. Ölçek çubukları = 100 um. (B) pankreas morfogenez araştırmak için kültür koşulları manipülasyon. Burada, PMA yüksek düzeyde ek olarak 1 ve 2 gün aydınlık alan mikroskobu tarafından görüntülenmiştir gevşetti epitel yapısı ve artan dallanma, yol açar. Ölçek çubukları 4 gün, 5 gün, günde 6, 7 gün ve eGFP yeşil belirttiği gün 9, beta hücre gelişimi ile 100 µm. (C) Ins1-eGFP fare pancreatoids =. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Pancreatoids Immunostaining. (A) Immunostaining pancreatoid günde 5 DBA yeşil ve DAPI tarafından mavi renkle işaretlenmiş çekirdeği Chga tarafından kırmızı, endokrin hücrelerde tarafından kanalları işaretlemek için. (B) Immunostaining pancreatoid Pdx1 tarafından kırmızı ve pankreas ataları yeşil içinde Vimentin tarafından Mezenşim işaretlemek için 7 gün. (B) Immunostaining pancreatoid gün 7 beta hücreleri tarafından insülin yeşil kırmızı ve pankreas ataları Pdx1 tarafından işaretlenecek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Transkript analiz. 7. gün pancreatoids işaretleri ataları ve farklılaştırıcı hücre kantitatif PCR. Karşılaştırma için in vivo fare doku Scavuzzo ve ark. içinde gösterilir (2017). sonuçları Gapdhiçin normalleştirilmiş. N = 2, ölçek çubukları çoğu SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bileşen | Kısaltma | Son konsantrasyonu |
| Penisilin-streptomisin | P/S | % 1 |
| FBS ücretsiz medya ek | % 10 | |
| Beta-Mercaptoethanol | bME | 0,1 mM |
| Phorbol 12-Myristate 13-asetat | PMA | 16 nM |
| Y-27632 ya da kaya inhibitörü | RI | 10 uM |
| Epidermal büyüme faktörü | EGF | 25 ng/mL |
| R-Spondin1 | - | 500 ng/mL |
| asidik Fibroblast büyüme faktörü, Fibroblast büyüme faktörü 1 | aFGF, FGF1 | 25 ug/mL |
| Heparin sodyum tuzu | Heparin | 2 U/mL |
| Fibroblast büyüme faktörü 10 | FGF10 | 100 ng/mL |
| Dulbecco'nın kartal orta/besin karışımı F-12 modifiye | DMEM/F12 | 5 mL |
Tablo 1. Organogenesis medya.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre kültür modelleri ilerlemesini düzgün geliştirme modeli, klinik hücre tipleri, test ilaç etkinliğini veya hastalara bile nakli üretmek için çok önemlidir. Biz hala organogenesis ve Fizyoloji mekanizmaları anlama çok uzak olduğu gibi ancak, yapay bir tabak içinde kalkınma recapitulating meydan okuyor içinde vivo. Böylece vitro hücre verimsiz oluşturulan, tam olarak fonksiyonel değil, uzun bir süre için muhafaza edilmesi veya diğer anormallikler vücuttaki karşılaştırılabilir hücrelerden liman. Geliştirme ve Fizyoloji etkilemek için karmaşık morfogenetik değişiklikler meydana iken birçok farklı hücre tipleri etkileşim olmasıdır. Vitro kolaylık birleştirerek geliştirme nasıl gerçekleştiği bir anlayış kazanıyor in vivo geliştirme karmaşıklığına korurken sistemleri Biyomedikal araştırmalar için değerli bir araç vermek.
Organoids geliştirme karmaşıklığı modelleme doğru umut verici bir cadde gelişmedir. Bu protokol için nasıl pancreatoids, hangi yerli Mezenşim korumak ve de olsa pancreatoids glikoz yanıt verdiğini gösteren değil sağlam endokrin hücreler üretmek olarak adlandırdığı pankreas organoids yapmak için anahat. Bu aracın işlevselliği yanı sıra geliştirme mekanizmalarının vivo içindebulunan doku heterojen tutar bir kültür sistemi içinde araştırmak için kullanılabilir. Ayrıca, bu genetik ekranlar için veya ekran küçük moleküller veya ilaçlar kullanılabilir. Test aday ilaçlar nispeten homojen hücre kültür sistemlerindeki diğer yakından ilişkili hücre tipleri bu bileşiklerin etkilerini aşmak gibi bu özellikle ilginçtir.
Bu iletişim kuralı sırasında çeşitli kritik adımlar vardır. İlk olarak, embriyolar rahim üzerinden dikkatli kaldırılması önemlidir embriyo zorla dışarı çekerek karın bölgesi rip ve pankreas bud (adım 1.3) elde etmek için gastrointestinal sistem ayırt zorlaştırır. Aşırı doku alarak diğer hücre tipleri (adım 1.4.4) farklılaşma için neden olabilir pankreas bud gastrointestinal sistem üzerinden ikinci, temiz diseksiyon, çok önemlidir. Bunu yapmak için pankreas bud pinch ve pankreas bud yalıtma önce overlaying doku kaldırmak önemlidir. Son olarak, tomurcukları dispase geri yıkamak için PBS taşırken, borosilikat kılcal tüp kullanmak için ve tüp açılış kenarına dokunmak doku izin şarttır, aksi takdirde, doku tüp (adım 1.5.1) ucuna kadar sopa olacak. Bunu önlemek için tomurcuk tomurcuk tüp içine yerine dış gitmek izin doğru taşımadan önce ağız pipetting çözüm başlar.
Bu yöntem bir 3D pancreatoid endokrin hücrelerde oluşumu izin verir, ancak, epitel dallanma diğer mevcut protokolleri16,17daha daha sınırlıdır. Form endokrin insülin üreten hücreleri iken, daha fazla, onlar glikoz yanıt verdiğini gösteren değil. Böylece, daha fazla bu hücreler olgunlaşma soruşturma değerli bilgiler hem de fonksiyonel pancreatoids yanı sıra beta hücre üretimi alanında üretimi genel olarak sağlar.
Pancreatoids nesil bu endokrin hücreleri geliştirmek, ve, gelecekte, bu glikoz yanıt elde etmek için şeker hastalığı tedavisi için potansiyel etkileri vardır. Diyabet aday rejeneratif tedavisi pankreas beta hücreleri kayıp ya da işlevsel olmayan ve bu hücreler yerine potansiyel hastalık komplikasyon hafifletmek olabilir gibidir. İlerleme hPSCs beta hücreleri, ancak, diyabet ayırt yapılmış, çoğu zaman diğer hücre tipleri pankreas beta hücreleri, Alfa hücreleri veya acinar hücreleri28,29, de dahil olmak üzere birlikte işlev bozuklukları 30,31,32. Böylece, yeni pankreas doku nakli için üreten tam olarak tutulmuş doku değiştirebilirsiniz. Fare pancreatoid oluşumu ve işleyişi ek soruşturma ile gelişimsel yörünge hPSCs dışında insan pancreatoids oluşturmak için taklit. Bu insan pancreatoids ekrana ve rejeneratif terapi uyuşturucu bir hastaya özgü bağlamda kavramaları için Kişiselleştirilmiş tıp için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Jolanta Chmielowiec Protokolü ve el yazması ile ilgili yararlı tartışma için teşekkür ediyoruz. Biz de Benjamin Arenkiel erişim confocal mikroskop için teşekkür ederim. Bu eser NIH (M.B. için P30-DK079638) ve T32HL092332-13 M.A.S ve M.B., McNair tıbbi Vakfı (M.B.) ve confocal özünde BCM fikri ve gelişme bozuklukları Araştırma Merkezi tarafından desteklenmiştir (NIH U54 HD083092 Eunice üzerinden Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan gelişimi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al.
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D.
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
