Summary

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

Published: June 02, 2018
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van insuline 3D lymfkliertest pancreatoids uit de alvleesklier progenitoren vrij zwevende e10.5 losgekoppeld en de bijbehorende mesenchym uitdrukken.

Abstract

De alvleesklier is dat een complex orgaan samengesteld uit vele verschillende soorten cellen die samenwerken om bloed glucose homeostase en spijsvertering te regelen. Deze celtypen behoren enzym-afscheidende acinaire cellen, een arborized ductaal systeem verantwoordelijk voor het vervoer van enzymen aan de gut en hormoon-producerende endocriene cellen.

Endocriene beta-cellen zijn de enige celtype in het lichaam die insuline tot lagere niveaus van de glucose van het bloed. Diabetes, een ziekte die wordt gekenmerkt door het verlies of de disfunctie van de beta-cellen, is het bereiken van epidemische proporties. Het is dus essentieel om protocollen voor het onderzoek naar bèta-cel ontwikkeling die kan worden gebruikt voor screeningonderzoek voor het afleiden van de drug en cel-gebaseerde therapeutics. Terwijl het experimentele onderzoek van muis ontwikkeling essentieel is, zijn in vivo studies moeizaam en tijdrovend. Gekweekte cellen bieden een handiger platform voor screening; Nochtans, zijn zij niet in staat om de cellulaire diversiteit, architecturale organisatie en cellulaire interacties gevonden in vivo. Het is dus essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe instrumenten voor het onderzoek naar alvleesklier organogenese en fysiologie.

Alvleesklier epitheliale cellen ontwikkelen in de nauwe samenwerking met mesenchym vanaf de aanvang van de organogenese als cellen organiseren en in de complexe, fysiologisch bevoegde volwassen orgel differentiëren. De alvleesklier mesenchym biedt belangrijke signalen voor de endocriene ontwikkeling, waarvan vele niet goed nog, dus moeilijk begrepen zijn te recapituleren tijdens de in vitro cultuur. Hier beschrijven we een protocol bij cultuur three-dimensional, cellulaire complexe muis organoids die mesenchym behouden, pancreatoids genoemd. De e10.5 lymfkliertest alvleesklier kiem is ontleed, losgekoppeld en gekweekt in een scaffold-vrije omgeving. Deze zwevende cellen monteren zelf met mesenchym onder omslag steken de ontwikkelende pancreatoid en een robuust aantal endocriene beta-cellen ontwikkelen en de acinaire cellen van de buis. Dit systeem kan worden gebruikt om te studeren van de cel lot vastberadenheid, structurele organisatie, en voedselproductie, cel-cel interactie tijdens organogenese, of voor de drug, klein molecuul of genetische screening.

Introduction

De mechanismen van de normale ontwikkeling en de Fysiologie uitgezet is primordiaal te begrijpen van de etiologie van de ziekte en behandelingsmethoden uiteindelijk te cultiveren. Kweken en differentiatie van stamcellen maakt het snel en high-throughput analyse van de ontwikkeling, het wordt beperkt door de bestaande hoeveelheid kennis met betrekking tot de mechanismen tot regeling van de cel lot en kunstmatig recapituleert ontwikkeling in een relatief homogene, tweedimensionale staat1,2. Niet alleen biedt in vivo ontwikkeling beïnvloed door Extrinsieke invloeden, met verschillende soorten cellen in de niche en milieu paracrine signalen en organisatorische steun te loodsen organogenese, maar de functie van deze cellen beroept zich ook op hun omgeving voor begeleiding3,4,5. Gezien het belang van deze externe signalen, de beperkingen van differentiatie protocollen en het moeizame karakter van in vivo muismodellen, zijn nieuwe systemen nodig om de fundamentele ontwikkelings processen en fysiologie experimenteel te onderzoeken.

De opkomst van protocollen voor het genereren van driedimensionale, complexe organoids biedt een handige en congruent systeem om te studeren organogenese, fysiologie, drug werkzaamheid en zelfs pathogenese. Tot vaststelling van lymfkliertest organoids voor verschillende systemen zoals de maag6 en darm7 hebben ons begrip van de organogenese uitgebreid, die een tool om te bestuderen van ontwikkelingsstoornissen complexiteit met minder beperkingen dan in vivo bieden: en in vitro modellen. Vanwege deze vooruitgang in de lymfkliertest organoid formatie en de komst van menselijke pluripotente cellen, menselijke intestinale8, retinale9, renale10,11, en cerebrale12 organoids zijn vervaardigd, en dit repertoire wordt alleen beperkt door de bestaande kennis over de mechanismen van ontwikkeling.

Van bijzonder belang is de generatie van de alvleesklier organoids, zoals een groot aantal ziekten verschillende alvleesklier celtypes teistert, met inbegrip van acinaire cellen en leidingen in exocrine alvleesklier insufficiëntie13, acinaire cellen van pancreatitis14, en beta cellen in diabetes15. Verwerven van kennis met betrekking tot de ontwikkeling van deze verschillende soorten cellen zou helpen bij het begrijpen van hun pathologie en kan ook fungeren als een platform voor gepersonaliseerde drug screening of transplantatie. Eerder, Greggio et al. een methode ontwikkeld om lymfkliertest alvleesklier organoids die in vivo morfogenese recapituleren en ontwikkelen van georganiseerde, driedimensionale, complexe structuren, samengesteld uit alle belangrijke alvleesklier epitheliale cel maken 16,17soorten. Dit is een belangrijke stap voorwaarts in de alvleesklier veld, met name als maken cellen in vitro biologische onderzoek van bèta-cel ontwikkeling kunt inschakelen. Echter een schaarste van de endocriene cellen gevormd in dit protocol, tenzij de organoids waren in weefsel, waar de niche zou kunnen communiceren en bieden instructievideo signalen17getransplanteerd. Het mesenchym vormt het grootste gedeelte van de niche, zwaar onder omslag steken de ontwikkelende epitheel van de vroege stadia van de organogenese aan latere stadia, met inbegrip van endocriene delaminatie en differentiatie3,4, 18. De interactie van het mesenchym met de ontwikkelingslanden alvleesklier is nog een ander voorbeeld van Extrinsieke signalering en het belang van het behoud van in vivo cellulaire complexiteit te bestuderen van de organogenese.

Hier beschrijven we hoe te genereren van driedimensionale alvleesklier organoids, pancreatoids, van gedissocieerde e10.5 lymfkliertest alvleesklier progenitoren genoemd. Deze pancreatoids behouden van inheemse mesenchym, zelf monteren in zwevende voorwaarden en alle grote alvleesklier celtypes, met inbegrip van een robuust aantal endocriene beta cellen19genereren. Deze aanpak is geschikt voor de analyse van de ontwikkeling van het endocriene, zoals eerdere protocollen robuuste endocriene differentiatie ontbreken. Echter, met behulp van het protocol voor alvleesklier organoids zoals beschreven door Greggio et al. beter voor de analyse van de alvleesklier epitheliale vertakking en voedselproductie geschikt is, als vertakking beperkter is in pancreatoids.

Protocol

Alle dierproeven in deze methode beschreven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Baylor College of Medicine. 1. bereiding van muis embryonale dag 10.5 alvleesklier voorlopercellen Opmerking: Dit protocol hoeft niet te worden gevolgd onder steriele omstandigheden tot stap 2, maar het is optimaal steriliseren dissectie tools te spuiten met 70% ethanol vóór gebruik. Als u wilt instellen voor dissectie, vul een ijsemme…

Representative Results

Zorgvuldige dissectie van muis embryo’s bij e10.5 van de baarmoeder hoorn moet onbeschadigd embryo’s in PBS voor verdere dissectie (Figuur 1A) opleveren. Het maag-darmkanaal kan efficiënt worden verwijderd van het embryo (Figuur 1,B), het toelaat van onderscheidingsvermogen van de dorsale alvleesklier toppen op de kruising van de darm en maag (Figuur 1C-F</s…

Discussion

De progressie van cel cultuur modellen is cruciaal voor goed model ontwikkelen, produceren klinisch relevante celtypes, test drug werkzaamheid of zelfs transplantatie aan patiënten. Echter kunstmatig Recapitulerend ontwikkeling in een schotel is een uitdaging zoals we zijn nog lang niet het begrip van de mechanismen van de organogenese en fysiologie in vivo. In vitro cellen zijn dus inefficiënt gegenereerde, niet volledig functioneel, kunnen worden gehandhaafd voor langere tijd, of haven van andere af…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Jolanta Chmielowiec voor nuttige discussie over het protocol en het manuscript. Wij danken ook Benjamin Arenkiel voor toegang tot de confocal microscoop. Dit werk werd gesteund door de NIH (P30-DK079638 naar M.B.) en T32HL092332-13 M.A.S. en M.B., de McNair medische Stichting (M.B.) en de confocal kern op de BCM intellectuele en ontwikkelingsstoornissen Research Center (NIH U54 HD083092 van de Eunice Kennedy Shriver nationale Instituut van kind gezondheid en menselijke ontwikkeling).

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes Sigma-Aldrich A5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free water ThermoFisher D119
Borosilicate Capillary Tubes Sutter Instruments GB1007515 O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2 Sigma-Aldrich C5080
Cell-Repellent 96-Well Microplate Greiner Bio-One 650970 U-bottom
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5401000013
Chloroform Sigma-Aldrich 233306
Chromogranin-A antibody Abcam ab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60 Leica
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10310
Countess Cell Counter Slides Invitrogen C10312
CryoStar NX70 ThermoFisher 957000L
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) Roche 10 236 276 001 Powder
DBA antibody Vector Lab RL-1032
Dispase II, Powder Gibco 17105041
DMEM/F-12, HEPES Gibco 11330032
Dnase I Invitrogen 18068-015
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor) Sigma-Aldrich E9644
Ethanol, 200 Proof Decon Laboratories 2716
Forma Steri Cycle CO2 Incubators ThermoFisher 370
Fluoromount-G Southern Biotech OB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
INSM1 Antibody Santa Cruz BioTechnology sc-271408 Polyclonal Mouse IgG
Isopropanol Fisher a4164
Isothesia Isoflurane, USP Henry Schein 11695-6776-2
Insulin Antibody Dako A056401 Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST Universal KAPA Biosystems KK4618
KCl KaryoMax 10575090
KnockOut Serum Replacement Invitrogen 10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal Leica
MgCl2 Sigma-Aldrich 442615
Mouse C-Peptide ELISA ALPCO 80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA ALPCO 80-INSMSU-E01
MX35 Microtome Blades ThermoFisher 3052835
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma-Aldrich S3817
NaH2PO4 Sigma-Aldrich
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS 1X Corning 21-040-CV
Pdx1 antibody DSHB F6A11 Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds VWR 15160-157
Penicillin-Streptomycin Solution Corning MT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) Sigma-Aldrich P1585
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22431081 1.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 Protein R&D Systems 345-FG
Recombinant Human FGF-Acidic Peprotech 100-17A
Recombinant Human R-Spondin I Protein R&D Systems 4546-RS
BenchRocker 2D Benchmark BR2000
Sucrose 500g Sigma-Aldrich S0389
SuperFrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Super Pap Pen Electron Microscopy Sciences 71310
Thermomixer R Eppendorf 05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018
TrypLE Express Invitrogen 12604039 (1x), no Phenol Red
Trypan Blue Stain Invitrogen 15250061 For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200072 Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate Corning 3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well Corning 4520
Vimentin Antibody EMD Millipore AB5733 Polyclonal Chicken IgY
Vortex Genie BioExpres S-7350-1
Y-27632 Dihydrochloride R&D Systems 1254 Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss

References

  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
  3. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  4. Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
  5. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  6. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  9. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  10. Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
  11. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  12. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  13. Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
  14. Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
  15. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  16. Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
  17. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
  18. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  19. Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
  20. Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
  21. Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
  22. Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
  23. Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
  26. Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
  27. Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
  28. Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
  29. Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
  30. Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
  31. Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
  32. Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).

Play Video

Cite This Article
Scavuzzo, M. A., Teaw, J., Yang, D., Borowiak, M. Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro. J. Vis. Exp. (136), e57599, doi:10.3791/57599 (2018).

View Video