Summary

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

Published: June 02, 2018
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole pour produire de l’insuline exprimant 3D pancreatoids murin de progéniteurs pancréatique flottant e10.5 dissocié et le mésenchyme associé.

Abstract

Le pancréas est qu’un organe complexe composé de plusieurs types de cellules différentes qui travaillent ensemble pour réguler la digestion et l’homéostasie du glucose du sang. Ces types de cellules comprennent des cellules acineuses sécrétant des enzymes, un système canalaire arborisé responsable pour le transport des enzymes de l’intestin et productrices de l’hormone des cellules endocrines.

Bêta-cellules endocrines sont le type de cellule unique dans le corps qui produisent l’insuline pour abaisser la glycémie. Le diabète, une maladie caractérisée par une perte ou à la dysfonction des cellules bêta, atteint des proportions épidémiques. Ainsi, il est essentiel d’établir des protocoles afin d’étudier le développement des cellules bêta qui peut être utilisé pour des fins de dépistage pour dériver de la drogue et les thérapies cellulaires. Alors que l’étude expérimentale du développement chez la souris est essentielle, des études in vivo sont laborieux et fastidieux. Les cellules cultivées fournissent une plate-forme plus commode pour le dépistage ; Cependant, ils sont incapables de maintenir la diversité cellulaire, organisation architectonique et interactions cellulaires trouvées in vivo. Ainsi, il est essentiel de développer de nouveaux outils pour étudier la physiologie et l’organogénèse du pancréas.

Les cellules épithéliales du pancréas développent en étroite association avec mésenchyme dès le début de l’organogenèse comme cellules organisent et se différencient en l’organe adulte complexe, physiologiquement compétent. Le mésenchyme pancréatique fournit des signaux importants pour le développement du système endocrinien, dont beaucoup ne sont pas bien compris encore, donc difficile de récapituler au cours de la culture in vitro . Nous décrivons ici un protocole à la culture souris complexes en trois dimensions, cellulaire organoïdes qui conservent le mésenchyme, appelé pancreatoids. Le bourgeon du pancréas murin e10.5 est disséqué, dissocié et cultivé dans un environnement sans échafaudage. Ces cellules de flottants s’auto-assembler avec mésenchyme enveloppant le pancreatoid en développement et quelques robustes de bêta-cellules endocrines, développant ainsi que l’acineuses et les cellules de la gaine. Ce système peut être utilisé pour étudier les interactions cellulaires sort détermination, organisation structurelle et morphogenèse, cellules pendant l’organogenèse, ou pour la drogue, petite molécule ou dépistage génétique.

Introduction

Délimiter les mécanismes du développement normal et la physiologie est primordiale pour comprendre l’étiologie de la maladie et de cultiver en fin de compte les méthodes de traitement. Alors que la mise en culture et la différenciation des cellules souches permettent une analyse rapide et haut débit de développement, il est limité par l’acquis des connaissances sur les mécanismes de régulation sort de la cellule et récapitule artificiellement le développement dans un relativement un État homogène, deux dimensions1,2. Non seulement en vivo développement touché par des influences extrinsèques, avec différents types de cellules dans la niche et le milieu fournit des signaux paracrines et soutien organisationnel pour guider l’organogenèse, mais la fonction de ces cellules s’appuie également sur leur cadre d’orientation3,4,5. Compte tenu de l’importance de ces facteurs externes, les limitations des protocoles de différenciation et la nature laborieuse des modèles de souris in vivo , nouveaux systèmes sont nécessaires pour étudier expérimentalement physiologie et processus de base du développement.

L’émergence des protocoles pour générer organoïdes Three-Dimensional, complexe fournit un système commode et congruent pour étudier l’organogénèse, la physiologie, l’efficacité du médicament et même pathogenèse. Établissement organoïdes murin pour différents systèmes tels que l’ estomac de6 et l’intestin7 ont élargi notre compréhension de l’organogenèse, fournissant un outil pour étudier les complexités du développement avec moins de restrictions que en vivo et les modèles in vitro . En raison de ces avancées dans la murine organoïde formation et l’avènement de pluripotentes humaines découlent cellules, intestinale humaine8, rétinienne9, rénale10,11, et cérébral12 organoïdes ont été produites et ce Répertoire est seulement limitée par les connaissances actuelles concernant les mécanismes de développement.

Un intérêt particulier est la génération de pancréatique organoïdes, comme les types différents de cellules pancréatiques, y compris les cellules acineuses et conduits à l’insuffisance pancréatique exocrine13, cellules acineuses dans la pancréatite14, sévit dans une multitude de maladies et cellules bêta dans le diabète15. Acquérir des connaissances concernant l’évolution de ces différents types de cellules puisse aider à comprendre leur pathologie et peut, aussi, servir de plate-forme pour le dépistage des drogues personnalisée ou de la transplantation. Auparavant, Greggio et coll. a développé une méthode pour créer des murins organoïdes pancréatique récapituler en vivo morphogenèse et de développer des structures organisées, en trois dimensions, complexes composés de toutes les principales cellules épithéliales du pancréas types de16,17. Il s’agit d’une avancée majeure dans le domaine du pancréas, surtout en faisant des cellules in vitro pouvez activer investigation biologique du développement des cellules bêta. Toutefois, la rareté des cellules endocrines formé dans le présent protocole à moins que les organoids ont été transplantés dans les tissus, où la niche pourrait interagir et fournir des repères pédagogiques17. Le mésenchyme constitue la plus grande partie de la niche, très enveloppant l’épithélium en développement depuis le début de l’organogenèse aux stades ultérieurs, y compris la délamination endocrinienne et différenciation3,4, 18. L’interaction entre le mésenchyme et le pancréas en développement est encore un autre exemple de signalisation extrinsèque et l’importance de maintenir in vivo la complexité cellulaires pour étudier l’organogenèse.

Nous décrivons ici comment générer en trois dimensions organoïdes pancréatique, appelé pancreatoids, de e10.5 dissociées des progéniteurs pancréatique murine. Ces pancreatoids conserver mésenchyme natif, s’auto-assembler en conditions flottantes et générer tous les types de grandes cellules pancréatiques, dont quelques cellules endocrines de beta19robuste. Cette approche est plus adaptée pour l’analyse du développement endocrinien, comme les protocoles précédents n’ont pas la différenciation endocrine robuste. Cependant, en utilisant le protocole pour organoïdes pancréatique tel que décrit par Greggio et coll. est mieux adapté pour l’analyse de ramification épithéliales du pancréas et de la morphogenèse, comme ramification est plus limitée en pancreatoids.

Protocol

Toutes les expériences animales décrites dans cette méthode ont été approuvées par le Comité utilisation du Baylor College of Medicine et d’institutionnels animalier. 1. préparation des progéniteurs pancréatiques de souris embryonnaires jour 10,5 Remarque : Ce protocole n’a pas à suivre dans des conditions stériles jusqu’à l’étape 2, mais il est optimal pour stériliser les outils de dissection et pulvériser avec avant l’utilisation d’éthano…

Representative Results

Une dissection minutieuse des embryons de souris à e10.5 de la corne utérine devrait produire des embryons intacts dans du PBS pour davantage de dissection (Figure 1A). Le tractus gastro-intestinal peut être efficacement retiré de l’embryon (Figure 1B), permettant de discerner le bourgeon du pancréas dorsal à la jonction de l’intestin et l’estomac (Figure 1</stron…

Discussion

La progression des modèles de culture de cellules est essentielle à l’élaboration d’un modèle correctement, produisent des types de cellules cliniquement pertinents, test de l’efficacité du médicament ou même greffe à des patients. Cependant, récapitulant artificiellement le développement dans un plat est difficile car nous sommes encore loin de comprendre les mécanismes de l’organogénèse et de la physiologie in vivo. In vitro les cellules sont donc générés de façon inefficace, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Jolanta Chmielowiec pour toute question utile concernant le protocole et le manuscrit. Nous remercions également Benjamin Arenkiel d’accès au microscope confocal. Ce travail a été soutenu par les NIH (P30-DK079638 à M.B.) et T32HL092332-13 au M.A.S. et M.B., la Fondation médicale McNair (à M.B.) et le noyau confocal au BCM intellectuelle et Developmental Disabilities Research Center (NIH U54 HD083092 de la Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et le développement humain).

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes Sigma-Aldrich A5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free water ThermoFisher D119
Borosilicate Capillary Tubes Sutter Instruments GB1007515 O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2 Sigma-Aldrich C5080
Cell-Repellent 96-Well Microplate Greiner Bio-One 650970 U-bottom
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5401000013
Chloroform Sigma-Aldrich 233306
Chromogranin-A antibody Abcam ab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60 Leica
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10310
Countess Cell Counter Slides Invitrogen C10312
CryoStar NX70 ThermoFisher 957000L
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) Roche 10 236 276 001 Powder
DBA antibody Vector Lab RL-1032
Dispase II, Powder Gibco 17105041
DMEM/F-12, HEPES Gibco 11330032
Dnase I Invitrogen 18068-015
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor) Sigma-Aldrich E9644
Ethanol, 200 Proof Decon Laboratories 2716
Forma Steri Cycle CO2 Incubators ThermoFisher 370
Fluoromount-G Southern Biotech OB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
INSM1 Antibody Santa Cruz BioTechnology sc-271408 Polyclonal Mouse IgG
Isopropanol Fisher a4164
Isothesia Isoflurane, USP Henry Schein 11695-6776-2
Insulin Antibody Dako A056401 Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST Universal KAPA Biosystems KK4618
KCl KaryoMax 10575090
KnockOut Serum Replacement Invitrogen 10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal Leica
MgCl2 Sigma-Aldrich 442615
Mouse C-Peptide ELISA ALPCO 80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA ALPCO 80-INSMSU-E01
MX35 Microtome Blades ThermoFisher 3052835
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma-Aldrich S3817
NaH2PO4 Sigma-Aldrich
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS 1X Corning 21-040-CV
Pdx1 antibody DSHB F6A11 Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds VWR 15160-157
Penicillin-Streptomycin Solution Corning MT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) Sigma-Aldrich P1585
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22431081 1.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 Protein R&D Systems 345-FG
Recombinant Human FGF-Acidic Peprotech 100-17A
Recombinant Human R-Spondin I Protein R&D Systems 4546-RS
BenchRocker 2D Benchmark BR2000
Sucrose 500g Sigma-Aldrich S0389
SuperFrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Super Pap Pen Electron Microscopy Sciences 71310
Thermomixer R Eppendorf 05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018
TrypLE Express Invitrogen 12604039 (1x), no Phenol Red
Trypan Blue Stain Invitrogen 15250061 For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200072 Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate Corning 3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well Corning 4520
Vimentin Antibody EMD Millipore AB5733 Polyclonal Chicken IgY
Vortex Genie BioExpres S-7350-1
Y-27632 Dihydrochloride R&D Systems 1254 Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss

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Cite This Article
Scavuzzo, M. A., Teaw, J., Yang, D., Borowiak, M. Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro. J. Vis. Exp. (136), e57599, doi:10.3791/57599 (2018).

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