Summary

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

Published: June 02, 2018
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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.

Abstract

Die Bauchspeicheldrüse ist ein komplexes Organ, bestehend aus vielen verschiedenen Zelltypen, die zusammen arbeiten, um Blut-Glukose-Homöostase und die Verdauung zu regulieren. Diese Zelltypen gehören Enzym-sezernierenden acinar Zellen, einem verzweigten ductal System für den Transport von Enzymen, die Darm- und Hormon-produzierende endokrine Zellen verantwortlich.

Endokrine Beta-Zellen sind die einzige Zelltyp im Körper, die produzieren Insulin um den Blutzuckerspiegel zu senken. Diabetes, eine Krankheit, gekennzeichnet durch einen Verlust oder Dysfunktion des Beta-Zellen, erreicht epidemische Ausmaße. Daher ist es unentbehrlich, Protokolle, um Beta-Zell-Entwicklung zu untersuchen, die zu screening-Zwecken verwendet werden können, die Droge und zellbasierte Therapie ableiten. Während die experimentelle Untersuchung der Maus Entwicklung unverzichtbar ist, sind in Vivo Studien mühsam und zeitaufwändig. Kultivierte Zellen bieten eine sehr komfortable Plattform für das Screening; Allerdings sind sie nicht in der Lage, die zellulären Vielfalt, architektonische Organisation und zellulären Interaktionen gefunden zu erhalten in-vivo. Daher ist es wichtig, die Entwicklung neuer Instrumente zur Untersuchung der Pankreas Organogenese und Physiologie.

Epitheliale Zellen der Bauchspeicheldrüse entwickeln in enger Zusammenarbeit mit Mesenchym vom Beginn der Organogenese, wie Zellen zu organisieren und in das komplexe, physiologisch zuständigen Erwachsenen Organ zu unterscheiden. Die Bauchspeicheldrüse Mesenchym bietet wichtige Signale für die endokrine Entwicklung, von die viele auch noch nicht, so schwierig, während der in-vitro- Kultur rekapitulieren verstanden sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Kultur dreidimensionale, zelluläre komplexe Maus Organellen, die Mesenchym, genannt Pancreatoids zu behalten. Die e10.5 murinen Pankreas Knospe seziert, dissoziiert und in ein Gerüst-freie Umgebung kultiviert. Dieser schwimmenden Zellen zusammensetzen selbst, mit Mesenchym umhüllt die Entwicklung Pancreatoid und eine robuste Reihe von endokrinen Beta-Zellen, die zusammen mit den acinar und die Kanal-Zellen entwickeln. Dieses System kann verwendet werden, um die Zelle Schicksal Entschlossenheit, Aufbauorganisation und Morphogenese, Zell-Zell-Interaktionen während der Organogenese, oder für die Droge, kleines Molekül oder genetisches Screening studieren.

Introduction

Abgrenzung der Mechanismen für die normale Entwicklung und die Physiologie ist ausschlaggebend für die Ätiologie der Erkrankung zu verstehen und letztlich Behandlungsmethoden zu kultivieren. Während der Kultivierung und Differenzierung von Stammzellen schnelle und Hochdurchsatz-Analyse der Entwicklung ermöglicht, es ist begrenzt durch die vorhandenen Körper des Wissens über Mechanismen reguliert Zelle Schicksal und künstlich rekapituliert Entwicklung in einem relativ homogene, zweidimensionalen Zustand1,2. Nicht nur in Vivo Entwicklung beeinflusst von äußeren Einflüssen, mit verschiedenen Zelltypen in der Nische und Milieu bietet Parakrine Signale und organisatorische Unterstützung, Organogenese führen, sondern die Funktion dieser Zellen beruht auch auf ihre Umgebung für Führung3,4,5. Angesichts der Bedeutung von diesen externen Cues, die Grenzen der Differenzierung Protokolle und die mühsame Art der in Vivo Mausmodelle, Neuanlagen werden mussten grundlegende Entwicklungsprozesse und Physiologie experimentell zu untersuchen.

Die Entstehung von Protokollen, dreidimensionale, komplexe Organellen zu generieren bietet eine bequeme und kongruente System zur Untersuchung der Organogenese, Physiologie, Wirksamkeit von Medikamenten und sogar Pathogenese. Gründung murine Organellen für verschiedene Systeme wie der Magen6 und Darm7 unser Verständnis der Organogenese ausgedehnt haben, bietet ein Werkzeug, um Entwicklungsstörungen Komplexität mit weniger Einschränkungen als in Vivo Studie und in-vitro- Modelle. Durch diese Fortschritte bei der murinen organoide Bildung und dem Aufkommen der menschlichen pluripotenten Stammzellen Zellen, menschlichen Darm8, retinale9, renal10,11, und zerebralen12 Organellen hergestellt wurden, und dies Repertoire ist nur durch das vorhandene Wissen über die Mechanismen der Entwicklung begrenzt.

Von besonderem Interesse ist die Generation der pankreatischen Organellen, wie eine Vielzahl von Krankheiten verschiedener Pankreas Zelltypen, einschließlich acinar Zellen und Kanälen exokrinen Pankreasinsuffizienz13acinar Zellen in Pankreatitis14, Plagen und Beta-Zellen in der Diabetes-15. Erwerb von Wissen über die Entwicklung dieser verschiedenen Zelltypen konnte helfen beim Verständnis ihrer Pathologie und fungieren darüber hinaus als Plattform für personalisierte Drogentest oder Transplantation. Zuvor, Greggio Et Al. entwickelt eine Methode zum Erstellen von murinen Pankreas Organellen, die in Vivo Morphogenese rekapitulieren und entwickeln organisierte, dreidimensionale, komplexe Strukturen bestehend aus allen wichtigen Pankreas Epithelzelle 16,17-Typen. Dies ist ein großer Schritt nach vorne im Feld Pankreas, vor allem die Zellen in Vitro können biologische Untersuchungen von Beta-Zell-Entwicklung ermöglichen. Jedoch bildeten eine Knappheit von endokrinen Zellen in diesem Protokoll, es sei denn die Organellen in Gewebe transplantiert wurden, wo die Nische könnte interagieren und didaktische Hinweise17. Das Mesenchym bildet den größten Teil der Nische, Kuvertierung stark entwickelnde Epithel von frühen Stadien der Organogenese zu späteren Phasen einschließlich endokrine Delamination und Differenzierung3,4, 18. Das Zusammenspiel von dem Mesenchym mit der entwickelnden Bauchspeicheldrüse ist noch ein weiteres Beispiel für extrinsische Signalisierung und die Bedeutung der Aufrechterhaltung der in Vivo zellulären Komplexität Organogenese zu studieren.

Hier beschreiben wir, wie dreidimensionale Pankreas Organellen, genannt Pancreatoids, von dissoziierten e10.5 murinen Pankreas Stammväter generieren. Diese Pancreatoids behalten native Mesenchym, frei schwebenden Bedingungen selbst zusammensetzen und generieren alle wichtigen Pankreas Zelltypen, einschließlich eine robuste Reihe von endokrinen Betazellen19. Dieser Ansatz eignet sich am besten für die Analyse von endokrinen Entwicklung, da frühere Protokolle robuste endokriner Differenzierung fehlt. Allerdings ist unter Verwendung des Protokolls für Bauchspeicheldrüsenkrebs Organellen wie beschrieben durch Greggio Et Al. ist besser geeignet für die Analyse der pankreatischen epithelialen Verzweigungen und Morphogenese, als Verzweigung in Pancreatoids geringer.

Protocol

Alle Tierversuche, die in dieser Methode beschriebenen stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss des Baylor College of Medicine. 1. Vorbereitung der Maus embryonalen Tag 10.5 Pankreas Stammväter Hinweis: Dieses Protokoll muss nicht erst in Schritt 2, unter sterilen Bedingungen einzuhalten, aber es eignet sich optimal zum Sterilisieren Dissektion Werkzeuge und sprühen Sie mit 70 % igem Ethanol vor dem Gebrauch. Um für die Dissektion…

Representative Results

Sorgfältige Dissektion von mäuseembryonen am e10.5 aus dem uterinen Horn sollte unbeschädigte Embryonen mit PBS-Puffer für weitere Dissektion (Abb. 1A) ergeben. Der Magen-Darm-Trakt kann der Embryo (Abbildung 1B), schönem Unterscheidung der dorsalen Pankreas Knospe an der Kreuzung der Darm und Magen (Abbildung 1C-F) effizient entfernt werden. Di…

Discussion

Produzieren Sie das Fortschreiten der Kultur zellmodelle ist entscheidend für richtig Modellentwicklung, klinisch relevante Zelltypen, Wirksamkeit von Medikamenten oder sogar Transplantation Patienten. Jedoch künstlich Rekapitulation Entwicklung in einer Petrischale ist eine Herausforderung, da sind wir noch weit davon entfernt, das Verständnis der Mechanismen der Organogenese und Physiologie in-vivo. So sind in-vitro- Zellen ineffizient erzeugt, nicht voll funktionsfähig, nicht für längere Zeit b…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Jolanta Chmielowiec für hilfreiche Diskussion über das Protokoll und das Manuskript. Wir danken auch Benjamin Arenkiel für den Zugriff auf confocal Mikroskop. Diese Arbeit wurde unterstützt von der NIH (P30-DK079638, m.b.) und T32HL092332-13, Buchdrucker und m.b., der McNair Medical Foundation (m.b.) und der konfokalen Kern auf das BCM geistigen and Developmental Disabilities Research Center (NIH U54 HD083092 aus dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development).

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes Sigma-Aldrich A5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free water ThermoFisher D119
Borosilicate Capillary Tubes Sutter Instruments GB1007515 O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2 Sigma-Aldrich C5080
Cell-Repellent 96-Well Microplate Greiner Bio-One 650970 U-bottom
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5401000013
Chloroform Sigma-Aldrich 233306
Chromogranin-A antibody Abcam ab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60 Leica
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10310
Countess Cell Counter Slides Invitrogen C10312
CryoStar NX70 ThermoFisher 957000L
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) Roche 10 236 276 001 Powder
DBA antibody Vector Lab RL-1032
Dispase II, Powder Gibco 17105041
DMEM/F-12, HEPES Gibco 11330032
Dnase I Invitrogen 18068-015
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor) Sigma-Aldrich E9644
Ethanol, 200 Proof Decon Laboratories 2716
Forma Steri Cycle CO2 Incubators ThermoFisher 370
Fluoromount-G Southern Biotech OB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
INSM1 Antibody Santa Cruz BioTechnology sc-271408 Polyclonal Mouse IgG
Isopropanol Fisher a4164
Isothesia Isoflurane, USP Henry Schein 11695-6776-2
Insulin Antibody Dako A056401 Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST Universal KAPA Biosystems KK4618
KCl KaryoMax 10575090
KnockOut Serum Replacement Invitrogen 10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal Leica
MgCl2 Sigma-Aldrich 442615
Mouse C-Peptide ELISA ALPCO 80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA ALPCO 80-INSMSU-E01
MX35 Microtome Blades ThermoFisher 3052835
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma-Aldrich S3817
NaH2PO4 Sigma-Aldrich
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS 1X Corning 21-040-CV
Pdx1 antibody DSHB F6A11 Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds VWR 15160-157
Penicillin-Streptomycin Solution Corning MT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) Sigma-Aldrich P1585
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22431081 1.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 Protein R&D Systems 345-FG
Recombinant Human FGF-Acidic Peprotech 100-17A
Recombinant Human R-Spondin I Protein R&D Systems 4546-RS
BenchRocker 2D Benchmark BR2000
Sucrose 500g Sigma-Aldrich S0389
SuperFrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Super Pap Pen Electron Microscopy Sciences 71310
Thermomixer R Eppendorf 05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018
TrypLE Express Invitrogen 12604039 (1x), no Phenol Red
Trypan Blue Stain Invitrogen 15250061 For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200072 Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate Corning 3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well Corning 4520
Vimentin Antibody EMD Millipore AB5733 Polyclonal Chicken IgY
Vortex Genie BioExpres S-7350-1
Y-27632 Dihydrochloride R&D Systems 1254 Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss

References

  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
  3. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  4. Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
  5. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  6. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  9. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  10. Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
  11. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  12. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  13. Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
  14. Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
  15. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  16. Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
  17. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
  18. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  19. Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
  20. Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
  21. Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
  22. Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
  23. Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
  26. Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
  27. Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
  28. Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
  29. Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
  30. Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
  31. Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
  32. Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).

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Scavuzzo, M. A., Teaw, J., Yang, D., Borowiak, M. Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro. J. Vis. Exp. (136), e57599, doi:10.3791/57599 (2018).

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