Summary

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

Published: June 02, 2018
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per generare insulina esprimendo 3D pancreatoids murino da progenitori pancreatici e 10.5 digalleggiante dissociato e mesenchima associato.

Abstract

Il pancreas è che un organo complesso composto di molti diversi tipi di cellule che lavorano insieme per regolare la digestione e l’omeostasi del glucosio di anima. Questi tipi di cellule includono enzima-secrezione delle cellule acinose, un sistema duttale arborized responsabile del trasporto degli enzimi per le cellule endocrine dell’intestino e producono ormoni.

Beta-cellule endocrine sono il tipo di suola delle cellule nel corpo che producono l’insulina per abbassare i livelli di glucosio nel sangue. Diabete, una malattia caratterizzata da una perdita o la disfunzione delle cellule beta, sta raggiungendo proporzioni epidemiche. Quindi, è essenziale stabilire protocolli per studiare lo sviluppo della beta-cellula che può essere utilizzato ai fini dello screening per derivare la droga e le terapie basate su cellule. Mentre l’indagine sperimentale del mouse sviluppo è essenziale, in vivo gli studi sono laboriosa e che richiede tempo. Cellule coltivate forniscono una piattaforma più conveniente per lo screening; Tuttavia, essi sono in grado di mantenere la diversità cellulare, organizzazione architettonica e interazioni cellulari trovati in vivo. Quindi, è essenziale per sviluppare nuovi strumenti per studiare la fisiologia e l’organogenesi pancreatica.

Cellule epiteliali pancreatiche si sviluppano in stretta associazione con mesenchima fin dall’inizio dell’organogenesi come cellule organizzano e si differenziano nell’organo adulto complesso, fisiologicamente competente. Il mesenchima pancreatico fornisce segnali importanti per lo sviluppo del sistema endocrino, molti dei quali non sono buono capiti ancora, così difficile ricapitolare durante la coltura in vitro . Qui, descriviamo un protocollo alla cultura del mouse complesso tridimensionale, cellulare organoids che conservano mesenchima, chiamato pancreatoids. Il germoglio pancreatico murino e 10.5 è sezionato, dissociato e coltivato in un ambiente senza impalcatura. Questi galleggianti cellule assemblarsi con mesenchima avvolgente il pancreatoid in via di sviluppo e un robusto numero delle beta-cellule endocrine, sviluppando insieme l’acinose e cellule del condotto. Questo sistema può essere utilizzato per studiare le interazioni cellula-cellula cellula determinazione di destino, organizzazione strutturale e morfogenesi, durante l’organogenesi, o per la droga, piccola molecola o screening genetico.

Introduction

Delineare i meccanismi dello sviluppo normale e la fisiologia è fondamentale per capire l’eziologia di malattia e coltivare in ultima analisi, metodi di trattamento. Mentre la coltura e la differenziazione delle cellule staminali permette analisi di alto-rendimento e veloce di sviluppo, è limitata dal corpo esistente di conoscenza dei meccanismi che regolano il destino delle cellule e artificialmente ricapitola lo sviluppo in un relativamente omogenea, bidimensionale stato1,2. Non solo è in vivo sviluppo influenzato dai fattori estrinseci, con diversi tipi di cellule nella nicchia e milieu fornendo segnali paracrini e supporto organizzativo per guidare l’organogenesi, ma la funzione di queste cellule si basa anche sulla loro dintorni per orientamento3,4,5. Dato l’importanza di queste indicazioni esterne, le limitazioni dei protocolli di differenziazione e la natura laboriosa di in vivo modelli murini, nuovi sistemi sono necessari studiare sperimentalmente fisiologia e processi di base inerente allo sviluppo.

L’emersione dei protocolli per generare organoids tridimensionale, complesso fornisce un sistema conveniente e congruo per studiare l’organogenesi, la fisiologia, l’efficacia dei farmaci e anche patogenesi. Che istituisce organoids murino per diversi sistemi come lo stomaco6 e intestino7 hanno ampliato la nostra comprensione dell’organogenesi, fornendo uno strumento per studiare la complessità inerente allo sviluppo con meno restrizioni rispetto a vivo e modelli in vitro . A causa di questi avanzamenti nella murino organoid formazione e l’avvento di pluripotenti umane derivano cellule, intestinale umano8, retinica9, renale10,11, e cerebrale12 organoids sono state prodotte e questo repertorio è limitato solo dalla conoscenza esistente per quanto riguarda i meccanismi di sviluppo.

Di particolare interesse è la generazione dei organoids del pancreas, come una miriade di malattie affligge tipi differenti delle cellule del pancreas, compreso le cellule acinose e condotti in insufficienza pancreatica exocrine13, cellule acinose in pancreatite14, e cellule beta nel diabete15. Acquisire conoscenze relative allo sviluppo di questi tipi differenti delle cellule potrebbe aiutare a comprendere la loro patologia e può, inoltre, agire come una piattaforma per lo screening di stupefacenti personalizzati o trapianto. In precedenza, Greggio et al ha sviluppato un metodo per creare organoids pancreatico murino che ricapitolare in vivo morfogenesi e sviluppare strutture organizzate, tridimensionale, complesse composte da tutti i principali delle cellule epiteliali del pancreas tipi di16,17. Si tratta di un importante passo avanti nel campo del pancreas, soprattutto come fare le cellule in vitro possibile attivare indagini biologiche dello sviluppo della cellula beta. Tuttavia, una scarsità di cellule endocrine formata in questo protocollo, a meno che il organoids sono stati trapiantati in tessuto, dove la nicchia potrebbe interagire e fornire spunti didattici17. Il mesenchima costituisce la più grande parte della nicchia, pesantemente avvolgente dell’epitelio in via di sviluppo dalle fasi iniziali dell’organogenesi a fasi successive, tra cui endocrino delaminazione e differenziazione3,4, 18. L’interazione del mesenchyme con il pancreas in via di sviluppo è l’ennesimo esempio di segnalazione estrinseca e l’importanza di mantenere in vivo cellulare complessità per studiare l’organogenesi.

Qui, descriviamo come generare tridimensionale organoids pancreatico, chiamato pancreatoids, da progenitori pancreatico murino dissociate e 10.5. Questi pancreatoids conservare mesenchima nativo, auto-assemblarsi in condizioni di libero di fluttuare e generare tutti i tipi principali delle cellule del pancreas, compreso un robusto numero di cellule endocrine beta19. Questo approccio è più adatto per l’analisi dello sviluppo endocrino, come protocolli precedenti mancano robusta differenziazione endocrina. Tuttavia, utilizzando il protocollo per organoids pancreatico come descritto da Greggio et al è più adatto per analisi di ramificazione epiteliale del pancreas e morfogenesi, come ramificazione è più limitato a pancreatoids.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo metodo sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato del Baylor College of Medicine. 1. preparazione del Mouse giorno embrionale 10.5 progenitori del pancreas Nota: Questo protocollo non ha bisogno di essere seguiti in condizioni sterili fino al passaggio 2, tuttavia è ottima per sterilizzare strumenti di dissezione e spruzzare prima di etanolo al 70% di utilizzare. Per impostare …

Representative Results

La dissezione attenta degli embrioni del mouse alle e 10.5 dal corno uterino dovrebbe produrre embrioni intatti in PBS per ulteriore dissezione (Figura 1A). Il tratto gastrointestinale può essere rimosso in modo efficiente dall’embrione (Figura 1B), permettendo di discernimento del germoglio pancreatico dorsale alla giunzione dell’intestino e dello stomaco (Figura 1…

Discussion

La progressione dei modelli della coltura cellulare è fondamentale per correttamente modello sviluppo, produrre tipi cellulari clinicamente rilevanti, prova l’efficacia dei farmaci o trapianto anche ai pazienti. Tuttavia, artificialmente ricapitola lo sviluppo in un piatto è impegnativo come siamo ancora lontani dal comprendere i meccanismi della organogenesi e fisiologia in vivo. Così le cellule in vitro sono inefficacemente generato, non completamente funzionale, incapace di essere mantenuti per lu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Jolanta Chmielowiec vi ringraziamo utile discussione per quanto riguarda il protocollo e il manoscritto. Ringraziamo anche Benjamin Arenkiel per l’accesso al microscopio confocale. Questo lavoro è stato supportato da NIH (P30-DK079638 a M.B.) e T32HL092332-13-m.a.s. e M.B., il fondamento medico di McNair (a M.B.) e il nucleo confocale al BCM intellettuale e centro di ricerca di inabilità inerenti allo sviluppo (NIH U54 HD083092 dal Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development).

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes Sigma-Aldrich A5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free water ThermoFisher D119
Borosilicate Capillary Tubes Sutter Instruments GB1007515 O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2 Sigma-Aldrich C5080
Cell-Repellent 96-Well Microplate Greiner Bio-One 650970 U-bottom
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5401000013
Chloroform Sigma-Aldrich 233306
Chromogranin-A antibody Abcam ab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60 Leica
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10310
Countess Cell Counter Slides Invitrogen C10312
CryoStar NX70 ThermoFisher 957000L
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) Roche 10 236 276 001 Powder
DBA antibody Vector Lab RL-1032
Dispase II, Powder Gibco 17105041
DMEM/F-12, HEPES Gibco 11330032
Dnase I Invitrogen 18068-015
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor) Sigma-Aldrich E9644
Ethanol, 200 Proof Decon Laboratories 2716
Forma Steri Cycle CO2 Incubators ThermoFisher 370
Fluoromount-G Southern Biotech OB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
INSM1 Antibody Santa Cruz BioTechnology sc-271408 Polyclonal Mouse IgG
Isopropanol Fisher a4164
Isothesia Isoflurane, USP Henry Schein 11695-6776-2
Insulin Antibody Dako A056401 Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST Universal KAPA Biosystems KK4618
KCl KaryoMax 10575090
KnockOut Serum Replacement Invitrogen 10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal Leica
MgCl2 Sigma-Aldrich 442615
Mouse C-Peptide ELISA ALPCO 80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA ALPCO 80-INSMSU-E01
MX35 Microtome Blades ThermoFisher 3052835
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma-Aldrich S3817
NaH2PO4 Sigma-Aldrich
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS 1X Corning 21-040-CV
Pdx1 antibody DSHB F6A11 Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds VWR 15160-157
Penicillin-Streptomycin Solution Corning MT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) Sigma-Aldrich P1585
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22431081 1.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 Protein R&D Systems 345-FG
Recombinant Human FGF-Acidic Peprotech 100-17A
Recombinant Human R-Spondin I Protein R&D Systems 4546-RS
BenchRocker 2D Benchmark BR2000
Sucrose 500g Sigma-Aldrich S0389
SuperFrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Super Pap Pen Electron Microscopy Sciences 71310
Thermomixer R Eppendorf 05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018
TrypLE Express Invitrogen 12604039 (1x), no Phenol Red
Trypan Blue Stain Invitrogen 15250061 For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200072 Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate Corning 3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well Corning 4520
Vimentin Antibody EMD Millipore AB5733 Polyclonal Chicken IgY
Vortex Genie BioExpres S-7350-1
Y-27632 Dihydrochloride R&D Systems 1254 Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss

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Scavuzzo, M. A., Teaw, J., Yang, D., Borowiak, M. Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro. J. Vis. Exp. (136), e57599, doi:10.3791/57599 (2018).

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