Summary

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

Published: June 02, 2018
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para generar insulina expresando 3D pancreatoids murino de e10.5 flotante disociado progenitores pancreático y el mesenchyme asociado.

Abstract

El páncreas es que un órgano complejo compuesto de muchos diferentes tipos de células que trabajan juntas para regular la digestión y la homeostasis de la glucosa de sangre. Estos tipos de células son las células acinares secretoras de enzimas, un sistema ductal arborized responsable para el transporte de las enzimas de las células endocrinas de las tripas y la producción de hormonas.

Endocrino de las células beta son el tipo celular único en el cuerpo que producen insulina para bajar los niveles de glucemia. Diabetes, una enfermedad caracterizada por una pérdida o disfunción de células beta, está alcanzando proporciones epidémicas. Por lo tanto, es indispensable establecer protocolos para investigar el desarrollo de las células beta que puede utilizarse para fines de investigación para obtener los medicamentos y terapias basadas en células. Mientras que la investigación experimental del desarrollo del ratón es esencial, en vivo los estudios son laboriosos y lentos. Las células cultivadas ofrecen una plataforma más conveniente para la investigación; sin embargo, no son capaces de mantener la diversidad celular, organización arquitectónica y las interacciones celulares que se encuentran en vivo. Por lo tanto, es esencial para desarrollar nuevas herramientas para investigar la fisiología y la organogénesis pancreática.

Pancreáticas células epiteliales se desarrollan en la asociación cercana con el mesénquima del inicio de la organogénesis como células organizan y diferencian en el complejo órgano adulto fisiológicamente competente. El mesénquima pancreático proporciona señales importantes para el desarrollo endocrino, muchos de los cuales no son bien entendidos todavía, por lo tanto difícil recapitular durante el cultivo en vitro . Aquí, describimos un protocolo cultura ratón complejo tridimensional, celular organoides que retienen mesenchyme, denominado pancreatoids. El brote pancreático murino e10.5 es disecado, disociado y cultivado en un ambiente libre de andamio. Estos flotan células auto montan con mesénquima que envuelven el desarrollo pancreatoid y un número sólido de endocrina las células beta en desarrollo junto con el acinar y las células del conducto. Este sistema puede ser utilizado para estudiar las interacciones de célula célula célula sino determinación, organización estructural y morfogénesis, organogénesis, o de drogas, de molécula pequeña o screening genético.

Introduction

Delinear los mecanismos del desarrollo normal y la fisiología es primordial para entender la etiología de la enfermedad y, en definitiva, cultivar métodos de tratamiento. Mientras que el cultivo y diferenciación de células madre permiten el análisis rápido y alto rendimiento de desarrollo, está limitada por el cuerpo existente de conocimientos sobre mecanismos de regulación sino de la célula y artificialmente recapitula el desarrollo en un relativamente Estado homogéneo bidimensional1,2. En vivo desarrollo afectado por influencias extrínsecas, con diferentes tipos de células en el lugar y entorno proporciona señales paracrinas y apoyo organizativo para orientar la organogénesis, no sólo la función de estas células también se basa en su alrededores de dirección3,4,5. Dada la importancia de estos estímulos externos, las limitaciones de los protocolos de diferenciación y la naturaleza laboriosa de modelos de ratón en vivo , nuevos sistemas se necesitan para investigar experimentalmente la fisiología y los procesos básicos del desarrollo.

La aparición de protocolos para generar organitas tridimensional, complejo proporciona un sistema conveniente y congruente para el estudio de la organogénesis, fisiología, eficacia de los medicamentos e incluso patogenia. Establecer organitas murino para diferentes sistemas como el estómago intestino y6 7 han ampliado nuestra comprensión de la organogénesis, proporcionando una herramienta para estudiar las complejidades del desarrollo con menos restricciones que en vivo y en vitro modelos. Debido a estos avances en el organoide murino la formación y el advenimiento de humanas pluripotentes células, intestinal humano8, retina9, renal10,11, y organitas cerebral12 se han producido y esto repertorio es limitado solamente por el conocimiento existente respecto de los mecanismos de desarrollo.

De particular interés es la generación de pancreático organoides, como una miríada de enfermedades plagas diferentes pancreático tipos celulares, incluyendo células acinares y conductos en la escasez pancreática exocrine13, las células acinares en pancreatitis14, y células beta en la diabetes15. Adquirir conocimiento sobre el desarrollo de estos diferentes tipos de células podría ayudar en la comprensión de su patología y puede, también, actuar como una plataforma de screening de drogas personalizada o trasplante. Previamente, Greggio et al desarrollaron un método para crear murino organitas pancreático que recapitulan en vivo morfogénesis y desarrollan estructuras organizadas, tridimensionales, complejas compuesto por las principales células epiteliales pancreáticas los tipos de16,17. Este es un gran paso adelante en el área pancreático, sobre todo lo que hacen las células en vitro puede permitir investigación biológica del desarrollo de la célula beta. Sin embargo, una escasez de células endocrinas formados en este protocolo a menos que los organoides se trasplantaron en el tejido, donde el nicho podría interactuar y proporcionar señales de instrucción17. El mesénquima constituye la mayor parte del nicho, muy envolvente el epitelio en desarrollo desde etapas iniciales de la organogénesis para etapas posteriores incluyendo delaminación endocrino y diferenciación3,4, 18. La interacción de la mesénquima con el páncreas en desarrollo es otro ejemplo de señales extrínsecas y la importancia de mantener en vivo la complejidad celular para el estudio de la organogénesis.

Aquí, describimos cómo generar tridimensional organitas pancreático, llamado pancreatoids, de progenitores pancreáticos murinos disociado los e10.5. Estos pancreatoids retener mesénquima nativo, uno mismo-montar en condiciones libres y generar todos los tipos de células pancreáticas principales, incluyendo un número sólido de células endocrinas beta19. Este enfoque es más adecuado para el análisis del desarrollo endocrino, como protocolos anteriores carecen de diferenciación endocrina robusta. Sin embargo, usando el protocolo para páncreas organoides de Greggio et al. , es más adecuado para el análisis de la ramificación epitelial pancreático y morfogénesis, como ramificación es más limitada en pancreatoids.

Protocol

Todos los experimentos con animales se describe en este método fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Baylor College of Medicine. 1. preparación del ratón embrionario día 10,5 progenitores pancreáticos Nota: Este Protocolo no necesita seguir en condiciones estériles hasta el paso 2, sin embargo, es óptima para esterilizar instrumentos de disección y rocíe con antes del etanol al 70% de uso. Para configurar para …

Representative Results

Disección cuidadosa de embriones de ratón en e10.5 desde el cuerno uterino debe producir embriones indemnes en PBS para más la disección (figura 1A). El tracto gastrointestinal puede eliminarse eficientemente del embrión (figura 1B), que permite el discernimiento del brote pancreático dorsal en la ensambladura del intestino y el estómago (figura 1C-F</…

Discussion

La progresión de los modelos de cultura de célula es fundamental para desarrollo de modelos de correctamente, producir tipos de células clínicamente relevantes, prueba de eficacia de los medicamentos o incluso trasplante a los pacientes. Sin embargo, recapitulando artificialmente el desarrollo en un plato es todo un reto ya que estamos todavía lejos de comprender los mecanismos de la organogénesis y la fisiología en vivo. Así en vitro de las células son ineficaz generado, no completamente funci…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Jolanta Chmielowiec útil discusión sobre el protocolo y el manuscrito. También agradecemos a Benjamin Arenkiel acceso al microscopio confocal. Este trabajo fue financiado por los NIH (P30-DK079638 a m) y T32HL092332-13 de M.A.S. y M.B., la Fundación médica de McNair (a m) y el núcleo confocal en el BCM intelectual y discapacidades del desarrollo investigación centro (NIH U54 HD083092 de la Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano).

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes Sigma-Aldrich A5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free water ThermoFisher D119
Borosilicate Capillary Tubes Sutter Instruments GB1007515 O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2 Sigma-Aldrich C5080
Cell-Repellent 96-Well Microplate Greiner Bio-One 650970 U-bottom
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5401000013
Chloroform Sigma-Aldrich 233306
Chromogranin-A antibody Abcam ab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60 Leica
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10310
Countess Cell Counter Slides Invitrogen C10312
CryoStar NX70 ThermoFisher 957000L
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) Roche 10 236 276 001 Powder
DBA antibody Vector Lab RL-1032
Dispase II, Powder Gibco 17105041
DMEM/F-12, HEPES Gibco 11330032
Dnase I Invitrogen 18068-015
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor) Sigma-Aldrich E9644
Ethanol, 200 Proof Decon Laboratories 2716
Forma Steri Cycle CO2 Incubators ThermoFisher 370
Fluoromount-G Southern Biotech OB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
INSM1 Antibody Santa Cruz BioTechnology sc-271408 Polyclonal Mouse IgG
Isopropanol Fisher a4164
Isothesia Isoflurane, USP Henry Schein 11695-6776-2
Insulin Antibody Dako A056401 Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST Universal KAPA Biosystems KK4618
KCl KaryoMax 10575090
KnockOut Serum Replacement Invitrogen 10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal Leica
MgCl2 Sigma-Aldrich 442615
Mouse C-Peptide ELISA ALPCO 80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA ALPCO 80-INSMSU-E01
MX35 Microtome Blades ThermoFisher 3052835
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma-Aldrich S3817
NaH2PO4 Sigma-Aldrich
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS 1X Corning 21-040-CV
Pdx1 antibody DSHB F6A11 Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds VWR 15160-157
Penicillin-Streptomycin Solution Corning MT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) Sigma-Aldrich P1585
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22431081 1.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 Protein R&D Systems 345-FG
Recombinant Human FGF-Acidic Peprotech 100-17A
Recombinant Human R-Spondin I Protein R&D Systems 4546-RS
BenchRocker 2D Benchmark BR2000
Sucrose 500g Sigma-Aldrich S0389
SuperFrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Super Pap Pen Electron Microscopy Sciences 71310
Thermomixer R Eppendorf 05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018
TrypLE Express Invitrogen 12604039 (1x), no Phenol Red
Trypan Blue Stain Invitrogen 15250061 For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200072 Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate Corning 3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well Corning 4520
Vimentin Antibody EMD Millipore AB5733 Polyclonal Chicken IgY
Vortex Genie BioExpres S-7350-1
Y-27632 Dihydrochloride R&D Systems 1254 Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss

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Cite This Article
Scavuzzo, M. A., Teaw, J., Yang, D., Borowiak, M. Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro. J. Vis. Exp. (136), e57599, doi:10.3791/57599 (2018).

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