Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد

doi: 10.3791/57615 Published: July 15, 2018

Summary

التلوث أثناء تسلسل الجينوم للكائنات الحية المجهرية لا يزال يمثل مشكلة كبيرة. هنا، نعرض طريقة لتسلسل الجينوم من تارديجرادي من عينة واحدة مع pg 50 أقل قدر من الحمض النووي دون تضخيم الجينوم كله التقليل من مخاطر التلوث.

Abstract

تارديجراديس هي الحيوانات المجهرية التي تدخل دولة أميتابوليك تسمى أنهيدروبيوسيس عندما تواجه جفاف ويمكن العودة إلى حالتها الأصلية عندما يتم توفير المياه. تسلسل الجينوم من الحيوانات المجهرية مثل تارديجراديس مخاطر التلوث البكتيري في بعض الأحيان يؤدي إلى تفسيرات خاطئة، على سبيل المثال، فيما يتعلق بمدى نقل الجينات الأفقي في هذه الحيوانات. هنا، نحن نقدم أسلوب إدخال معالجات تسلسل جينوم تارديجرادي، دوجارديني هيبسيبيوس، من عينة واحدة. عن طريق استخدام الاستبعاد الغسيل والتلويث صرامة جنبا إلى جنب مع كفاءة استخراج من 50 ~ 200 pg المجينية الحمض النووي من فرد واحد، ونحن شيدت مكتبة التسلسل مع أداة تسلسل الحمض النووي. هذه المكتبات تم استنساخه للغاية وغير منحازة، وأظهر تحليل المعلوماتية من يقرأ التسلسل مع مورثات أخرى H. دوجارديني الحد أدنى من التلوث. يمكن تطبيق هذا الأسلوب إلى ايضات تارديجراديس التي يمكن أن لا تكون متسلسلة باستخدام الطرق السابقة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تارديجراديس هي الحيوانات المجهرية التي يمكن أن تدخل دولة أميتابوليك تسمى أنهيدروبيوسيس عندما تواجه جفاف. أنها استعادة بامتصاص المياه1،2. في حالة أميتابوليك، تارديجراديس قادرة على التغاضي عن مختلف البيئات المتطرفة، التي تشمل درجات الحرارة القصوى3 والضغوط4،5، وجرعة عالية من الضوء فوق البنفسجي6والأشعة السينية وأشعة غاما 7 , 8و9من الفضاء الكوني. بيانات الجينوم أساس لا غنى عنه لدراسة الآليات الجزيئية أنهيدروبيوسيس.

المحاولات السابقة لتسلسل جينوم تارديجراديس أظهرت علامات التلوث البكتيري10،11،12،،من1314. تسلسل الجينوم من هذه الكائنات الصغيرة يتطلب عدد كبير من الحيوانات، وهو عرضه للتلوث البكتيري؛ ولذلك، فقد أنشأنا سابقا بروتوكول تسلسل باستخدام أسلوب إدخال معالجات بدءاً من عينة واحدة من تارديجرادي، للتقليل من مخاطر التلوث15. باستخدام هذه البيانات، كما أجرينا resequencing عالية الجودة وإعادة التجميع للجينوم من16، H. دوجارديني17. هنا نحن تصف بالتفصيل هذا الأسلوب لتسلسل الجينوم من فرد واحد تارديجرادي (الشكل 1). التحقق من الصحة لهذا الأسلوب التسلسل هو أبعد من التركيز في هذه الورقة، وسبق مناقشة مستفيضة في أعمالنا السابقة التقرير16.

ويتكون هذا الأسلوب من جزأين: عزل تارديجرادي واحد مع أدنى ممكن التلوث، واستخراج عالية الجودة للرسم التخطيطي مستويات الحمض النووي. Tardigrade جوعاً وتشطف جيدا مع الماء، فضلا عن المضادات الحيوية، ولاحظ تحت مجهر مع 500 X التكبير لضمان إزالة أي تلوث جرثومي. وتظهر التقديرات السابقة والقياسات أن فرد واحد من تارديجرادي يحتوي على حوالي 50-200 pg المجينية الحمض الخلوي الصبغي16، الذي يستخرج من تكسير الهيكل الخارجي كيتين بدورات تجميد أذاب أو بواسطة التذويب اليدوي. هذا الحمض النووي هو المقدمة لبناء مكتبة ومتسلسلة على أداة تسلسل الحمض النووي. ويبين تحليل المعلوماتية إضافية تسلسل عالية الجودة، فضلا عن تدني مستويات التلوث بالمقارنة مع المشاريع السابقة في تسلسل تارديجرادي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-إعداد

  1. إعداد 2% [اغروس] هلام استخدام الماء المقطر (DW) المذيب في صحن الثقافة بلاستيكية عيار 90 ملم، و 10 مل من 1% البنسلين/ستربتوميسين كوكتيل مع دويتشه فيلة. ويمكن تخزين الهلام لمدة 2-3 أسابيع في حاضنة في 18 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب أي مخزن من جل أقل من 10 درجة مئوية، لدرجة الحرارة المنخفضة سوف يتقلص [اغروس] هلام، أسفر عن فجوة ضئيلة جداً بين الجل والجدار صحن الثقافة التي يمكن أن المحاصرين في تارديجراديس.

2-عينة من إعداد واستبعاد الملوث

  1. جمع من تارديجرادي واحد ووضعه على لوحة أجار استعداد وغسله 2 x-x 3 مع دويتشه فيلة لإزالة أي جزيئات المتبقية.
  2. احتضان tardigrade في 18-22 درجة مئوية عن 24 ساعة لإزالة أي فائض الغذاء من الأمعاء.
  3. ضع tardigrade جوعاً في المضادات الحيوية البنسلين/ستربتوميسين ح 2-6 إزالة أي التلوث البكتيري ومكان الحيوان يخلعوا على زجاج شريحة نظيفة باستخدام ماصة P10.
  4. مراقبة tardigrade تحت مجهر على 500 X التكبير والتأكد من أن هناك لا البكتيريا المتبقية.
    ملاحظة: التكبير عالية مع ستيريوميكروسكوبي الأمثل، ولكن يمكن استخدامها مجهر ضوئي بدلاً من ذلك دون تطبيق ساترة.
  5. جمع الفرد باستخدام ماصة P10 بحد أقصى 5 ميليلتر من السائل ووضعه في أنبوب تفاعل المتسلسل (PCR) بوليميريز ملزمة منخفضة وإزالتها كسائل كثير الزائدة قدر الإمكان.
    ملاحظة: microtubes، وأنابيب PCR، ونصائح ماصة ينبغي جميعا ملزمة منخفضة إلى أدنى حد من الخسائر في الحمض النووي.
    ملاحظة: إجراء تجانس أسرع وقت ممكن، لجفاف السريع أو وفاة الحيوان إلى حد كبير يمكن أن تلحق الضرر الحمض النووي.

3-التجانس واستخراج الحمض النووي

  1. مجانسة الحيوان الحصول على الحمض النووي (جدنا) باستخدام أحد الأساليب التالية.
    ملاحظة: من الضروري استخدام هذه المجموعة المحددة المبينة في الجدول للمواد في الخطوات التالية استخراج الحمض النووي، لمجموعات أخرى (أما العمود وحبه على أساس) ليست فعالة في هذا الإدخال منخفضة للغاية. تم تزويد المخزن المؤقت تحلل الجينوم مع 0.5% بيتا-ميركابتوثانول قبل الاستخدام.
    1. مجانسة الحيوان مع دورات تجميد أذاب و18.
      1. مباشرة بعد الخطوة 2، 5، إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الأنبوب PCR الذي يحتوي على تارديجرادي.
      2. ضع الأنبوب PCR في النتروجين السائل لمدة 10 دقائق، ومدة 10 دقيقة، نقله إلى كتلة حرارة ارتفعت درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة 2 x.
        ملاحظة: يمكن أن تتكرر هذه الخطوة عند التجانس ليس كافياً، أو يمكن أن يؤديها بعد سحق اليدوي.
    2. سحق الحيوان يدوياً.
      1. مباشرة بعد الخطوة 2.5، تحت ستيريوميكروسكوبي، سحق الفرد بطرف P10 الماصة بالضغط على الحيوان ضد جدار الأنبوبة PCR، وفورا إضافة 100 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت.
        ملاحظة: من المهم مراعاة هذا الإجراء تحت ستيريوميكروسكوبي، نظراً تارديجرادي يمكن أن تفلت بسهولة، وسحق غير فعالة سيؤدي إلى عدم استخراج جدنا. تأكد من أن بشرة tardigrade مكسورة حتى أنه يمكن التسلل المخزن المؤقت لتحلل الكائن الحي.
  2. احتضان الأنبوب مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتحلل تحدث.
    ملاحظة: مطلوب الحد أدنى من 30 دقيقة لتحلل كفاءة، ولكن الحضانة يمكن أن تكون أطول.
  3. نقل وحدة كاملة (100 ميليلتر) تحلل المخلوط إلى microtube ملزمة منخفضة 1.5 مل نظيفة.
  4. إضافة 100 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت إلى أنبوب PCR منخفضة الملزمة التي استخدمت للتجانس وهي الآن فارغة، وبعد بيبيتينج الخليط، نقلها إلى microtube ملزمة منخفضة 1.5 مل المستخدمة في الخطوة 3، 3. كرر هذه الخطوة 2 x.
  5. كما هو الحال في الخطوة 3، 4، إضافة 300 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت إلى أنبوب PCR ملزمة منخفضة، وبعد بيبيتينج، نقل الخليط إلى microtube ملزمة منخفضة 1.5 مل. ينبغي أن يتضمن microtube ملزمة منخفضة 1.5 مل 600 ميليلتر من الخليط بعد هذه الخطوة.
    ملاحظة: هذه الخطوات للتقليل من الخسائر في جدنا ملزمة بجدار الأنبوبة بكر، بغسل العينة عدة مرات.
  6. إضافة إجمالي 600 ميليلتر من خليط تحلل على عمود الدوران يوضع في أنبوب جمع والطرد المركزي أنه في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة.
  7. إعادة تطبيق التدفق من خلال العمود والطرد المركزي أنه في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لضمان أن معظم جدنا منضماً إلى العمود.
  8. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي على عمود الدوران والطرد المركزي في 10,000 س ز 1 دقيقة نقل العمود تدور microtube نظيفة 1.5 مل.
  9. تطبيق 20 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 8.5، إلى عمود الدوران، انتظر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، والطرد المركزي أنه في 10,000 غ س ل 1 دقيقة.
    ملاحظة: شطف المخزن المؤقت يجب أن لا تحتوي على يدتا، لأنها تتعارض مع الإنزيمات إعداد المكتبة.
  10. إعادة تطبيق التدفق من خلال عمود الدوران، وبعد 5 دقائق من حضانة في درجة حرارة الغرفة، والطرد المركزي أنه لمدة 1 دقيقة في 10,000 س ز.
    ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لضمان شطف القصوى من جدنا منضمة إلى العمود.

4-مكتبة بناء التسلسل

  1. تجزؤ الحمض النووي
    1. نقل 15 ميليلتر من الوانت جدنا إلى microtube 15-ميليلتر لتفتيت الحمض النووي والطرد المركزي الأنبوب لمدة 1 دقيقة باستخدام ميكروسينتريفوجي سطح المنضدة.
      ملاحظة: microtube المحددة المبينة في الجدول للمواد الأمثل بالنسبة لمدخلات منخفضة. التجزئة مع سونيكيشن منخفضة الحجم الحرج، وهذا لا يمكن أن يستعاض عنها بتجزئة الانزيمية بسبب تركيز منخفض للغاية للحمض النووي.
    2. تجزئة جدنا إلى 550 شركة بريتيش بتروليوم.
      ملاحظة: إعدادات شركة بريتيش بتروليوم 550 استخدمنا كما يلي: ذروية الحادث = 30 ث، عامل واجب = 20%، دورات لكل الاندفاع = 50، وقت العلاج = 23 s.
    3. بعد بيبيتينج دقيق، نقل 10 ميليلتر من خليط الحمض النووي مجزأة إلى أنبوب بكر نظيفة منخفضة-ملزمة.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة هنا. الحفاظ على الحمض النووي في 4 درجات مئوية أو-20 درجة مئوية.
  2. تسلسل بناء المكتبة
    ملاحظة: من المهم على الإطلاق لاستخدام هذه المجموعة المحددة في الجدول للمواد في الإجراءات التالية، بسبب انخفاض كمية من الحمض النووي الإدخال.
    1. إضافة 2 ميليلتر من المخزن المؤقت إعداد قالب و 1 ميليلتر من إنزيم إعداد قالب ومزجها جيدا مع ماصة.
    2. القيام بإعداد قالب رد فعل على cycler حرارية بالشروط التالية: 22 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة، 55 درجة مئوية 20 دقيقة وعقد 4 درجات مئوية، وغطاء ساخن في 101-105 درجة مئوية. وبمجرد الانتهاء من رد فعل، تابع إلى الخطوة التالية.
    3. إضافة 1 ميليلتر من المخزن المؤقت توليف مكتبة و 1 ميليلتر إنزيم توليف المكتبة لإعداد قالب رد الفعل المنتج واحتضان الخليط عند 22 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة (مع عقد 4 درجات مئوية). وبمجرد الانتهاء من رد فعل، تابع إلى الخطوة التالية.
    4. إضافة 30 ميليلتر من مكتبة التضخيم مزيج الرئيسي (25 ميليلتر من المخزن المؤقت التضخيم مكتبة و 1 ميليلتر من إنزيم التضخيم مكتبة 4 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس) و 5 ميليلتر من الكاشف الفهرسة.
    5. يخلط كل شيء دقيق ماصة والطرد المركزي المخلوط بإيجاز مع أجهزة الطرد مركزي منضدية.
    6. أداء بكر مع الشروط الواردة في الجدول 1.
درجة الحرارة الوقت دورات
72 ˚C 3 دقائق
85 ˚C 2 دقيقة
98 ˚C 2 دقيقة
98 ˚C 20 ثانية 4 دورات
67 ˚C 20 ثانية
72 ˚C 40 ثانية
98 ˚C 20 ثانية دورات 16
72 ˚C 50 ثانية
4 ˚C عقد

الجدول 1: أوضاع PCR.

  1. تنقية المنتجات بكر
    ملاحظة: يمكن أن يكون محل هذه الخطوة مع أساليب تنقية أخرى. إذا تم استخدام أسلوب بديل، تأكد من التحقق من نقاء الحمض النووي الناتج باستخدام جهاز المطياف الضوئي. امتصاص نسب من 260/280 و 260/230 يجب أن تكون فوق 1.8.
    1. إضافة 50 ميليلتر من حبات مغناطيسية، "الماصة؛" الحل 10 x، والطرد المركزي بإيجاز مع ميكروسينتريفوجي سطح المنضدة.
    2. احتضان الحل لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. احتضان ذلك على الوقوف مغناطيسية لمدة 5 دقائق أو حتى يصبح الحل تماما واضحة، وإزالة المادة طافية.
    4. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% طازجة إلى أنبوب PCR ملزمة منخفضة على الوقوف مغناطيس، انتظر 30 ثانية، وإزالة المادة طافية. كرر هذه الخطوة 2 x. عدم الإزعاج الخرز.
    5. باختصار الطرد المركزي الأنبوب PCR ملزمة منخفضة مع أجهزة الطرد مركزي منضدية وإزالة أي الإيثانول الزائدة على الوقوف المغناطيسية. أيردري الخرز ولكن تجنب overdrying.
    6. ريسوسبيند الخرز مع 15 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 8.5، دقة "الماصة؛" الحل حيث أن الخرز المغناطيسية توزع البلوتينيوم، واحتضان الأنبوب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وبعد الطرد المركزي قصيرة، احتضان أنها في موقف مغناطيسي من أجل 2 دقيقة حتى الحل الواضح.
      ملاحظة: شطف المخزن المؤقت ينبغي أن لا تتضمن يدتا، لأنها تتعارض مع الكيمياء التسلسل.
    7. نقل المادة طافية، دون الإخلال ببيليه، إلى أنبوب PCR منخفضة-ملزمة جديدة.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة هنا. الحفاظ على الحمض النووي في 4 درجات مئوية أو عند-20 درجة مئوية لمخزن لفترة طويلة.

5-جودة الاختيار والتحديد الكمي، وتسلسل الحمض النووي

ملاحظة: لا تجري فحص جودة قبل هذه الخطوة نظراً لكمية قليلة من الحمض النووي.

  1. التحقق من صحة توزيع حجم مكتبة الحمض النووي
    ملاحظة: يمكن استخدام نظم التفريد العالية الحساسة الأخرى مع التقارير الرقمية لتوزيع حجم.
    1. العودة الكاشف المخزن المؤقت التفريد وهلام خرطوشة (25-1,000 bp في النطاق) إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة 3 ميليلتر من التفريد كاشف المخزن المؤقت مع 1 ميليلتر من المكتبة التسلسل ومزجها جيدا لمدة 1 دقيقة مع دوامة، والطرد المركزي بإيجاز لهم مع أجهزة الطرد مركزي منضدية.
    3. إجراء التفريد والتحقق من صحة توزيع حجم المكتبة مع البرامج المرتبطة بها. وينبغي أن تتراوح ذروة الجزء الرئيسي على نطاق واسع من حوالي 300 إلى 000 1 شركة بريتيش بتروليوم.
  2. تقدير حجم الحمض النووي
    ملاحظة: الأساليب المستندة إلى الأسفار أو PCR الكمي أخرى يمكن أن تستخدم أيضا، ولكن ينبغي تجنب كانت، كما أنها ليست دقيقة بما يكفي للتحديد الكمي لمكتبات التسلسل.
    1. إضافة ميليلتر 796 من المخزن المؤقت الحل و 4 ميليلتر من كاشف فلوري ومزجها جيدا. الاستغناء عن 190 ميليلتر من حل العامل أنبوبين المقايسة وميليلتر 197 إلى أنبوب اختبار واحد.
    2. إضافة 10 ميليلتر من المعايير مع تركيزات معروفة من الحمض النووي لكل أنبوبة المقايسة تتضمن 190 ميليلتر لحل عملي وميليلتر 3 مكتبة معدّة للأنبوب المقايسة تتضمن ميليلتر 197 الحل العامل.
    3. دوامة الأنابيب بإيجاز والطرد المركزي لهم في أجهزة الطرد مركزي منضدية. تحديد كمية الحمض النووي باستخدام فلوروميتير مع إعدادات 3-ميليلتر.
  3. تسلسل الحمض النووي مكتبة
    ملاحظة: يجب أن تكون منصة التسلسل متوافق مع عدة بناء المكتبة المحددة.
    1. تعد المكتبة التسلسل استناداً إلى البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    2. قم بتعيين الخلية كاشف كاسيت وتدفق من تسلسل صك وأدخل تسلسل تشغيل المعلومات التالية البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    3. تشغيل التسلسل.
      ملاحظة: لقد أجرينا تشغيل تسلسل اثنين: واحد عينة/تشغيل، فضلا عن أربع عينات متعدد في تشغيل واحد.

6-الحسابية التحليل

  1. قاعدة-الدعوة، وإذا لزم الأمر، ديمولتيبليكس على ما يلي.
  2. التحقق من جودة البيانات التسلسل مع فاستقك19.
    ملاحظة: لعملية التحقق من البيانات التي تم الحصول عليها في صحة أكثر تعمقاً، انظر التقرير السابق لدينا16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

استبعاد المواد الملوثة:

ينطوي هذا البروتوكول غسيل دقيق تارديجرادي وتعقيم مع العلاج المضادات الحيوية لتقليل التلوث. كما أنها تنطوي عملية فحص البصري ضمان اكتمال هذه العمليات. ويبين الشكل 2صورة مجهر أثناء التحقق من الصحة (الخطوة 2، 4 من البروتوكول). عندما لاحظ في تكبير X 500، يمكن اعتبار الخلايا البكتيرية الجسيمات الصغيرة التي تتحرك حولها tardigrade الفردية.

التحقق جودة مكتبة الحمض النووي:

المبلغ الإجمالي للمكتبة تسلسل الحمض النووي شيدت هو تقريبا 109.5 نغ (7.3 نانوغرام/ميليلتر x 15 ميليلتر)16. للتحقق من صحة توزيع طول التجزئة، يجب أن يكون نمطاً التفريد شبيه الشكل 3- كما أننا بتعيين حجم التجزئة إلى 550 bp مع الحمض النووي القص النظام، ينبغي أن تكون المكتبة 550-600 شركة بريتيش بتروليوم، بما في ذلك محولات التسلسل. يمكن ملاحظة أن غالبية المكتبة التسلسل الوارد بين 200-1000 شركة بريتيش بتروليوم ويتمشى بين replicates (N1-N4).

تحليل بيانات تسلسل:
إنشاء تسلسل الحمض النووي حوالي 20 إلى 25-م يقرأ إقران كل تشغيل. التحقق النوعية أجريت باستخدام فاستقك (الشكل 4). توزيع نوعية على طول القراءة المتتابعة نموذجي لتشغيل إقران 300-بي بي.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل لهذا البروتوكول. يعرض الشكل التالي ملخصاً لهذا البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : صور الممثل tardigrade خالية من البكتيريا. يعرض هذا الشكل الصور الملوثة تارديجرادي (يسار) وتنظيفها (يمين) تارديجرادي (دوجارديني هيبسيبيوس)، جنبا إلى جنب مع المزيد من الصور المكبرة (أسفل). الخلايا على شكل قضيب حول tardigrade الملوثات ويشار إليها سهم. يشير شريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : التحقق من صحة توزيع طول جزء المكتبة الحمض النووي شيدت. ويبين هذا الفريق توزيع حجم مكتبة التسلسل. الخطوط الأرجوانية والخضراء تشير إلى علامات العلوي والسفلي في bp 1500 و 25، على التوالي. L = سلم، S = 1 عينة/تشغيل، N1-N4 = 4 replicates/تشغيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : مثال للتحقق جودة تسلسل الحمض النووي مع فاستقك- وقدمت بيانات تسلسل الحمض النووي إلى فاستقك للتحقق من صحة أداء التسلسل. ويرد نتيجة ممثل بالنسبة DRR055040 كل نوعية قاعدة التسلسل (16من دبي تسلسل قراءة الأرشيف DRA004455). (أ) هذا الفريق يظهر ما يلي إلى الأمام (R1). (ب) هذا الفريق يدل على عكس ما يلي (R2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

التلوث البكتيري يشكل تهديدا لتسلسل الجينوم للكائنات الحية المجهرية. بينما قد تخرج الدراسات السابقة في تسلسل الجينوم تارديجرادي التلوث باستخدام أساليب المعلوماتية الواسعة12،20، نحن تسلسل الجينوم من فرد واحد التقليل من مخاطر التلوث. حيث يحتوي على حوالي 50-200 pg المجينية الحمض الخلوي الصبغي16 tardigrade فردية وهو المغطى بطبقة سميكة من كيتين الهيكل الخارجي، يتم استبعاد الملوثات واستخراج الحمض النووي عالي الجودة النقاط الحرجة في هذا البروتوكول. القائمة تارديجراديس الثقافات ليست العقيم، وتلك التي تم جمعها من تحمل البرية الكثير من الملوثات على السطح، فضلا عن بقايا الطعام في الأمعاء على. يكون التسلسل المشاريع السابقة في تسلسل الجينوم من تارديجراديس الأفراد 10,000 100,000 جماعياً كواحد عينة12،14، مما يعني النتائج من المرجح جداً أن تتأثر بالملوثات البكتيرية. وفي التقرير، بوثباي et al. جمع الأفراد H. دوجارديني باستخدام السلوك السلبية فوتوتاكسيس على14، والفريق لم تستخدم أي من الأساليب المضادة للبكتيريا.

بصريا دراسة إذا كان هناك الملوثات، المحتضنة tardigrade في المضادات الحيوية (البنسلين/ستربتوميسين)، ودراسة الفرد تحت مجهر X 500. بعزل فرد واحد والتفتيش بعناية عن أي ملوثات، علينا التقليل من مخاطر التلوث المحتملة. تم تأكيد مستويات منخفضة من التلوث من بيانات تسلسل جيدا16. أما بالنسبة لاستخراج الحمض النووي، استخدمنا التذويب اليدوي، فضلا عن التجانس الحراري18. عن طريق تقديم الفرد tardigrade للنتروجين السائل و 37 درجة مئوية، فعل الشقوق في الهيكل الخارجي كيتين، وتحلل المخزن المؤقت قادرة على اختراق الجسم والخلايا. عندما العائد الحمض النووي لا يزال أقل مما كان متوقعا، ويمكن إجراء التجانس الحراري، ودليل لتعظيم العائد.

الأسلوب المذكورة في هذه المقالة يحتوي على العديد من القيود. أولاً، تم تطبيق التجانس بدورات التجميد والذوبان من دراسة عن الحبليات؛ وهكذا، الطريقة قد تكون فعالة ضد انسلاخيات فقط. ثانيا، بسبب تضخيم شظايا من الحمض النووي مرحلة المكتبة تسلسل الحمض النووي، لا يمكن تجاهل إمكانية حدوث أخطاء PCR. وهكذا، لا ينصح تسلسل البيانات للتحليل الذي يتطلب ما يلي: عالية الدقة (أي، تحليل SNP). وعلاوة على ذلك، كما ذكرنا في البروتوكول، استخدام طقم SNA Seq المحددة المبينة في الجدول للمواد في غاية الأهمية، بسبب انخفاض كمية من الحمض النووي الإدخال. هذا الحمض النووي مكتبة البناء كيت ليجاتيس تسلسل محول إيلومينا قبل التضخيم؛ ولذلك، لا يمكن تطبيق هذه المكتبة لتسلسل طويلة للقراءة باستخدام تقنية باكبيو أو نانوبوري. وأخيراً، فحص جودة للمكتبة الحمض النووي شيدت خلال هذا البروتوكول يحدث مرة واحدة فقط، بعد بناء مكتبة التسلسل. هذا سبب الإدخال منخفضا الحمض النووي منذ معظم الحمض النووي الكمي ولا يمكن الكشف عن أساليب التفريد pg 50-200 من الحمض النووي. ولذلك، لقد أجرينا عمليات التحقق من النوعية، مثل التفريد (الشكل 1)، وكوانتيفيكيشنز على أساس الأسفار، إلا بعد التضخيم PCR.

مناقشة كاملة للتحليلات المعلوماتية الحيوية لهذه البيانات أبعد من نطاق هذه المادة؛ ومع ذلك، ذكرنا بإيجاز عدة تحليلات أجريناها. فحص جودة البيانات التسلسل مع فاستقك19 يحسب الصفات كل قاعدة، تسلسل الازدواجية، إلخ تسلسل البيانات التي تم التحقق من صحتها يمكن تقديمها إلى الجمعية الجينوم. أننا اجتمعنا جينوم 132 ميغابايت مع ماسوركا v3.1.321 وقد مقارنة الإحصاءات تعيين حساب مع التحالف22 و23 من كواليماب من هذه المكتبة تسلسل الحمض النووي مع سائر الجمعيات الجينوم H. دوجارديني 16. وعلاوة على ذلك، نحن أيضا قد استخدمت هذه البيانات تسلسل الحمض النووي لاستبعاد الملوثات في الدراسة لدينا17، ولاحظنا الجينوم على ما يلي التسلسل موزعة بالتساوي.

بدء معظم المشاريع على الكائنات الحية غير نموذجية من استزراع ما يكفي من المواد عينة، كما الحال بالنسبة تارديجراديس24. مكن التقدم التقني في مجال تقنيات الثقافة كميات عالية من الثقافة تارديجرادي، ولكن أساليب الثقافة الحالية ليست معقمة بعد، وحيث لا يزال ايضات في مختبرات تارديجراديس معظم، كان من المستحيل تقريبا إجراء الجينوم أو التسلسل الترنسكربيتوم. هذا الأسلوب تسلسل الحمض النووي من فرد واحد يجعل من الممكن لتحليل الأنواع tardigrade النادرة، بما في ذلك الأنواع البحرية التي درست أقل. بإجراء مقارنة الجينوم في منطقة فيليتيك أوسع، يمكن تحقيق المزيد من فهم آليات أنهيدروبيوسيس في تارديجراديس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون تاكاي يوكي أبي نوزومي وايشي وناهوكو لدعمها التقني في تسلسل الجينوم. هذا العمل وأيده معونات "الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS) زميل أبحاث ومعونات كاكينهي "العلماء الشباب" (No.22681029)، ومعونات كاكينهي للبحوث العلمية (ب) رقم 17 ح 03620 من JSPS، منحة "مشاريع بحوث العلوم الأساسية" من مؤسسة سوميتومو (No.140340)، وجزئياً من أموال البحث من حكومة محافظة ياماجاتا ومدينة تسروكا، اليابان. وزودت chlorella الشائع استخدامها لتغذية تارديجراديس المجاملة Chlorella المحدودة للصناعة

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SZ61 microscope OLYMPUS
BactoAgar Difco Laboratories 214010
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco by life technologies 15140-148
VHX-5000 System Keyence
0.2mL Silicone coating tube Bio Medical Science BC-bmb20200
Quick-DNA Microprep Kit ZYMO Research D3021 Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1
1.5 mL microtube greiner bio-one 616-201 See 4.1.1
HIgh speed refrigerated micro centrifuge TOMY MX-307
Covaris M220 Covaris Inc. 4482277
ThruPLEX DNA-Seq kit Rubicon Genomics CAT. NO. R400406 Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2
Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC
AMPure XP reagent BECKMAN COULTER Life Science A63881
Ethanol Wako 054-027335
EB buffer QIAGEN 19086
2200 TapeStation Agilent G2965AA 
D1000 Reagents Agilent 5067-5583
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582
Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent ThermoFisher Scientific Q32850
Cubee Mini-Centrifuge RecenttecGenereach R5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3 Illumina Inc. MS-102-3003
MiSeq Sequencer Illumina Inc. SY-410-1003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54, (1), 579-599 (1992).
  2. Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202, (3), 409-420 (2011).
  3. Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
  4. Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3, (1), 1167575 (2016).
  5. Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12, (4), 283-289 (2012).
  6. Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8, (6), e64793 (2013).
  7. Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82, (12), 843-848 (2006).
  8. May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
  9. Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81, (9), 649-656 (2005).
  10. Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination? Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (22), E3054-E3056 (2016).
  11. Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
  12. Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (18), 5053-5058 (2016).
  13. Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (22), E3058-E3061 (2016).
  14. Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (52), 15976-15981 (2015).
  15. Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (22), E3057 (2016).
  16. Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
  17. Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15, (7), e2002266 (2017).
  18. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
  19. Andrews, S. FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  20. Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
  21. Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29, (21), 2669-2677 (2013).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, (14), 1754-1760 (2009).
  23. Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32, (2), 292-294 (2016).
  24. Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8, (3), 549-556 (2008).
معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen. J. Vis. Exp. (137), e57615, doi:10.3791/57615 (2018).More

Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen. J. Vis. Exp. (137), e57615, doi:10.3791/57615 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter