यहां, हम एक organotypic संवर्धन प्रोटोकॉल मौजूद इन विट्रो में भ्रूण चिकन अंगों को विकसित करने के लिए । इस विधि का उपयोग, भ्रूण चिकन ऊतक के विकास का अध्ययन किया जा सकता है, जबकि संस्कृति पर्यावरण पर नियंत्रण के एक उच्च डिग्री को बनाए रखने.
भ्रूण चिकन सामांयतः हड्डीवाला विकास के लिए एक विश्वसनीय मॉडल जीव के रूप में प्रयोग किया जाता है । इसकी पहुंच और लघु गर्मी अवधि यह प्रयोग के लिए आदर्श बनाता है । वर्तमान में, चिकन भ्रूण में इन विकासात्मक रास्ते का अध्ययन स्थानीयकृत साइटों पर अवरोधकों और दवाओं को लागू करने और कम तरीकों की एक किस्म का उपयोग सांद्रता द्वारा आयोजित किया जाता है । इन विट्रो टिशू संवर्धन में एक तकनीक है कि मेजबान जीव से अलग ऊतकों के अध्ययन में सक्षम बनाता है, जबकि एक साथ शारीरिक सीमाओं के कई वर्तमान को दरकिनार जब पूरे भ्रूण के साथ काम करने के लिए, जैसे भ्रूण की संवेदनशीलता के रूप में संभावित घातक रसायनों की उच्च खुराक । यहां, हम संवर्धन के लिए एक organotypic संवर्धन प्रोटोकॉल मौजूद भ्रूण चिकन आधा सिर इन विट्रो, जो वर्तमान में स्थापित तरीकों से परे विकासात्मक प्रक्रियाओं की परीक्षा के लिए नए अवसर प्रस्तुत करता है ।
भ्रूण चिकन (गैलस गैलस) एक उत्कृष्ट मॉडल सामांयतः जीव विज्ञान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया जीव है । इसकी मशीन अवधि लगभग 21 दिन है और कई अंडे एक साथ किया जा सकता है, प्रयोग त्वरित और कुशल बनाने । शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, भ्रूण भी आसानी से हेरफेर है, प्रमुख विकासात्मक प्रक्रियाओं और जीन और प्रोटीन है कि इन प्रक्रियाओं ड्राइव के व्यापक अध्ययन को सक्षम करने से ।
भ्रूण चिकन आंख कई अन्य शरीर प्रणालियों के समान विभिन्न ऊतकों की एक संख्या की बातचीत के माध्यम से विकसित करता है कि एक जटिल अंग है । इस विधि से इन ऊतकों के विकास का अध्ययन, विशेष रूप से विकास के उन्नत चरणों में सक्षम बनाता है । उदाहरण के लिए, बहु स्तरित रेटिना तंत्रिका तंत्र के विकास का अध्ययन करने वालों के लिए विशेष रुचि का हो सकता है. वैकल्पिक तरीकों कि कॉर्निया के रूप में अंय नेत्र ऊतकों के अध्ययन को सक्षम, vitreal शरीर, लेंस, श्वेतपटल, और पलकें शोधकर्ताओं को लाभ के हैं । चिकन भ्रूण आंख भी फ्लैट हड्डियों की एक श्रृंखला, scleral ossicles, जो intramembranous हड्डी प्रेरण और रीढ़1में हड्डी बन जाना के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है शामिल हैं ।
वर्तमान में, वहां भ्रूण विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों की एक संख्या हैं । निरोधात्मक एंटीबॉडी या अंय निरोधात्मक अणुओं के Microinjections2,3, शल्य चिकित्सा में प्रत्यारोपित microbeads में भीगे4, और electroporation5 सभी तरीकों कि जीन downregulate करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या एक भ्रूण में ब्याज की प्रोटीन । इसी तरह के तरीके प्रोटीन को विनियमित करने के लिए उपयोग किया जाता है । ये विधियां उनकी सीमाओं के बिना नहीं हैं । उदाहरण के लिए, जब रसायनों का उपयोग भ्रूण के विकास को बदलने के लिए, पर घातक प्रभाव का मूल्यांकन किया जाना चाहिए, और इस aforementioned तरीकों का उपयोग करने के लिए पर्याप्त मात्रा कम खुराक पर आवेदन के स्थानीयकृत साइटों को सीमित भ्रूण.
इन विट्रो टिशू संवर्धन में विकास का अध्ययन करने के लिए जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में इस्तेमाल किया गया है और aforementioned सीमाओं के कुछ बाईपास करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, femora6, पंख कलियों7,8, और चिकन के9 अंगों सभी ऊतक संवर्धन तरीकों का उपयोग कर अध्ययन किया गया है, के रूप में माउस का परीक्षण किया है10 और जड़ों और पौधों11के उपजा है । इन तरीकों वैज्ञानिकों के ऊतकों के विकास पर नियंत्रण के एक उच्च डिग्री प्रदान करते हैं, इस तरह के तापमान में उतार चढ़ाव और पोषक तत्वों की उपलब्धता में परिवर्तन करने की क्षमता के रूप में । पूरे भ्रूण से ऊतक के अलगाव भी यह अब तक कम रसायनों के घातक प्रभाव के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है, इस प्रकार उच्च सांद्रता पर एक वैश्विक स्तर पर हेरफेर अध्ययन को सक्षम करने । इन विट्रो संवर्धन का एक अंय उल्लेखनीय लाभ ऊतक सेलुलर पर्यावरण का संरक्षण है; ऊतकों की व्यवस्था अपेक्षाकृत अपरिवर्तित बनी हुई है, यह विभिन्न प्रकार के ऊतक9के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए संभव बना. इस प्रकार, इन विट्रो संवर्धन में vivo या ovo मॉडल में उपलब्ध नहीं अतिरिक्त प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए दरवाजे खोलता है ।
वर्तमान में, भ्रूण चिकन आंख के विकास का अध्ययन रसायनों का उपयोग विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है । extraembryonic झिल्ली के एक नंबर भ्रूण को कवर, यह microbeads या रसायनों को लागू करने के लिए मुश्किल बना; भ्रूण भी अंडे के भीतर बहुत सक्रिय है के रूप में यह बड़ा हो जाता है, आगे एक पहले से ही कठिन विधि उलझी । इस प्रोटोकॉल आंख और उसके आसपास के ऊतकों के लिए आसान पहुंच सक्षम बनाता है, इन बाधाओं को नष्ट करने, जबकि भी नए अवसर प्रदान करने के लिए आंख के भीतर विकासात्मक प्रक्रियाओं की जांच । इस प्रोटोकॉल भ्रूण आंख के भीतर scleral ossicles की प्रेरण अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया था ।
इस प्रोटोकॉल की स्थापना की ऊतक संवर्धन तकनीक का उपयोग करने के लिए भ्रूण दिवस 8 से एक चिकन आंख के विकास को प्राप्त करने के लिए बनाता है (HH34) 4 दिनों के लिए इन विट्रो में । यह ग्रिड-संवर्धन विधि मूल रूप से Trowe…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों प्रोटोकॉल के विकास में अपने प्रारंभिक काम के लिए ग्रेगरी हॉल (माउंट सेंट विंसेंट विश्वविद्यालय) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । लेखक भी निकोलस जोंस का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा (माउंट सेंट विंसेंट विश्वविद्यालय) अपनी तकनीकी विशेषज्ञता और सहायता के लिए फिल्मांकन और पांडुलिपि के ऑडियो/दृश्य भाग के उत्पादन के साथ । डैनियल एंड्रयूज MSVU से धन द्वारा समर्थित और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा के परिषद (NSERC) एक स्नातक छात्र अनुसंधान पुरस्कार के माध्यम से किया गया । टेलर ए फ्रांज-Odendaal एक NSERC डिस्कवरी अनुदान द्वारा समर्थित है ।
35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
forceps | FST | n/a | fine forceps |
chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
paper towel | n/a | n/a | store-bought |