Immunstimulerande Agent utvärdering: Lymfoida vävnad utvinning och injektion rutt-beroende dendritiska cellaktivering
Summary
Experimentella rutiner för efterföljande utvinning av lymfatiska vävnader att testa lymfoida dendritiska cellen aktiveringen beskrivs efter behandling av en immunstimulerande nanomaterial.
Abstract
För utvärdering av en ny terapeutisk agent för immunterapi eller vaccination är analys av immunceller aktivering i lymfatiska vävnader viktigt. Här, vi undersökte immunologiska effekter av en roman lipid-DNA immunostimulant i nanopartiklar form från olika administreringsvägar i musen: oral, intranasalt, subkutan, footpad, intraperitoneal och intravenös. Dessa injektioner kommer att direkt påverka immunsvaret och skörd lymfatiska vävnader och analys av dendritiska cellen (DC) aktivering i vävnaderna är avgörande delar av dessa utvärderingar. Utvinning av mediastinala lymfkörtlar (mLNs) är viktigt men ganska komplicerat på grund av storlek och läge av detta organ. Ett stegvis förfarande för skörd av inguinal lymfkörtel (iLN), mLN och mjälte och analysera DC aktivering av flödescytometri beskrivs.
Introduction
Framsteg inom immunologi och nanomaterial har lett till ett överflöd av potentiella nya terapeutiska strategier för applikationer inom biomedicin, inklusive drogen leverans och immunostimulering. Optimering av sträckan administration är en viktig aspekt som påverkar effekten av immunstimulerande medel. En immunstimulerande nanopartiklar (INP) som består av DNA är en nyutvecklad nano-immun adjuvant själv monteras av microphase separation på grund av lipid-DNA1amfifila struktur. Därför, protokoll för INP som omfattar administrering av den materiella1 i vivo via olika vägar och tre förfaranden för skörd lämpliga vävnader såsom den inguinal lymfkörtel (iLN), mediastinum LN (MUSD) och mjälte, är beskrivs. Slutligen, dessa vävnader analyserades för dendritiska cellen (DC) aktiveringen, de mest kraftfulla antigen-presenterande cellerna i immunsystemet. Detta protokoll kan också användas för att utvärdera antigener, antikroppar eller andra immun adjuvans2.
Vi testade INP formulering eftersom det är en agent som har visat stort löfte. INP är en Toll-like receptor 9 (TLR9) adjuvant material som innehåller nukleinsyror, för vilken bedömningen av immunostimulering effekt krävs att testa olika injektion metoder3. I detta sammanhang är stimulering av DCs en potent slutpunkt för i vivo utvärdering. Efter antigen eller immunstimulerande molekyler är fagocyteras av DCs i perifera vävnader eller blod, migrerar dessa celler till lymfoida organ som mjälte och LNs4,5. Därför analyserades DC aktivering i mjälte, iLN och mLN injicerade djuren. Korrekt skörd av dessa vävnader är därför också viktigt för att utvärdera immunsvaret mot en roman för adjuvant eller patogener5. Sådan vävnad skörd är också viktigt för att utveckla en ny immunologisk metodik som en cancerbehandling. Detta protokoll kan dessutom användas för att kontrollera effektiviteten av andra läkemedel, såsom anti-humant immunbrist virus therapeutics6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Många framsteg inom nanoteknik och immunologi har uppnåtts genom terapeutisk forskning av drogen leverans och immunostimulering. Noggrant urval av metoden injektion är kända för att vara viktigt för immunostimulering, som var i fokus för föreliggande studie.
Olika injektion rutter utvärderades ett naturligt giftfria och biologiskt nedbrytbara DNA-baserade material, INP (immunstimulerande nanopartiklar), att bestämma vilken väg gav det bästa resultatet. Detta tillvägagångssätt ä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av kreativt material Discovery Program genom den nationella forskning stiftelsen av Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT och framtida planering (NRF-2017M3D1A1039421) och marin bioteknik Program finansieras av den Departement av hav och fiske, Republiken Korea och bidrag (20150220).
Materials
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe – | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | – | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | – | FACS analysis |
References
- Park, H. . Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).
- Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
- Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).
- Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).
- Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).
- Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).
- Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- . . General anesthesia of mice and rats. , (2016).
- . . Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).
- . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
