Immunstimulerende middel evaluering: Lymfoide væv udvinding og injektion rute-afhængige dendritiske celle aktivering
Summary
Eksperimentelle procedurer for efterfølgende udvinding af lymfatisk væv til at teste lymfoide dendritiske celle aktivering er beskrevet efter behandling af en immunstimulerende nanomateriale.
Abstract
Evaluering af en ny terapeutisk agent for immunterapi eller vaccination er analyse af immun celle aktivering i lymfatisk væv afgørende. Her, vi undersøgte immunologiske effekter af en novel lipid-DNA immunostimulant i nanopartikel form fra forskellige administrationsveje i musen: oral, intranasal, subkutane, footpad, intraperitoneal, og intravenøs. Disse injektioner vil direkte påvirke immunrespons, og høst lymfatisk væv og analyse af dendritiske celler (DC) aktivering i væv er afgørende dele af disse evalueringer. Udvinding af mediastinale lymfeknuder (mLNs) er vigtig, men ganske komplekse på grund af størrelsen og placeringen af dette organ. En trinvis procedure til høst ingvinal lymfeknude (iLN), mLN og milt og analysere DC aktivering ved flowcytometri er beskrevet.
Introduction
Fremskridt inden for immunologi og nanomaterialer har ført til en overflod af potentielle nye terapeutiske strategier for programmer i biomedicin, herunder medicinafgivelse og immunostimulation. Optimering af ruten administration er et vigtigt aspekt, der påvirker effekten af immunstimulerende agenter. En immunstimulerende nanopartikel (INP) bestående af DNA er en nyudviklet nano-immune adjuverende selv samlet af microphase separation på grund af lipid-DNA1amphiphilic struktur. Derfor protokoller for INP involverer administrationen af de materielle1 i vivo via forskellige ruter, og tre procedurer for høst passende væv som den ingvinal lymfeknude (iLN), mediastinale LN (mio.), og milt, er beskrevet. Endelig blev disse væv analyseret for dendritiske celler (DC) aktivisering, de mest magtfulde antigen-præsenterer celler i immunsystemet. Denne protokol kan også anvendes til at vurdere antigener, antistoffer og andre immun adjuvanser2.
Vi testede INP formulering, fordi det er en agent, der har vist lovende. INP er en Toll-lignende receptor 9 (TLR9) adjuverende materiale, der indeholder nukleinsyrer, for hvilke vurderingen af immunostimulation effektivitet er forpligtet til at teste forskellige injektion metoder3. I denne sammenhæng er stimulation af DCs en potent slutpunkt i vivo evaluering. Efter antigen eller immunstimulerende molekyler er phagocytosed af DCs i perifere væv eller blod, vandrer disse celler til lymfoid organer som milt og LNs4,5. Således blev DC aktivering analyseret i milten, iLN og mLN af de injicerede dyr. Ordentligt høst af disse væv er derfor også afgørende for at vurdere immunrespons på en roman adjuverende eller patogener5. Sådanne væv høst er også vigtige for at udvikle en roman immunologiske metoder som en kræftbehandling. Denne protokol kan desuden bruges til at kontrollere effektiviteten af andre lægemidler, såsom anti-human immundefekt virus therapeutics6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mange fremskridt inden for nanoteknologi og Immunologi har opnået gennem terapeutiske forskning medicinafgivelse og immunostimulation. Omhyggelig udvælgelse af injektion metode er kendt for at være vigtige for immunostimulation, som var genstand for den foreliggende undersøgelse.
Forskellige injektion ruter blev evalueret for et naturligt, ikke-giftige og biologisk nedbrydelige DNA-baseret materiale, INP (immunstimulerende nanopartikel), til at bestemme, hvilken rute gav det bedste resulta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af kreative materialer Discovery Program gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT og fremtidige planlægning (NRF-2017M3D1A1039421) og af Marine bioteknologi Program finansieret af de Ministeriet af oceaner og fiskeri, Republikken Korea og et tilskud (20150220).
Materials
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe – | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | – | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | – | FACS analysis |
References
- Park, H. . Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).
- Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
- Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).
- Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).
- Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).
- Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).
- Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- . . General anesthesia of mice and rats. , (2016).
- . . Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).
- . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
