Summary

Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche

Published: September 16, 2018
doi:

Summary

Procedure sperimentali per l’estrazione successiva di tessuti linfatici per testare l’attivazione delle cellule dendritiche linfoidi sono descritti dopo il trattamento di un nanomateriale immunostimulating.

Abstract

Per la valutazione di un nuovo agente terapeutico per l’immunoterapia o la vaccinazione, analisi di attivazione delle cellule immuni in tessuti linfatici è essenziale. Qui, abbiamo studiato gli effetti immunologici di un immunostimolante di romanzo del lipido-DNA in forma di nanoparticelle da vie di somministrazione differenti nel topo: orale, intranasale, sottocutanea, zampa, intraperitoneale ed endovenosa. Queste iniezioni influenzerà direttamente la risposta immunitaria e la raccolta dei tessuti linfatici e analisi dell’attivazione delle cellule dendritiche (DC) nei tessuti sono parti cruciali di queste valutazioni. L’estrazione dei linfonodi mediastinici (mLNs) è importante ma abbastanza complessa a causa della dimensione e la posizione di questo organo. È descritta una procedura graduale per la raccolta il linfonodo inguinal (iLN), mLN e la milza e l’analisi di attivazione delle DC tramite flusso cytometry.

Introduction

Progressi in immunologia e nanomateriali hanno portato ad un’abbondanza di nuove strategie terapeutiche potenziali per applicazioni nel campo della biomedicina, tra cui immunostimolazione e consegna della droga. Ottimizzazione della via di somministrazione è un aspetto fondamentale che influenzano l’efficacia degli agenti immunostimulatory. Una nanoparticella di immunostimulatory (INP) costituito da DNA è un nuova concezione adiuvante di nano-immunitario auto-assemblato da microphase separazione a causa della struttura anfifilica di lipido-DNA1. Di conseguenza, protocolli per INP che coinvolge amministrazione del materiale1 in vivo tramite percorsi diversi e tre procedure per la raccolta di tessuti appropriati come il linfonodo inguinal (iLN), LN (mLN) mediastinica e la milza, sono descritto. Infine, questi tessuti sono stati analizzati per l’attivazione delle cellule dendritiche (DC), le cellule presentanti l’antigene più potente del sistema immunitario. Questo protocollo può essere applicato anche per la valutazione di antigeni, anticorpi o altri adiuvanti immuni2.

Abbiamo testato la formulazione INP perché è un agente che ha mostrato grande promessa. INP è un recettore Toll-like 9 (TLR9) materiale ausiliario che contiene acidi nucleici, per la cui valutazione di immunostimolazione efficacia è necessario verificare iniezione differenti metodi3. In questo contesto, la stimolazione di DCs è un potente endpoint per la valutazione in vivo . Dopo molecole dell’antigene o immunostimulatory phagocytosed dal DCs in tessuti periferici o sangue, queste cellule migrano verso organi linfoidi come la milza e LNs4,5. Così, attivazione delle DC è stato analizzato in milza, iLN e mLN degli animali iniettati. Pertanto è anche cruciale per valutare la risposta immunitaria ad un romanzo di adiuvante o agenti patogeni5correttamente la raccolta di questi tessuti. Tale raccolta di tessuto è anche importante per lo sviluppo di una nuova metodologia immunologica come terapia del cancro. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per verificare l’efficacia di altri farmaci, come il virus dell’immunodeficienza umana terapeutica6.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali tra cui isolamento di manipolazione, sacrificio e organo animale sono state eseguite in stretta conformità con le regole del Comitato uso presso centro clinico di salute pubblica di Shanghai e Asan Medical Center e International Animal Care. Il protocollo di studio è stato approvato dai rispettivi comitati di etica di animale esperimenti presso Shanghai Public Health Clinical Center (numero di protocollo del Mouse: SYXK-2010-0098) e Asan Medical Center (2016-02-168). <p class="jove_t…

Representative Results

Per valutare percorsi appropriati iniezione di INP per l’attivazione del tessuto linfatico DC, la popolazione di DC come lignaggio è stata definita —CD11c+ cellule nella milza, iLN e mLN e analizzati i livelli di espressione di molecole costimolatorie. Trattamento di INP iniezione endovenosa (i.v.) e sottocutanea (s.c.) ha promosso gli aumenti sostanziali nell’espressione CD40, CD80 e CD86 in milza e iLN DCs (Figura 2B</stron…

Discussion

Molti progressi nella nanotecnologia e immunologia sono stati raggiunti attraverso ricerca terapeutica della somministrazione di farmaci e immunostimolazione. Un’attenta selezione del metodo di iniezione è conosciuta per essere importante per immunostimolazione, che era l’obiettivo del presente studio.

Itinerari di iniezione differenti sono stati valutati per un naturalmente non tossici e biodegradabile basati sul DNA materiale, INP (immunostimulatory delle nanoparticelle), per determinare qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata supportata dal programma di Creative materiali scoperta attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro pianificazione (NRF-2017M3D1A1039421) e dal programma di biotecnologie Marine finanziato dalla Ministero degli oceani e pesca, Repubblica di Corea e una borsa di studio (20150220).

Materials

Material
phosphate buffer saline Corning 21-040-CVR Washing organs
(PBS, pH 7.4)
isoflurane solution  Aesica Queenborough limited 26675-46-7 Anesthesia process
Tuberculin 1mL syringe – Junglim N/A Injection
50 mL conical tube  S.P.L 50050 Anesthesia process
1mL Insulin Syringe  (BD Ultra-FineTM­II)_short needle 324826 Intramuscular Injection
DMEM High Glucose Hyclone SH30081.01 Storing organs
Histopaque  Sigma-Aldrich 10771 FACS analysis
Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %  Daejung 4022-4110 Disinfectant
Equipments
FineCycler C100 (Thermocycler) Ssufine Anealing
Centrifuge Centrifuge
FACS tube  FALCON 2052 FACS analysis
Automated High-performance Flow Cytometer BD (USA), FACSVerse FACS analysis

References

  1. Park, H. . Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).
  2. Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
  3. Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).
  4. Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).
  5. Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).
  6. Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).
  7. Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
  8. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  9. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  10. . . General anesthesia of mice and rats. , (2016).
  11. . . Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).
  12. . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  13. . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  14. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).

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Cite This Article
Jin, J., Jang, S., Kim, H., Oh, J., Shim, S., Kwak, M., Lee, P. C. Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation. J. Vis. Exp. (139), e57640, doi:10.3791/57640 (2018).

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