Summary

Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung

Published: September 16, 2018
doi:

Summary

Experimentelle Verfahren für die spätere Gewinnung von lymphatischen Gewebe, lymphatischen Dendritische Zelle Aktivierung testen werden nach der Behandlung eine immunstimulierende Nanomaterials beschrieben.

Abstract

Für die Bewertung der neuen Therapeutikum für Immuntherapie oder Impfung ist Analyse der immun-Zell-Aktivierung in lymphatischen Geweben unerlässlich. Hier untersuchten wir immunologische Effekte von einem neuartigen Lipid-DNA immunstimulierende Nanoparticle Form aus verschiedenen Verwaltung Routen in der Maus: oral, intranasale, subkutane, Straßenräuber, intraperitoneale und intravenöse. Diese Injektionen direkt beeinflussen, die Immunantwort und Ernte lymphatische Geweben und Analyse von dendritischen Zellen (DC) Aktivierung in den Geweben sind wichtige Teile dieser Bewertungen. Die Gewinnung von mediastinalen Lymphknoten (mLNs) ist wichtig aber recht komplex aufgrund der Größe und Lage dieses Organs. Eine schrittweise Vorgehensweise für die Ernte der inguinalen Lymphknoten (iLN), mLN und Milz und Analyse von DC-Aktivierung durch Durchflusszytometrie wird beschrieben.

Introduction

Fortschritte in der Immunologie und Nanomaterialien haben zu einer Fülle von potenziellen neuen Therapiestrategien für Anwendungen in der Biomedizin, einschließlich Drug-Delivery und Immunstimulierung geführt. Optimierung der Verwaltung Route ist ein wichtiger Aspekt betrifft die Wirksamkeit von immunstimulierenden Agenten. Ein immunstimulierenden Nanopartikel (INP) bestehend aus DNA ist eine neu entwickelte Nano-immun adjuvante selbst durch Microphase Trennung aufgrund der AMPHIPHILE Struktur der Lipid-DNA1montiert. Daher, Protokolle für INP mit Verwaltung des materiellen1 in Vivo über verschiedene Routen und drei Verfahren für die Ernte geeignete Gewebe wie die inguinalen Lymphknoten (iLN), Mediastinale LN (mLN) und Milz, beschrieben. Schließlich wurden diese Gewebe für die Aktivierung von dendritischen Zellen (DC), der mächtigsten Antigen-präsentierenden Zellen im Immunsystem analysiert. Dieses Protokoll kann auch angewendet werden, für die Bewertung der Antigene, Antikörper oder andere immun Adjuvantien-2.

Wir testeten die INP-Formulierung, weil es ein Mittel ist, das großes Versprechen gezeigt hat. INP ist ein Toll-Like-Rezeptor 9 (TLR9) adjuvante Material, die Nukleinsäuren, für die Beurteilung der Immunstimulierung Wirksamkeit erforderlich enthält ist, um verschiedene Einspritzung Methoden3zu testen. In diesem Zusammenhang ist die Stimulation des DCs einen potenten Endpunkt für in Vivo Evaluation. Nachdem Antigen oder immunstimulierenden Moleküle von DCs im peripheren Gewebe oder Blut phagozytiertes sind, Wandern diese Zellen in lymphatischen Organen wie Milz und LNs4,5. So wurde DC-Aktivierung in der Milz, iLN und mLN der injizierten Tiere analysiert. Richtig ernten dieser Gewebe ist daher auch entscheidend für die Beurteilung der Immunantwort auf eine neuartige adjuvante oder Krankheitserreger5. Solche Gewebe Ernte ist auch wichtig für die Entwicklung einer neuartigen immunologischen Methodik als Krebstherapie. Darüber hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Effizienz von anderen Drogen, wie z. B. Anti-Human Immunodeficiency Virus Therapeutika6zu überprüfen.

Protocol

Alle experimentelle Verfahren einschließlich tierischen Handling, Opfer und Orgel Isolierung wurden unter strikter Einhaltung der Regeln des internationalen Animal Care und Use Committee auf Shanghai Public Health Klinikum und Asan Medical Center durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde genehmigt durch die zuständigen Gremien auf die Ethik von Tierversuchen Shanghai Public Health Klinikum (Maus-Protokoll-Nummer: SYXK-2010-0098) und Asan Medical Center (2016-02-168). 1. Vorbereitung des Materi…

Representative Results

Um entsprechende Injektion Routen von INP für die Aktivierung des lymphatischen Gewebes DC zu bewerten, die DC-Bevölkerung als Linie wurde definiert als –CD11c+ Zellen in der Milz, iLN und mLN und analysiert den Ausdruck Niveaus von co-stimulatory Molekülen. Behandlung von INP durch subkutane (s.c.) und intravenös (i.v.) Injektion gefördert erhebliche Erhöhungen der CD40, CD80 und CD86 Ausdruck in der Milz und iLN DCs (A…

Discussion

Viele Fortschritte in der Nanotechnologie und Immunologie wurden durch therapeutische Forschung Drug-Delivery und Immunstimulierung erzielt. Sorgfältige Auswahl der Injektion Methode ist bekanntermaßen wichtig für Immunstimulierung, die lag der Schwerpunkt der vorliegenden Studie.

Verschiedenen Injektion Routen wurden ausgewertet, für ein natürlich ungiftig und biologisch abbaubar DNA-basierte Material, INP (immunstimulierenden Nanopartikel), um festzustellen, welchen Weg das beste Ergebn…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde unterstützt durch kreative Materialien-Discovery-Programm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT und Zukunft planen (NRF-2017M3D1A1039421) und Marine Biotechnologie-Programm finanziert die Ministerium der Ozeane und Fischerei, Republik Korea und einen Zuschuss (20150220).

Materials

Material
phosphate buffer saline Corning 21-040-CVR Washing organs
(PBS, pH 7.4)
isoflurane solution  Aesica Queenborough limited 26675-46-7 Anesthesia process
Tuberculin 1mL syringe – Junglim N/A Injection
50 mL conical tube  S.P.L 50050 Anesthesia process
1mL Insulin Syringe  (BD Ultra-FineTM­II)_short needle 324826 Intramuscular Injection
DMEM High Glucose Hyclone SH30081.01 Storing organs
Histopaque  Sigma-Aldrich 10771 FACS analysis
Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %  Daejung 4022-4110 Disinfectant
Equipments
FineCycler C100 (Thermocycler) Ssufine Anealing
Centrifuge Centrifuge
FACS tube  FALCON 2052 FACS analysis
Automated High-performance Flow Cytometer BD (USA), FACSVerse FACS analysis

References

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Jin, J., Jang, S., Kim, H., Oh, J., Shim, S., Kwak, M., Lee, P. C. Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation. J. Vis. Exp. (139), e57640, doi:10.3791/57640 (2018).

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