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Immunology and Infection

Immunostimulatory एजेंट मूल्यांकन: लसीकावत् ऊतक निष्कर्षण और इंजेक्शन मार्ग-निर्भर वृक्ष सेल सक्रियण

doi: 10.3791/57640 Published: September 16, 2018

Summary

लसीकावत् वृक्ष कोशिका सक्रियण परीक्षण करने के लिए लसीका ऊतकों के बाद निष्कर्षण के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं एक immunostimulating nanomaterial के उपचार के बाद वर्णित हैं ।

Abstract

immunotherapy या टीकाकरण के लिए एक नया चिकित्सकीय एजेंट के मूल्यांकन के लिए, लसीका ऊतकों में प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण का विश्लेषण आवश्यक है । यहां, हम एक उपंयास लिपिड-डीएनए immunostimulant के प्रतिरक्षा प्रभाव की जांच की nanoparticle रूप में माउस में विभिंन प्रशासन के मार्गों से: मौखिक, intranasal, चमड़े के नीचे, footpad, intraperitoneal, और नसों में । इन इंजेक्शन सीधे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित करेगा, और लसीका ऊतकों और वृक्ष कोशिका (डीसी) के विश्लेषण की कटाई ऊतकों में सक्रियण इन मूल्यांकनों के महत्वपूर्ण हिस्से हैं । mediastinal लिम्फ नोड्स (mLNs) के निष्कर्षण महत्वपूर्ण है लेकिन इस अंग के आकार और स्थान की वजह से काफी जटिल है । वंक्षण लिम्फ नोड (iLN), मिलियन, और तिल्ली संचयन और प्रवाह cytometry द्वारा डीसी सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए एक stepwise प्रक्रिया का वर्णन किया गया है ।

Introduction

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इम्यूनोलॉजी और मैटीरियल्स में अग्रिमों दवा वितरण और immunostimulation सहित, चिकित्सा में अनुप्रयोगों के लिए संभावित नए चिकित्सीय रणनीतियों की एक बहुतायत के लिए नेतृत्व किया है । प्रशासन मार्ग के अनुकूलन immunostimulatory एजेंटों की प्रभावकारिता को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण पहलू है. एक immunostimulatory nanoparticle (INP) डीएनए से मिलकर एक नव विकसित नैनो-प्रतिरक्षा सहायक स्वयं है क्योंकि लिपिड के microphase संरचना के amphiphilic जुदाई द्वारा इकट्ठे-डीएनए1। इसलिए, विभिंन मार्गों के माध्यम सेvivo में 1सामग्री के प्रशासन को शामिल INP के लिए प्रोटोकॉल, और वंक्षण लिम्फ नोड (iLN), mediastinal LN (मिलियन), और तिल्ली के रूप में उचित ऊतकों की कटाई के लिए तीन प्रक्रियाओं, कर रहे हैं वर्णित. अंत में, इन ऊतकों वृक्ष सेल (डीसी) सक्रियकरण, सबसे शक्तिशाली प्रतिजन प्रतिरक्षा प्रणाली में कोशिकाओं को पेश करने के लिए विश्लेषण किया गया । इस प्रोटोकॉल भी प्रतिजनों, एंटीबॉडी, या अंय प्रतिरक्षा adjuvants2मूल्यांकन के लिए लागू किया जा सकता है । 

हम INP निर्माण का परीक्षण किया, क्योंकि यह एक एजेंट है कि महान वादा दिखाया गया है । INP रिसेप्टर 9 की तरह एक टोल है (TLR9) सहायक सामग्री है कि न्यूक्लिक एसिड होता है, जिसके लिए immunostimulation प्रभावकारिता का आकलन अलग इंजेक्शन तरीकों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है3. इस संदर्भ में, dc की उत्तेजना vivo मूल्यांकन में के लिए एक प्रबल समापन बिंदु है । के बाद प्रतिजन या immunostimulatory अणुओं परिधीय ऊतकों या रक्त में dc द्वारा phagocytosed हैं, इन कोशिकाओं तिल्ली और LNs4,5जैसे लसीकावत् अंगों के लिए विस्थापित । इस प्रकार, डीसी सक्रियकरण तिल्ली, iLN, और इंजेक्शन पशुओं के मिलियन में विश्लेषण किया गया था । ठीक से इन ऊतकों की कटाई इसलिए भी एक उपंयास सहायक या रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है5। इस तरह के ऊतक कटाई एक कैंसर चिकित्सा के रूप में एक उपंयास प्रतिरक्षा पद्धति के विकास के लिए भी महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के लिए अंय दवाओं की क्षमता को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ऐसे विरोधी मानव इम्यूनो वायरस के रूप में6चिकित्सकीय ।

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Protocol

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पशु हैंडलिंग, बलिदान सहित सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं, और अंग अलगाव शंघाई सार्वजनिक स्वास्थ्य नैदानिक केंद्र और आासान चिकित्सा केंद्र में अंतरराष्ट्रीय पशु देखभाल और उपयोग समिति के नियमों के साथ सख्त अनुसार प्रदर्शन किया गया । अध्ययन प्रोटोकॉल शंघाई सार्वजनिक स्वास्थ्य नैदानिक केंद्र (माउस प्रोटोकॉल संख्या: SYXK-2010-0098) और आासान चिकित्सा केंद्र (2016-02-168) में पशु प्रयोगों की नैतिकता पर संबंधित समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. सामग्री की तैयारी

नोट: एक नैनो-सहायक, INP, एक आत्म इकट्ठे लिपिड डीएनए वाहक, अर्थात् U4T, और CpG-oligonucleotide युक्त रूपांकन, eCpG, वर्तमान अध्ययन में immunotherapy और टीकाकरण के लिए उचित इंजेक्शन मार्ग परीक्षण करने के लिए नियोजित किया गया था 2 चूहों में . महत्वपूर्ण बात, ऐसे एंटीजन, एंटीबॉडी के रूप में अंय संभावित चिकित्सीय अणुओं, और सहायक एजेंटों INP के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है और एक ही पद्धति का उपयोग कर परीक्षण के नीचे वर्णित है ।

  1. INP योगों2,4,7
    1. U4T (१६० µ मीटर, वाहक) eCpG के साथ (८० µ एम, एक TLR9 एगोनिस्ट अनुक्रम युक्त) 1x फॉस्फेट की उपस्थिति में-खारा (पंजाब, पीएच ७.४) और MgCl2 (2 मिमी) । एनीलिंग के लिए मानक मात्रा एक पीसीआर ट्यूब में ५० और ११० µ एल के बीच है । 10 मिनट के लिए ९५ ° c करने के लिए मिश्रण गर्मी और फिर धीरे से शांत (1 ° c/ एनीलिंग प्रोटोकॉल लगभग 2 एच की आवश्यकता है ।
      चेतावनी: U4T युक्त तरल बहुत फोम है और ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    2. मेक ५० µ l aliquots INP तयारी; प्रत्येक इंजेक्शन के लिए सामग्री के ५० µ एल का उपयोग करें ।
      नोट: इंजेक्शन प्रति १०० µ एल के मामले में, सामग्री की उचित गणना के साथ चरण १.१ दोहराएँ.

2. सामान्य पशु प्रक्रिया

नोट: चूहों से निपटने के लिए वैकल्पिक तरीकों प्रयोगशाला आवश्यकताओं और अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल8के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है । जिस प्रकार चूहों का प्रयोग ६ सप्ताहीय C57BL ६ और मादा चूहों से किया जाता है.

  1. सामग्रियों की सूची
    1. तैयार तरल संवेदनाहारी (isoflurane), संवेदनाहारी मशीन, कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) साँस लेना चैंबर, निष्फल धुंध, संदंश, माउस निरोधक, दस्ताने, कांटे की शकल का संदंश, 1 इंच विदारक कैंची, 2 इंच विदारक कैंची, शराब के लिए नसबंदी, और इंसुलिन सिरिंज ।
  2. श्वसन संज्ञाहरण
    नोट: संज्ञाहरण intranasal, चमड़े के नीचे, footpad, और9चूहों के नसों में इंजेक्शन के लिए अनिवार्य है । एक vaporizer मशीन और ऑक्सीजन टैंक जुड़ा के साथ एक प्रेरण चैंबर इस प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    1. प्रेरण कक्ष में पशु प्लेस और ढक्कन कसकर बंद करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    2. 1 L/मिनट पर ऑक्सीजन प्रवाह और isoflurane के लिए 4% की एक प्रेरण स्तर के लिए vaporizer सेटिंग सेट ।
    3. पशु वजन के आधार पर चैंबर में पशुओं के जोखिम समय बदलती हैं; हालांकि, 10 से अधिक जोखिम के एस और हर 5 मिनट की निगरानी संज्ञाहरण10के लिए आवश्यक है ।
      नोट: कोई पेडल पलटा सफल संज्ञाहरण इंगित करता है ।
    4. isoflurane प्रारंभ करनेवाला बंद करें और isoflurane गैस के लिए कर्मियों के प्रदर्शन को रोकने के लिए ऑक्सीजन की 1 एल/
  3. बलिदान
    1. NIH "कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर कुतर के इच्छामृत्यु के लिए दिशानिर्देश"11के अनुसार सह के लिए एक चैंबर तैयार करें ।
  4. परीक्षण ढकोसला प्रतिक्रिया जानवर पूरी तरह से बलिदान दिया है कि पुष्टि करने के लिए ।
    1. सत्यापित करें कि माउस ठीक से अपने पैर की नोक चुटकी और कोई ढकोसला प्रतिक्रिया की पुष्टि द्वारा बलि दी है । यदि कोई प्रतिसाद है, तो चरण २.२ दोहराएँ ।
  5. कीटाणुशोधन
    1. शराब स्प्रे और निष्फल धुंध के साथ इंजेक्शन या विच्छेदों के लिए इस्तेमाल सभी सतह क्षेत्रों को संक्रमित ।
  6. अंग भंडारण
    1. संदंश का उपयोग करने के लिए सभी वसा और खून की कटाई अंगों आसपास हटाने । इन फसल के ऊतकों को व्यक्तिगत रूप से पंजाब के 3 मिलीलीटर से भरा एक पेट्री डिश में स्टोर । कंटेनर और मीडिया क्रमिक प्रक्रिया आवश्यकताओं के आधार पर अलग हो सकता है ।

3. इंजेक्शन मार्गों

  1. इंजेक्शन पर निर्भर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए छह इंजेक्शन विधियों का उपयोग करें: मौखिक, intranasal, चमड़े के नीचे, footpad, intraperitoneal, और नसों में8,12,13.

4. लिम्फ नोड्स और तिल्ली का अलगाव

नोट: युवा और स्वस्थ दुबला चूहों का उपयोग करें (6 सप्ताह पुरानी) इन प्रक्रियाओं के लिए क्योंकि आम तौर पर पुराने चूहों में लिम्फ नोड्स के आसपास का निर्माण वसा को दूर करने के लिए मुश्किल है और अंग के उचित दृश्य को रोका जा सकता है.

  1. पूर्व कटाई कदम
    नोट: यह खंड iLN, तिल्ली, और प्रतिरक्षा उत्तेजना का विश्लेषण करने के लिए चूहों से मिलियन की कटाई के बाद इंजेक्शन का वर्णन करता है. बलिदान, चुप प्रतिक्रिया, और संक्रमण के तरीकों के लिए 2.3-2.5 चरणों का संदर्भ लें ।
    1. सर्जिकल फोम बोर्ड के लिए माउस के अंगों पिन और ७०% इथेनॉल के साथ माउस के ventral पक्ष निष्फल ।
    2. जननांग क्षेत्र के ऊपर एक स्थान 2 सेमी उठाओ और एक तंबू की तरह बाहरी त्वचा कवर खींचने के लिए झुका संदंश का उपयोग करें । इस स्थान पर लगभग 1 सेमी की कटौती करें और त्वचा के नीचे कैंची (2 इंच) स्लाइड, आगे विच्छेदन में कटौती कर रही है ।
    3. झिल्ली के लिए, कैंची (2 इंच) के दोनों हथियारों के साथ बाहरी त्वचा के माध्यम से खड़ी काट । आंतरिक योनि के साथ कवर अंगों बेनकाब ।
    4. त्वचा की बाहरी परत को पिन कर दीजिये ।
  2. वंक्षण लिम्फ नोड के अलगाव (iLN)
    1. बाएं पैर नीचे जा रहा है, जो एक झुका पत्र ' Y ' के रूप में प्रकट होता है रक्त वाहिका के संयोजन के बाद पैर के बाईं ओर iLN का पता लगाएँ ।
      नोट: चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए चूहों, इंजेक्शन स्थान के एक ही पक्ष पर एक iLN का चयन करें ।
    2. कवर लिपिड परत चीर और पीली पीली iLN (सेम आकार, 2 मिमी) फसल के लिए दो संदंश के साथ परत को उजागर । बाद में उपचार और ऊतक के भंडारण के लिए, चरण २.६ देखें ।
  3. तिल्ली का अलगाव 14
    1. एक हाथ में झुका संदंश का उपयोग कर और दूसरे हाथ में छोटे पतले कैंची (1 इंच) का उपयोग करने के लिए एक ही समय में एक तम्बू के केंद्र में एक तंबू बनाने के लिए ।
    2. उपयोग बाएं हाथ में झुका संदंश आंत समझ और यह फ्लिप पर लाल बीन की तरह तिल्ली (लगभग 14 मिमी की लंबाई) माउस पेट के बाईं ऊपरी तरफ से जुड़ी ।
    3. धीरे बाहर दाएं हाथ में संदंश का एक और सेट के साथ तिल्ली खींच जबकि कांटे की शकल का संदंश के साथ अंय अंगों को अलग । तिल्ली की दुकान करने के लिए २.६ कदम का पालन करें ।
      नोट: देखभाल की आवश्यकता है जब तिल्ली कटाई, के रूप में यह एक आसानी से क्षतिग्रस्त नरम अंग है ।
  4. mediastinal लिम्फ नोड (मिलियन) का अलगाव
    नोट: मिलियन लगभग 1 सेमी पसलियों के नीचे स्थित है और इस तरह के दिल और फेफड़ों के रूप में अन्य अंगों द्वारा कवर किया जाता है । अपने स्थान और छोटे आकार की वजह से, यह ध्यान से आसपास के क्षेत्र संदंश और कैंची (1 इंच) का उपयोग कर बेनकाब करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    1. डायाफ्राम काटें और इसे पसलियों से अलग करें । संदंश के साथ पसलियों के शरीर को पकड़ो और फिर कैंची (1 इंच) के साथ पसलियों के बाईं और दाईं ओर काट । दिल और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए सही पर माउस के कंधे पर कटऑफ पसलियों पिन.
      नोट: ध्यान रखना दिल और फेफड़ों के आसपास रक्त वाहिकाओं के किसी भी कटौती नहीं, खून लीक के रूप में यह बहुत छोटे पारदर्शी मिलियन का पता लगाने के लिए मुश्किल बना देता है । यदि किसी भी रक्त वाहिकाओं में कटौती कर रहे हैं, धीरे धुंध के साथ क्षेत्र में रक्त को अवशोषित ।
    2. दाहिने हाथ में झुका संदंश का प्रयोग, दिल और फेफड़ों धीरे सही करने के लिए जब तक रीढ़ उजागर है फ्लिप । बाएं हाथ में नियमित संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए इस कटाई के साथ सहायता करने के लिए दाहिने हाथ में हुक संदंश के साथ iLN को दूर ।
    3. फेफड़ों को पकड़ो और उंहें फ्लिप जब तक रीढ़ व्यापक रूप से उजागर है । मिलियन (आकार में लगभग 2 मिमी की एक पारदर्शी सेम के आकार की संरचना) फेफड़ों और रीढ़ की हड्डी के बीच स्थित है ।
    4. मिलियन और अंय संदंश ऊतक निकालने के आसपास के क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए झुका संदंश का उपयोग ।
      नोट: मिलियन कई अंय ऊतकों जो ध्यान से फसल से पहले संदंश के साथ हटाया जाना चाहिए से घिरा हुआ है ।
    5. हार्वेस्ट्ड मिलियन को संग्रहीत करने के निर्देशों के लिए २.७ चरण देखें ।

5. फ्लो cytometry के लिए नमूनों की तैयारी

नोट: काटा iLN, तिल्ली, और मिलियन में dc के सक्रियण परख करने के लिए, इन ऊतकों के एकल सेल निलंबन डीसी-विशिष्ट मार्करों, सह stimulatory अणुओं, और प्रमुख histocompatibility परिसर के रूप में प्रतिदीप्ति-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं अणु और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया ।

  1. सिंगल सेल के निलंबन की तैयारी: तिल्ली
    1. 6 मिमी संस्कृति डिश में ताजा संस्कृति मध्यम (सेमी) के 5 मिलीलीटर जोड़ें और बर्फ पर नमूने जगह है ।
    2. आसपास के रक्त और वसा ऊतकों निकालें और संस्कृति पकवान के ढक्कन में ऊतक जगह है ।
    3. ऊतकों को घुमावदार कैंची से छोटे टुकड़ों (< 1 mm) में काट लें । पंजाब में टुकड़ों को निलंबित 5 मिनट के लिए ६४६ × जी में एक केंद्रापसारक का उपयोग कर नीचे कताई और supernatant को हटाने के द्वारा पीछा किया ।
    4. सेमी के 3 मिलीलीटर में फिर से नमूनों को निलंबित और 20 मिनट के लिए collagenase चतुर्थ के साथ पूरक 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के समाधान के २०० µ एल के साथ टुकड़े को पचाने.
    5. धीरे शेक और 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूना मशीन नायलॉन मेष (१०० एनएम) के माध्यम से पचा ऊतकों को फ़िल्टर और उंहें नीचे स्पिन । पंजाब के 5 मिलीलीटर में एकल कोशिकाओं को धो लें और supernatant द्वारा केंद्रापसारक को हटा दें ।
    6. कक्ष अलग समाधान के 5 मिलीलीटर में कक्षों को पुन: निलंबित । पुन: एक जलीय परत द्वारा परत के ढेर के रूप में स्पष्ट कोशिका अलगाव समाधान के 5 मिलीलीटर की एक और परत लोड ।
    7. 10 मिनट के लिए २०१२ × जी में सेल तैयारी केंद्रापसारक supernatant, जो हल्का घनत्व अंश (< 1.077 g/cm3), बाद के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए प्राप्त करें ।
    8. किसी hemocytometer के साथ कक्षों की संख्या गिनना ।
  2. सिंगल सेल सस्पेंशन की तैयारी: लिम्फ नोड
    1. कदम 5.1.1-5.1.2 का पालन करें ।
    2. pipetting द्वारा 3-4 बार कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए एक 10 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग कर CM के 5 मिलीलीटर जोड़ें । अच्छी तरह से कोशिकाओं को सस्पैंड करने के बाद, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में संग्रह के लिए कोशिकाओं को फिल्टर करने के लिए बाँझ नायलॉन जाल का उपयोग करें ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए ६४६ ×जी में नीचे कोशिकाओं स्पिन और supernatant हटा दें ।
    4. बेहतर pipetting द्वारा कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए 10 मिलीलीटर प्लास्टिक में सेमी की एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
    5. पंजाबियों से धोएं और कोशिकाओं की संख्या की गणना करें ।
  3. प्रवाह cytometry विश्लेषण
    1. प्रत्येक प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) ट्यूब में Aliquot 0.5-1 × 106 कोशिकाओं.
    2. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ६४६ × जी में केंद्रापसारक और महाप्राण supernatant ।
    3. प्रत्येक पतला प्रतिदीप्ति के 5 µ एल जोड़ें-कोशिकाओं को संयुग्मित एंटीबॉडी तैयारी फिर से सेल गोली और भंवर निलंबित ।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है प्रकाश जोखिम से सेल गोली ढाल के रूप में जितना संभव हो क्योंकि फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी प्रकाश संवेदनशील हैं । एक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण उत्पन्न और हमेशा एफसी ब्लॉक जोड़ें.
    4. पंजाब के १०० µ l का उपयोग कर FACS बफर तैयार करें, 1% ताप-निष्क्रिय नियमित FBS, और ०.१% सोडियम azide ।
    5. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब में नमूना प्लेस. FACS बफर की 2-4 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला और 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए १७०० rpm पर नमूना केंद्रापसारक ।
    6. कोशिकाओं को पुनः निलंबित ५०० µ में FACS बफर के एल अंधेरे में । प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण ।

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Representative Results

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लसीका ऊतक डीसी सक्रियकरण के लिए INP के उचित इंजेक्शन मार्गों का मूल्यांकन करने के लिए, के रूप में डीसी जनसंख्या वंश के रूप में परिभाषित किया गया था CD11c+ तिल्ली, iLN, और मिलियन में कोशिकाओं और सह stimulatory अणुओं की अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण । INP (एस॰सी॰) और नसों में (i.v.) इंजेक्शन पदोंनत CD40, CD80, और तिल्ली और CD86 में iLN अभिव्यक्ति में पर्याप्त वृद्धि पदोन्नत द्वारा उपचार (2बी और 2c) । INP के Footpad और intraperitoneal (आईएफसआई) इंजेक्शन भी काफी ऊपर-CD40, CD80, और CD86 की तिल्ली और iLN dc में पंजाब-इलाज नियंत्रण (चित्रा 2 बी और 2c) की तुलना में अभिव्यक्ति के स्तर को विनियमित । में उत्तेजित मिलियन dc, intranasal (i.n.) INP के इंजेक्शन के सबसे ऊपर पदोंनत सह के विनियमन-stimulatory अणुओं की तुलना में है कि पंजाब में इलाज नियंत्रण (चित्रा 2d) । आईएफसआई और INP के i.v. इंजेक्शन भी मिलियन में सह stimulatory अणु अभिव्यक्ति में वृद्धि के रूप में चिह्नित प्रेरित किया, जबकि मौखिक, एस॰सी॰, और footpad के INP इंजेक्शन मिलियन dc (चित्रा 2d) के सक्रियकरण प्रेरित नहीं था ।

Figure 1
चित्रा 1 : intraperitoneal इंजेक्शन बिंदु का स्थान कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : नसों में इंजेक्शन का सटीक स्थान कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : डीसी सक्रियकरण लसीका अंगों में प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया । C57BL/6 चूहों INP के साथ छह अलग इंजेक्शन मार्गों द्वारा इंजेक्शन और इंजेक्शन के बाद 24 ज, तिल्ली, iLN और मिलियन काटा गया । (क) लसीका ऊतक कोशिकाओं में डीसी जनसंख्या वंश के रूप में परिभाषित किया गया था -CD11c+ लाइव ल्यूकोसाइट्स में कोशिकाओं । (बी-डी) CD40 की अभिव्यक्ति का स्तर, CD80, और CD86 तिल्ली में प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया (ख), iLN (सी), और मिलियन (डी). आंकड़े छह स्वतंत्र नमूनों के विश्लेषण से फलां हैं । परिणाम मतलब (SEM) के अर्थ ± मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । प्रयोगात्मक समूहों के बीच अंतर के सांख्यिकीय महत्व के साथ बिगड़ा हुआ है छात्र टीपरीक्षण के साथ विचरण के विश्लेषण का उपयोग कर की गणना की गई । p-मान < 0.05 महत्वपूर्ण माने गए थे । * < 0.05, * * < 0.01. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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नैनो और इम्यूनोलॉजी में कई अग्रिमों दवा वितरण और immunostimulation के चिकित्सीय अनुसंधान के माध्यम से प्राप्त किया गया है । इंजेक्शन विधि के सावधान चयन immunostimulation के लिए महत्वपूर्ण है, जो वर्तमान अध्ययन का ध्यान केंद्रित किया गया जाना जाता है ।

विभिन्न इंजेक्शन मार्गों एक स्वाभाविक रूप से गैर विषैले और biodegradable डीएनए आधारित सामग्री के लिए मूल्यांकन किया गया, INP (immunostimulatory nanoparticle), जो मार्ग निर्धारित करने के लिए सबसे अच्छा परिणाम झुकेंगे. यह दृष्टिकोण एंटीबॉडी, एंटीजन, या अन्य adjuvants सहित अन्य चिकित्सीय एजेंटों को पहुंचाने के लिए भी प्रासंगिक है ।

इस तरह के इंजेक्शन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए, लसीका ऊतक की फसल (तिल्ली, iLN, और मिलियन) की आवश्यकता है । लसीका ऊतकों का अलगाव इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण पहलू है और एक तकनीक है कि विस्तार से पहले वर्णित नहीं किया गया है के उपयोग की आवश्यकता है । इसके अलावा, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एकल सेल निलंबन की तैयारी अच्छी तरह से वर्णित नहीं किया गया है । इस अध्ययन लसीका ऊतकों की निकासी पर ध्यान केंद्रित, विशेष रूप से iLN, मिलियन, और तिल्ली, डीसी सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए. प्रणालीगत सक्रियकरण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मुख्य रूप से तिल्ली में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के माध्यम से हुई । इसके अतिरिक्त, विशिष्ट ऊतक में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के पास लिम्फ नोड्स द्वारा नियंत्रित किया गया । नव विकसित प्रतिरक्षा modulatory अणुओं का मूल्यांकन करने के लिए निर्धारित है कि क्या अणु ऊतकों में प्रतिरक्षा उत्तेजना पैदा कर सकते है आयोजित किया जाना चाहिए । इसलिए, लसीका ऊतक अलगाव और डीसी सक्रियण के ऊतकों में विश्लेषण के लिए विधि नव विकसित प्रतिरक्षा stimulatory अणुओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

INP की प्रतिरक्षा stimulatory प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, iLN, मिलियन, और तिल्ली काटा गया था और INP लसीका डीसी सक्रियण को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था. के रूप में पहले से निर्धारित, INP प्रभावी रूप से चूहों2में dc में TLR9 उत्तेजना लक्ष्य । मैक्रोफेज भी चूहों में cytosolic TLR9 व्यक्त करते हैं. इसलिए, INP इंजेक्शन DC और मैक्रोफेज सक्रियण दोनों को प्रेरित कर सकते हैं । हालांकि, मैक्रोफेज परिधीय ऊतक कि ऊतक में रोगाणुओं के phagocytosis में योगदान में रहते हैं । इसके अलावा, प्रतिजन-प्रस्तुति क्षमता और मैक्रोफेज के लसीका ऊतक करने के लिए प्रवासी प्रभाव तुलना dc में उन से कमजोर कर रहे हैं । इसलिए, प्रतिरक्षा stimulatory प्रभाव के लिए INPs के इंजेक्शन मार्ग का मूल्यांकन लसीका ऊतक में dc की जांच के लिए उपयुक्त था ।

इसलिए, प्रतिरक्षा सहायक प्रशासन के मोड बहुत ध्यान से सफल immunotherapy और नरम सामग्री का उपयोग कर टीकाकरण को प्राप्त करने के लिए विचार किया जाना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध के राष्ट्रीय अनुसंधान कोरिया के फाउंडेशन (एनआरएफ) विज्ञान, आईसीटी और भविष्य की योजना (एनआरएफ-2017M3D1A1039421) और समुद्री जैव प्रौद्योगिकी द्वारा वित्त पोषित कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित के माध्यम से रचनात्मक सामग्री डिस्कवरी कार्यक्रम द्वारा समर्थित था महासागरों और मत्स्य पालन, कोरिया गणराज्य और एक अनुदान (२०१५०२२०) मंत्रालय ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
phosphate buffer saline Corning 21-040-CVR Washing organs
(PBS, pH 7.4)
isoflurane solution  Aesica Queenborough limited 26675-46-7 Anesthesia process
Tuberculin 1mL syringe - Junglim N/A Injection
50 mL conical tube  S.P.L 50050 Anesthesia process
1mL Insulin Syringe  (BD Ultra-FineTM­II)_short needle 324826 Intramuscular Injection
DMEM High Glucose Hyclone SH30081.01 Storing organs
Histopaque  Sigma-Aldrich 10771 FACS analysis
Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %  Daejung 4022-4110 Disinfectant
Equipments
FineCycler C100 (Thermocycler) Ssufine - Anealing
Centrifuge Centrifuge
FACS tube  FALCON 2052 FACS analysis
Automated High-performance Flow Cytometer BD (USA), FACSVerse - FACS analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, H. Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).
  2. Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
  3. Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, (10-11), 909-922 (2011).
  4. Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3, (9), 2054-2058 (2017).
  5. Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17, (1), 30-48 (2017).
  6. Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1, (5), 2263-2270 (2006).
  7. Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
  8. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  9. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (5), 600-613 (2011).
  10. General anesthesia of mice and rats. Animal Care and Use Standards Committee. (2016).
  11. Guidelines for the Euthanasia of Animals. Veterinary Record. (2013).
  12. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. (2018).
  13. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. (2018).
  14. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5, (8), 606-616 (2005).
Immunostimulatory एजेंट मूल्यांकन: लसीकावत् ऊतक निष्कर्षण और इंजेक्शन मार्ग-निर्भर वृक्ष सेल सक्रियण
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Jin, J. O., Jang, S., Kim, H., Oh, J., Shim, S., Kwak, M., Lee, P. C. W. Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation. J. Vis. Exp. (139), e57640, doi:10.3791/57640 (2018).More

Jin, J. O., Jang, S., Kim, H., Oh, J., Shim, S., Kwak, M., Lee, P. C. W. Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation. J. Vis. Exp. (139), e57640, doi:10.3791/57640 (2018).

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