Immunology and Infection

Immunostimulatory Agent evaluering: Lymfoid vev utvinning og injeksjon Ruteavhengig dendrittiske celle aktivering

Published: September 16, 2018 doi: 10.3791/57640

Jun-O Jin^1,2, Soyeong Jang³, Hyehyun Kim⁴, Junghwan Oh⁴, Sungbo Shim⁵, Minseok Kwak^3,4, Peter C.W. Lee⁶

¹Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai Medical College, Fudan University, ²Department of Medical Biotechnology, Yeungnam University, ³Department of Chemistry, Pukyong National University, ⁴Marine-integrated Bionics Research Center, Pukyong National University, ⁵Department of Biochemistry, Chungbuk National University, ⁶Department of Biomedical Sciences, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center

Summary

Eksperimentell prosedyrer for påfølgende utvinning av lymfatisk vev å teste lymfoide dendrittiske celle aktivering er beskrevet etter behandling av en immunostimulating nanomaterial.

Abstract

For evaluering av en ny terapeutisk agent for immunterapi eller vaksinasjon er analyse av immun celle aktivering lymfatisk vev viktig. Her vi undersøkt immunologiske virkningene av en roman lipid-DNA immunostimulant i hydrogenion skjemaet fra ulike administrasjon ruter i musen: muntlig, intranasal, subkutan, footpad, intraperitoneal og intravenøs. Disse injeksjoner vil direkte påvirke immunforsvaret og høsting lymfatisk vev analyse av dendrittiske celle (DC) aktivering i vev er viktige deler av disse vurderinger. Utvinning av mediastinal lymfeknuter (mLNs) er viktig, men ganske komplisert på grunn av størrelsen på og plasseringen av denne organ. Trinnvis fremgangsmåte for høsting lysken lymfeknute (iLN), mLN og milt og analysere DC aktivering av flowcytometri er beskrevet.

Introduction

Fremskritt innen immunologi og nanomaterialer har ført til en overflod av potensielle nye strategier for programmer i biomedisin, inkludert narkotika-leveranser og immunostimulation. Optimalisering av administrasjonen ruten er et viktig aspekt påvirker effekten av immunostimulatory agenter. En immunostimulatory hydrogenion (INP) bestående av DNA er en nyutviklet nano-immune adjuvant selv sammen med microphase separasjon på grunn av amphiphilic strukturen i lipid-DNA¹. Derfor protokoller for INP involverer administrasjon av materiale¹ i vivo via forskjellige ruter og tre prosedyrer for høsting riktig vev som den lysken lymfeknute (iLN), mediastinal LN (mLN) og milt, er beskrevet. Til slutt, disse vev ble analysert for dendrittiske celle (DC) aktivisering, de mektigste antigen-presentasjon cellene i immunsystemet. Denne protokollen kan også brukes for å vurdere antigener, antistoffer eller andre immun adjuvans².

Vi testet INP formulering fordi det er en agent som har vist store løftet. INP er en Toll-like reseptor 9 (TLR9) adjuvant materiale som inneholder nucleic syrer, hvilke vurdering av immunostimulation effekten er nødvendig å teste ulike injeksjon metoder³. I denne sammenheng er stimulering av DCs en potent endepunkt for i vivo evaluering. Etter antigen eller immunostimulatory molekyler er phagocytosed ved DCs i perifere vev eller blod, flytte disse cellene til lymfoide organer som milten og LNs⁴^,⁵. Dermed var DC aktivisering analysert i milten, iLN og millioner av injisert dyrene. Riktig høsting av disse vev er derfor også avgjørende for å vurdere immunforsvaret til en roman adjuvant eller patogener⁵. Slike vev høsting er også viktig for å utvikle en roman, immunologiske metodikk som kreft terapi. Videre, denne protokollen kan brukes til å kontrollere effektiviteten av andre stoffer, som anti-humant immunsvikt virus therapeutics⁶.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer inkludert dyr håndtering, offer og orgel isolasjon ble utført i strengt samsvar med reglene i internasjonale Animal Care og bruk komité i Shanghai klinisk helseavdelingen og Asan Medical Center. Studien protokollen ble godkjent av de respektive komiteene på etikk av dyr eksperimenter i Shanghai klinisk helseavdelingen (mus Protokollnummer: SYXK-2010-0098) og Asan Medical Center (2016-02-168).

1. forberedelse materiale

Merk: En nano-adjuvant INP, består av en selv montert lipid-DNA, nemlig U4T, og CpG-motiv som inneholder oligonucleotide, eCpG, var ansatt i denne studien å teste den aktuelle injeksjon ruten for immunterapi og vaksinasjon i mus². Viktigere, andre potensielle terapeutiske molekyler som antigener, antistoffer og adjuvant agenter kan erstatte INP og testet med samme metodikk beskrevet nedenfor.

INP formulering²^,⁴^,⁷
1. Anneal U4T (160 µM, carrier) med eCpG (80 µM, som inneholder en TLR9 Agonistiske sekvens) i nærvær av 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7.4) og MgCl₂ (2 mM). Standard volumet for avspenning er mellom 50 og 110 µL i et PCR-rør. Varm blandingen til 95 ° C i 10 min og deretter sakte kul (1 ° C/16 min) til 25 ° C ved hjelp av en thermocycler. Den annealing protokollen krever ca 2 timer.
  FORSIKTIG: U4T inneholder væsken er svært skummende og må behandles forsiktig.
2. Gjøre 50 µL dele INP forberedelse; Bruk 50 µL av materiale for hver injeksjon.
  Merk: Ved 100 µL per injeksjon, Gjenta trinn 1.1 med lated beregning av ingredienser.

2. general Animal prosedyrer

Merk: Alternative metoder for håndtering av musene kan brukes avhengig av laboratoriet krav og godkjent dyr protokoller⁸. Mus brukes er 6-uke-gamle C57BL/6 og kvinnelige mus.

Liste over materialer
1. Forberede den flytende bedøvelse (isoflurane), bedøvende maskin, karbondioksid (CO₂) innånding kammer, sterilisert gasbind, tang, mus restrainer, hansker, hekta pinsetter, 1-tommers dissecting saks, 2-tommers dissecting saks, alkohol for sterilisering, og insulin sprøyten.
Pustet
Merk: Anestesi er obligatorisk for intranasal, subkutan, footpad og intravenøs injeksjoner av mus⁹. En induksjon kammer med en vaporizer maskin og oksygen tank koblet brukes for denne prosedyren.
1. Plasser dyret i induksjon kammeret og tett Lukk lokket.
2. Flyt oksygen på 1 L/min og stille innstillingen fordamper til en induksjon nivå på 4% for isoflurane.
3. Variere eksponeringstiden for dyr i kammeret avhengig av dyr vekt; men mer enn 10 s og overvåking hver 5 min er nødvendig for anestesi¹⁰.
  Merk: Ingen pedal refleks indikerer vellykket anestesi.
4. Slå av isoflurane-spole og flow 1 L/min oksygen å hindre personell eksponering for isoflurane gass.
Offer
1. Forberede en kammer CO₂ innånding offer i henhold til NIH "retningslinjer for Euthanasia av gnagere bruker Carbon Dioxide"¹¹.
Test gag Svar å bekrefte at dyret er fullt ofret.
1. Kontroller at musen er riktig ofret ved knipe spissen av foten og bekrefte ingen vits respons. Hvis det er en respons, Gjenta trinn 2.2.
Desinfeksjon
1. Desinfiser alle flater brukes for injeksjoner eller disseksjoner med alkohol spray og sterilisert gasbind.
Orgel lagring
1. Bruke pinsett fjerne alle fett og blod rundt høstet organer. Lagre disse høstet vev individuelt i en Petriskål fylt med 3 mL PBS. Beholderen, og media kan variere avhengig av kravene påfølgende prosedyren.

3. injeksjon ruter

Bruk seks injeksjon metoder for å undersøke injeksjon-avhengige immunreaksjoner: muntlig, intranasal, subkutan, footpad, intraperitoneal, og intravenøs⁸^,¹²^,¹³.

4. isolering av lymfeknuter og milt

Merk: Bruk unge og friske mager mus (6 uker gamle) for disse prosedyrene fordi fettet som vanligvis bygges rundt lymfeknutene i eldre mus er vanskelige å fjerne og kan hindre riktig visualisering av orgelet.

Pre høsting trinn
Merk: Denne delen beskriver etter injeksjon høsting av iLN, milt og mLN fra mus for å analysere immune stimulering. Se trinnene 2.3-2.5 for offer, kneble svar og desinfeksjon metoder.
1. PIN lemmer av musen til kirurgisk skum bord og sterilisere ventrale siden av musen med 70% etanol.
2. Velg en plassering 2 cm over kjønnsorganene og bruk hekta pinsetter trekke opp ytre huden dekselet som et telt. Gjøre en ca 1 cm kuttet på denne plasseringen, og skyv saksen (2 tommer) under huden, gjør ytterligere disseksjon kutt.
3. For integumentum, kuttet loddrett gjennom den ytre huden med begge armene saks (2 tommer). Avdekke de indre organene dekket med peritoneum.
4. Feste det ytterste laget av huden.
Isolering av lysken lymfeknute (iLN)
1. Finn iLN på venstre side av benet etter sammen med blodkaret går ned venstre beinet, som vises som en skråstilt bokstaven "Y".
  Merk: For subcutaneously injisert mus, velge en iLN på samme side av injeksjon plasseringen.
2. Avdekke laget med to tang rippe dekket lipid laget og høste det blek gul iLN (bønne figur, 2 mm). Hvis etterfølgende behandling og lagring av vev, se trinn 2.6.
Isolasjon av milten ¹⁴
1. Gjør et telt i sentrum av peritoneum ved hjelp hekta pinsetter i den ene hånden og bruke liten tynn saks (1 tommer) i den andre hånden å kutte peritoneum.
2. Bruk hekta tang i venstre hånd for å forstå tarmen og knips det over å finne rød bønne-lignende milten (lengde ca 14 mm) tilknyttet til øvre venstre musen magen.
3. Trekk forsiktig ut milten med et annet sett med tang i høyre under frakobling andre organer med hekta tang. Følg trinn 2.6 lagre milten.
  Merk: Omsorg kreves når høsting milten, som det er et lett skadet myk organ.
Isolasjonen av mediastinal lymfeknute (mLN)
NOTE MLN er ligger ca 1 cm under ribbeina og er dekket av andre organer som hjertet og lungene. På grunn av sin beliggenhet og liten størrelse er det viktig å avsløre nøye området ved hjelp av tang og saks (1-tomme).
1. Skjær membranen og koble det fra ribbeina. Holde kroppen av ribben med tang og skjær på venstre og høyre ribben med saks (1-tomme). Feste cutoff ribbeina over musen er skulderen på retten til å avsløre hjertet og lungene.
  Merk: ta vare ikke for å kutte noen av blodkar rundt hjertet og lungene, lekker blod gjør det svært vanskelig å finne den lille gjennomskinnelig millioner. Hvis noen blodkar er kuttet, forsiktig absorbere blodet i området med gasbind.
2. Bruker hekta pinsetter i høyre hånd, Vend hjertet og lungene forsiktig til høyre til ryggraden er utsatt. Bruk et par vanlige tang i venstre hånd for å fjerne iLN med hekta tang i høyre hånd å hjelpe med dette høsting.
3. Grab lungene og snu dem til ryggraden er mye utsatt. Millioner (en gjennomsiktig bønne-formet struktur av omlag 2 mm i størrelse) ligger mellom lungene og ryggraden.
4. Bruke hekta tang å avsløre området rundt mLN og andre tang til å trekke ut vevet.
  Merk: MLN er omgitt av mange andre vev som må fjernes nøye med tang før innhøsting.
5. Se trinn 2.7 instruksjoner lagre høstet millioner.

5. forberedelse av prøver for flowcytometri

Merk: For å analysen aktivering av DCs i høstet iLN, milt og mLN, encellede suspensjon av disse vev er farget med fluorescens-konjugerte antistoffer som DC-spesifikke indikatorer, co-stimulatory molekyler og store histocompatibility kompleks molekyler og analysert av flowcytometri.

Utarbeidelse av encellede suspensjoner: spleen
1. Legg til 5 mL av fersk kultur medium (CM) i 6 mm kultur parabol og plassere prøvene på is.
2. Fjerne omkringliggende blod og fett vev og plasser vevet i lokket på kultur parabolen.
3. Skjær vev i små fragmenter (< 1 mm) med buet saks. Avbryte fragmenter PBS etterfulgt av spinne ned vev ved hjelp av en sentrifuge 646 × g i 5 min og fjerne nedbryting.
4. Suspendere prøvene igjen i 3 mL CM og fordøye fragmenter med 200 µL av løsning av 2% fosterets bovin serum (FBS) med collagenase IV for 20 min.
5. Forsiktig riste og ruge prøven på 37 ° C for 1 h. filtrere fordøyd vev gjennom nylon maske (100 nm) og spin dem ned. Vask enkeltceller i 5 mL av PBS og fjern nedbryting av sentrifugering.
6. Nytt suspendere cellene i 5 mL av cellen aisolering løsning. Re-load et lag av 5 mL av klare celle isolasjon løsning å danne en vandig lag-på-lag-stakk.
7. Sentrifuge celle forberedelse 2012 × g til 10 min. motta nedbryting, som er lettere tetthet brøken (< 1.077 g/cm³), for etterfølgende flyt cytometri analyse.
8. Tell antall celler med en hemocytometer.
Utarbeidelse av encellede suspensjoner: lymfeknute
1. Følg trinn 5.1.1-5.1.2.
2. Legge til 5 mL cm med en 10-mL Pipetter for å suspendere cellene av pipettering 3 - 4 ganger. Etter grundig suspenderes cellene, bruke sterilt nylon maske for å filtrere celler for samling i et 15-mL konisk rør.
3. Spinn cellene ned 646 ×g i 7 min på 4 ° C og fjerne nedbryting.
4. Legge til en ekstra 5 mL cm i 10-mL Pipetter bedre suspendere cellene av pipettering.
5. Vask med PBS og teller antall celler.
Flyt cytometri analyse
1. Aliquot 0,5-1 × 10⁶ celler i hver fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) rør.
2. Sentrifuge 646 × g på 4 ° C i 5 min og Sug opp nedbryting.
3. Legge til 5 µL av hver utvannet fluorescens-konjugerte antistoffer forberedelse til cellene til å suspendere celle pellets og vortex.
  Merk: Det er viktig å skjerme celle pellet fra lyseksponering som mulig fordi fluorescently merket antistoffer er lys-sensitive. Generere et antistoff master mix og legge til Fc blokk.
4. Forberede FACS buffer ved hjelp 100 µL av PBS, 1% av inaktivert vanlige FBS og 0,1% Natriumazid.
5. Plass prøven i røret ved 4 ° C i 30 min. skyll cellene med 2-4 mL FACS buffer og sentrifuge prøven på 1700 rpm i 7 min på 4 ° C.
6. Nytt suspendere cellene i 500 µL av FACS buffer i mørket. Analysere cellene av flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å vurdere aktuelle injeksjon ruter INP for lymfatisk vev DC aktivisering, DC befolkningen som linjen ble definert som ^-CD11c⁺ celler i milten, iLN og mLN og analysert uttrykk nivåene av co-stimulatory molekyler. Behandling av INP subcutaneous (SC) og intravenøs (IV) injeksjon forfremmet betydelige økninger i CD40, CD80 og CD86 uttrykk i milten og iLN DCs (figur 2B og 2 C). Footpad og intraperitoneal (IP) injeksjon av INP også betydelig opp-regulert uttrykk nivåene CD40, CD80 og CD86 i milten og iLN DCs sammenlignet i kontrollen PBS-behandlet (figur 2B og 2 C). I stimulert mLN DCs forfremmet intranasal (i.n.) injeksjon av INP høyeste opp-regulering av co-stimulatory molekyler forhold i kontrollen PBS-behandlet (figur 2D). IP og IV injeksjon av INP også indusert markerte økninger i co-stimulatory molekyl uttrykk millioner, mens muntlige, SC, og footpad injeksjon av INP indusere ikke aktivering av mLN DCs (figur 2D).

Figur 1 : Plassering av intraperitoneal injeksjon Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Nøyaktig plassering av intravenøs injeksjon Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : DC aktivering i lymfekar organer analysert av flowcytometri. C57BL/6 musene ble injisert med INP av seks forskjellige injeksjon ruter og 24 h etter injeksjon, milten, iLN og mLN ble høstet. (A) FM befolkningen i lymfatisk vev celler ble definert som avstamning ^-CD11c⁺ celler i levende leukocytter. (B-D) Uttrykket nivåene CD40, CD80 og CD86 ble analysert av flowcytometri i milten (B), iLN (C) og mLN (D). Dataene er gjennomsnitt fra analyser av seks uavhengige utvalg. Resultatene uttrykkes som betyr ± standard feil av gjsnitt (SEM). Den statistiske betydningen av forskjellene mellom eksperimentelle grupper ble beregnet med variansanalyse med kortet Student t-test. p-verdier < 0,05 ble vurdert betydelig. * < 0,05, ** < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mange fremskritt i nanoteknologi og immunologi er oppnådd gjennom terapeutisk forskning av narkotika-leveranser og immunostimulation. Nøye utvalg av injeksjon metoden er kjent for å være viktig for immunostimulation, som var fokus for studien.

Forskjellige injeksjon ruter ble vurdert for en naturlig giftfri og biologisk nedbrytbare DNA-materialet INP (immunostimulatory hydrogenion), til å bestemme hvilken rute gitt det beste resultatet. Denne tilnærmingen er også relevant for levering av andre terapeutiske agenter inkludert antistoffer, antigener eller andre adjuvans.

Analysere immun respons på slike injeksjoner, kreves av lymfatisk vev (milt, iLN og mLN). Isolering av lymfatisk vev er det mest avgjørende aspektet ved denne protokollen og krevde bruk av en teknikk som ikke har blitt beskrevet tidligere i detalj. Videre er utarbeidelse av encellede suspensjon for ytterligere analysere immunceller ikke godt beskrevet. Denne studien fokusert på utvinning av lymfatisk vev, spesielt den iLN mLN og milt, for å analysere DC aktivisering. Systemisk aktivering av immunrespons skjedde i hovedsak gjennom immunceller i milten. I tillegg var immunreaksjoner i bestemte vevet kontrollert av nærliggende lymfeknuter. Evaluering av nyutviklet immun modulatory molekyler bør utføres for å finne ut om molekyler kan indusere immune stimulering i vev. Metoden for lymfedrenasje vev isolering og analyse av DC aktivisering i vev kan derfor brukes for nyutviklet immun stimulerende molekyler.

For å evaluere immun stimulerende effekten av INP, iLN, mLN og milt ble høstet og INP ble vist å fremme lymfatiske DC aktivisering. Som tidligere, mål INP effektivt TLR9 stimulering i DCs i mus². Makrofager uttrykker også cytosolic TLR9 i mus. Derfor kan INP injeksjon indusere både DC og macrophage aktivisering. Imidlertid bor makrofager i perifere vev som bidrar til fagocytose av mikrober i vevet. Videre er antigen-presentasjon kapasiteten og vandrende effekt lymfatisk vev av makrofager sammenlignbare svakere enn i DCs. Derfor var vurdere injeksjon ruten INPs immun stimulerende effekten egnet for å undersøke DCs i lymfatisk vev.

Derfor må modus immun adjuvant administrasjon nøye vurderes vellykket immunterapi og vaksinering med myke materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av kreative funn programmet gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtid planlegger (NRF-2017M3D1A1039421) og marin bioteknologi program finansiert av den Departementet av hav og fiskeri, Sør-Korea og stipend (20150220).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
phosphate buffer saline	Corning	21-040-CVR	Washing organs
(PBS, pH 7.4)
isoflurane solution	Aesica Queenborough limited	26675-46-7	Anesthesia process
Tuberculin 1mL syringe -	Junglim	N/A	Injection
50 mL conical tube	S.P.L	50050	Anesthesia process
1mL Insulin Syringe	(BD Ultra-Fine^TMII)_short needle	324826	Intramuscular Injection
DMEM High Glucose	Hyclone	SH30081.01	Storing organs
Histopaque	Sigma-Aldrich	10771	FACS analysis
Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %	Daejung	4022-4110	Disinfectant
Equipments
FineCycler C100 (Thermocycler)	Ssufine	-	Anealing
Centrifuge			Centrifuge
FACS tube	FALCON	2052	FACS analysis
Automated High-performance Flow Cytometer	BD (USA), FACSVerse	-	FACS analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Park, H. Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).
Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).
Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).
Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).
Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).
Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
General anesthesia of mice and rats. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).
Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Veterinary Record. (2013).
JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).

Immunostimulatory Agent evaluering: Lymfoid vev utvinning og injeksjon Ruteavhengig dendrittiske celle aktivering

Play Video

PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jin, J. O., Jang, S., Kim, H., Oh,… More

Jin, J. O., Jang, S., Kim, H., Oh, J., Shim, S., Kwak, M., Lee, P. C. W. Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation. J. Vis. Exp. (139), e57640, doi:10.3791/57640 (2018).

Less

Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions

View Video