Immunostimulatory Agent evaluering: Lymfoid vev utvinning og injeksjon Ruteavhengig dendrittiske celle aktivering
Summary
Eksperimentell prosedyrer for påfølgende utvinning av lymfatisk vev å teste lymfoide dendrittiske celle aktivering er beskrevet etter behandling av en immunostimulating nanomaterial.
Abstract
For evaluering av en ny terapeutisk agent for immunterapi eller vaksinasjon er analyse av immun celle aktivering lymfatisk vev viktig. Her vi undersøkt immunologiske virkningene av en roman lipid-DNA immunostimulant i hydrogenion skjemaet fra ulike administrasjon ruter i musen: muntlig, intranasal, subkutan, footpad, intraperitoneal og intravenøs. Disse injeksjoner vil direkte påvirke immunforsvaret og høsting lymfatisk vev analyse av dendrittiske celle (DC) aktivering i vev er viktige deler av disse vurderinger. Utvinning av mediastinal lymfeknuter (mLNs) er viktig, men ganske komplisert på grunn av størrelsen på og plasseringen av denne organ. Trinnvis fremgangsmåte for høsting lysken lymfeknute (iLN), mLN og milt og analysere DC aktivering av flowcytometri er beskrevet.
Introduction
Fremskritt innen immunologi og nanomaterialer har ført til en overflod av potensielle nye strategier for programmer i biomedisin, inkludert narkotika-leveranser og immunostimulation. Optimalisering av administrasjonen ruten er et viktig aspekt påvirker effekten av immunostimulatory agenter. En immunostimulatory hydrogenion (INP) bestående av DNA er en nyutviklet nano-immune adjuvant selv sammen med microphase separasjon på grunn av amphiphilic strukturen i lipid-DNA1. Derfor protokoller for INP involverer administrasjon av materiale1 i vivo via forskjellige ruter og tre prosedyrer for høsting riktig vev som den lysken lymfeknute (iLN), mediastinal LN (mLN) og milt, er beskrevet. Til slutt, disse vev ble analysert for dendrittiske celle (DC) aktivisering, de mektigste antigen-presentasjon cellene i immunsystemet. Denne protokollen kan også brukes for å vurdere antigener, antistoffer eller andre immun adjuvans2.
Vi testet INP formulering fordi det er en agent som har vist store løftet. INP er en Toll-like reseptor 9 (TLR9) adjuvant materiale som inneholder nucleic syrer, hvilke vurdering av immunostimulation effekten er nødvendig å teste ulike injeksjon metoder3. I denne sammenheng er stimulering av DCs en potent endepunkt for i vivo evaluering. Etter antigen eller immunostimulatory molekyler er phagocytosed ved DCs i perifere vev eller blod, flytte disse cellene til lymfoide organer som milten og LNs4,5. Dermed var DC aktivisering analysert i milten, iLN og millioner av injisert dyrene. Riktig høsting av disse vev er derfor også avgjørende for å vurdere immunforsvaret til en roman adjuvant eller patogener5. Slike vev høsting er også viktig for å utvikle en roman, immunologiske metodikk som kreft terapi. Videre, denne protokollen kan brukes til å kontrollere effektiviteten av andre stoffer, som anti-humant immunsvikt virus therapeutics6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mange fremskritt i nanoteknologi og immunologi er oppnådd gjennom terapeutisk forskning av narkotika-leveranser og immunostimulation. Nøye utvalg av injeksjon metoden er kjent for å være viktig for immunostimulation, som var fokus for studien.
Forskjellige injeksjon ruter ble vurdert for en naturlig giftfri og biologisk nedbrytbare DNA-materialet INP (immunostimulatory hydrogenion), til å bestemme hvilken rute gitt det beste resultatet. Denne tilnærmingen er også relevant for levering a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av kreative funn programmet gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtid planlegger (NRF-2017M3D1A1039421) og marin bioteknologi program finansiert av den Departementet av hav og fiskeri, Sør-Korea og stipend (20150220).
Materials
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe – | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | – | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | – | FACS analysis |
References
- Park, H. . Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).
- Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
- Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).
- Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).
- Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).
- Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).
- Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- . . General anesthesia of mice and rats. , (2016).
- . . Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).
- . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
