Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

كفاءة توليد من البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1+ الخلفي المعي/البنكرياس "موروث" من هبسكس في "الثقافات الالتصاق"

Published: March 27, 2019 doi: 10.3791/57641
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

Summary

نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتفريق بين الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) في البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1+ (PDX1+) الخلايا لتوليد الأنساب البنكرياس استناداً إلى النمو غير مستعمرة نوع أحادي الطبقة فصل الخلايا المفردة. هذا الأسلوب مناسبة لإنتاج الخلايا المستمدة من هبسك متجانسة، والتلاعب بالجينات والفرز.

Abstract

الخلية الجذعية pluripotent البشرية (هبسك)-مشتقة من خلايا البنكرياس مصدر خلية واعدة للطب التجديدي، ومنبرا لدراسة العمليات الإنمائية البشرية. Stepwise توجيه التمايز الذي يلخص العمليات الإنمائية واحدة من الطرق الرئيسية لتوليد خلايا البنكرياس بما في ذلك البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1+ (PDX1+) خلايا البنكرياس السلف. بدء البروتوكولات التقليدية التمايز مع المستعمرات الصغيرة بعد المرور وقت قصير. ومع ذلك، في الدولة للمستعمرات أو المجاميع، الخلايا المعرضة للتغاير، التي قد تعوق التفرقة إلى PDX1+ الخلايا. نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتفريق بين هبسكس في PDX1+ الخلايا. ويتكون من أربع خطوات البروتوكول ويبدأ التمايز ببذر خلايا مفردة معزولة. تحريض SOX17+ وأعقب خلايا الأنسجة نهائي التعبير عن علامات أنبوب القناة الهضمية البدائية اثنين و HNF1β و HNF4α، والتمايز في نهاية المطاف إلى PDX1+ الخلايا. هذا البروتوكول يوفر سهولة التعامل وقد تحسين واستقرار كفاءة تمايز بعض خطوط هبسك التي عثر عليها سابقا التفريق بين طريقة غير فعالة في الأنساب اندوديرمال أو PDX1+ الخلايا.

Introduction

البنكرياس يتكون بشكل رئيسي من خلايا إفرازات والغدد الصماء، وبه خلل أو الزائد يسبب العديد من الأمراض، مثل التهاب البنكرياس ومرض السكري وسرطان البنكرياس. لتوضيح pathogeny بانكريتوباثي، من الضروري تحليل العملية التنموية ووظيفة خلايا البنكرياس. وبالإضافة إلى ذلك، مطلوب على إمدادات مستقرة من خلية مع وجوده لإنشاء خلية/الأنسجة مكملات العلاج. الخلية الجذعية pluripotent البشرية (هبسك)-مشتقة من خلايا البنكرياس مصدر خلايا واعدة لهذه الأغراض، والبروتوكول التمايز تجاه خلايا البنكرياس وقد درس مكثف1،2،3، 4. التقدم الذي أحرز مؤخرا في توليد في المختبر من خلايا β البنكرياس تقليد توليد خلايا بيتا في الكبار البشرية، وهذه الخلايا تظهر الفعالية العلاجية على غرس في نموذج السكري الفئران2،3. وباﻹضافة إلى ذلك، كشف تحليل الخلايا β المتولدة من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) في صحة جيدة والمانحين المريض السكري نوع 1 لا الاختلافات الوظيفية بما في ذلك عندما تحت الإجهاد5. وعلاوة على ذلك، تعمل المرض قد استنسخ جزئيا في خلايا البنكرياس المستحث مع إيبسكس المستمدة من المريض أو هبسكس إيواء الطفرات الوراثية في نفس الموقع كال6،المرضى7.

لإنشاء خلايا البنكرياس من هبسكس، يستخدم التمايز موجها التدرجي الذي يلخص العمليات الإنمائية. البنكرياس مشتق من طبقة الأنسجة للجنين المبكر، التي تعبر عن الجنس تحديد المنطقة Y-مربع 17 (SOX17) وفورخياد مربع A2 (FOXA2)8. استناداً إلى الدراسات الماوس، تشكل طبقة اندوديرمال أنبوب القناة الهضمية البدائية، التي تتميز بالتعبير عن تتمثل العوامل النووية 1-بيتا (Hnf1β) وتتمثل العوامل النووية 4-ألفا (Hnf4α). أنبوب القناة الهضمية البدائية الغضروفي ويطور في الجهاز التنفسي، والجهاز الهضمي، والأجهزة. بعد الإطالة، يصبح منطقة المعي الخلفي منطقة البنكرياس الظني، كما تميزت بالتعبير عن البروتين هوميوبوكس البنكرياس/العفج عامل النسخي 1 (PDX1)8،،من910. أجزاء الظهري والبطني PDX1+ القناة الهضمية أنبوب رشاقته على شكل براعم البنكرياس، التي تميزت بالتعبير المشترك عن البنكرياس النسخ عامل 1 ألفا فرعية (PTF1A) وهوميوبوكس NK6 18،(NKX6.1)11. ويعتبر هذا التعبير بداية المورفولوجية organogenesis البنكرياس. خلايا الأنسجة البنكرياس، ومكونات البراعم البنكرياس، تشكل شبكة أنبوبية متفرعة من هياكل الظهارية12 وتفرق في نهاية المطاف في إفرازات الغدد الصماء، والخلايا، بما في ذلك الخلايا β إفراز الأنسولين و إفراز الجلوكاجون α-الخلايا. التعبير عن PDX1 الكشف عن أولاً في منطقة البنكرياس الظني، ثم يلاحظ في جميع أنحاء تطوير البنكرياس كاملة، ويظهر التعريب إلى الخلايا β و δ9،،من1314. على الرغم من Pdx1+ يميز منطقة الخلية التي لا تعبر عن Ptf1a أو Nkx6.1 في التجويف المعدة والاثني عشر والقناة الصفراوية اكستراهيباتيك وبعض الخلايا المعوية في منتصف إلى أواخر مرحلة التنمية في الفئران9، PDX1+ وتعتبر الخلايا المتكفل البنكرياس في مرحلة النمو المبكر في البشر.

نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتفريق بين هبسكس في PDX1+ الخلايا لتوليد الأنساب البنكرياس. التمايز بتهيئة البروتوكول قبل البذر فصل خلايا مفردة15،،من1617. عموما، يتم الاحتفاظ هبسكس غير متمايزة كمستعمرات أو المجاميع الخلية في التعليق أو في الالتصاق. كنتيجة لذلك، يبدأ معظم البروتوكولات المفاضلة بعد وقت قصير من باساجينج. ومع ذلك، في حالة المستعمرات أو المجاميع، الخلايا المعرضة للتغاير المكانية والنسخي18،19،20،،من2122، التي قد تعرقل خطوة أولى تمايز الأنسجة نهائي متبوعاً بتمايز الكفاءة إلى PDX1+ الخلايا. هذا البروتوكول قد يتيح سهولة التعامل لتحسين واستقرار كفاءة تمايز بعض خطوط هبسك التي عثر عليها سابقا التفريق بين كفاءة الأنساب اندوديرمال و PDX1 الخلايا+ 23، 24 , 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تجارب باستخدام هبسكس بموافقة لجنة الأخلاقيات لقسم الطب ومدرسة الدراسات العليا للطب، جامعة كيوتو.

1-إعداد المواد

ملاحظة: إعداد جميع وسائل الإعلام والمواد الكاشفة لزراعة الخلايا في بيئة معقمة. الاحماء قاعدة وسائط الثقافة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام. المتوسطة للتمايز يتم استخدامه ضمن ح 6 في "تفاصيل الرايت" الكواشف يتم سردها في الجدول للمواد.

  1. التمايز (الشكل 1A)
    1. المرحلة المتوسطة 1A: نقل المتوسط RPMI 1640 في أنبوب باستخدام ماصة. إضافة الملحق خالية من المصل، وأضافت أ، CHIR99021، و Y-27632 بتركيز 1 x و 100 نانوغرام/مليلتر، 3 ميكرومتر و 10 ميكرومترات، على التوالي.
    2. المرحلة المتوسطة 1B: نقل المتوسط RPMI 1640 في أنبوب باستخدام ماصة. إضافة ملحق خالية من المصل، أضافت A و CHIR99021 إلى تركيز 1 x، 100 نانوغرام/ملليلتر، ميكرو دي وان، على التوالي.
      ملاحظة: يجب أن يكون تركيز CHIR99021 أقل منه في المرحلة المتوسطة 1A، وإضافة ليس ضروريا، ولكن لأنه يزيد عدد الخلايا.
    3. 2 المرحلة المتوسطة: المتوسطة MEM تحسين نقل (إيميم) في أنبوب ماصة استخدام. إضافة الملحق خالية من مصل الدم وعامل النمو keratinocyte (KGF) بتركيز 0.5 x و 50 نانوغرام/مل، على التوالي.
    4. المتوسطة المرحلة 3: نقل iMEM المتوسطة في أنبوب باستخدام ماصة. إضافة ملحق خالية من المصل، KGF، رأس، 3-Keto-N-أمينو إيثايل-N'سيكلوباميني-أمينوكابرويلديهيدروسينامويل (CYC) وحمض 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (تنبب) الماصة إلى تركيزات 0.5 x, 50 نانوغرام/مل, 100 نانوغرام/مل, 0.5 ميكرومتر و 10 نانومتر، على التوالي.
  2. التدفق الخلوي (FCM)
    1. 1 x بيرميبيليزيشن/يغسل المخزن المؤقت: نقل المياه في أنبوب ماصة. إضافة المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن/يغسل ماصة إلى تركز 1 x.
    2. FCM عرقلة الحل: نقل 1 x بيرميبيليزيشن/يغسل المخزن المؤقت في أنبوب ماصة. إضافة المصل حمار ماصة لتركيز 2% (المجلد/المجلد).
  3. إيمونوستينينج
    1. عرقلة الحل: فوسفاتيبوفيريد المالحة (دببس نقل دولبيكو) في أنبوب من ماصة. إضافة المصل حمار و "تريتون العاشر" ماصة لتركيزات من 5% (المجلد/المجلد) و 0.4% (المجلد/المجلد)، على التوالي.

2-هبسك التمايز إلى "فروعه" خلايا/البنكرياس المعي الخلفي (PDX1 الخلايا+ )

ملاحظة: القيام بكافة الإجراءات باستخدام تقنيات عقيمة. هبسكس تمسك جيدا 6 لوحات مطلية بمادة سطحية اصطناعية هبسكس مع هبسك الصيانة المتوسطة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة17،26. عندما تصل إلى الخلايا استخدامها 50-80% كونفلوينسي (المرحلة 0) للتمايز.

  1. إعداد الغشاء لوحات المغلفة بالمصفوفة.
    1. نقل 6 مل RPMI 1640 (4 درجةمئوية) في أنبوب تبريد إلى 4 درجةمئوية على الجليد. إضافة 2 مغ من الغشاء مصفوفة (4 درجةمئوية) مع نصائح مل-ماصة 1 تبريد ومزيج جيد من قبل بيبيتينج لطيف لجعل مصفوفة الغشاء 0.33 ملغ/مل.
    2. نقل 2 مل مصفوفة الغشاء المخفف لكل بئر من لوحات ثقافة الخلية 6-جيدا ماصة. وضع اللوحات في 37 درجةمئوية لمدة 60-90 دقيقة في حاضنة. بعد ذلك، تبقى اللوحات في الرايت حتى الاستخدام (ضمن ح 3).
  2. البذور هبسكس والشروع في المفاضلة للأنسجة قاطع (المرحلة 1 ألف).
    1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل حمض الإيثيلين 0.5 مم (يدتا) (RT) الواحدة وكذلك بواسطة ماصة لغسل هبسكس مثقف في لوحات 6-جيدا.
    2. نضح 0.5 مم يدتا وإضافة 2 مل من 0.5 مم يدتا الواحدة وكذلك بواسطة ماصة. احتضان اللوحات في 37 درجةمئوية لمدة 5 دقائق.
    3. نضح 0.5 مم يدتا وإضافة 1 مل من هبسك الصيانة المتوسطة في الرايت تستكمل مع 10 ميكرومترات Y-27632 الواحدة وكذلك ماصة. "الماصة؛" بلطف ولكن بسرعة لتفجير تعلق الخلايا على اللوحات وأن تنأى تحبب خفيف الخلايا إلى الخلايا المفردة. لا فقاعة تعليق الخلية أثناء بيبيتينج.
    4. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي 50 مل تحتوي على 4 مل من هبسك الصيانة المتوسطة في الرايت تستكمل مع 10 ميكرو Y-27632. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية.
    5. حساب عدد الخلايا في تعليق خلية استخدام الإجراء استبعاد وصمة عار تريبان الأزرق.
      1. ميكس 15 ميكروليتر من تعليق خلية و 15 ميكروليتر تريبان الأزرق في أنبوب.
      2. نقل 10 ميكروليتر من تعليق خلية المخفف تريبان الأزرق على الخلية الشرائح في تكرار العد ماصة 10 ميكروليتر.
      3. عد الخلية رقم عداد خلية تلقائياً وحساب كثافة الخلية في تعليق خلية. البقاء عادة > 98 ٪.
    6. قاسمة تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي 50 مل 1-1.5 × 106 خلايا كل بئر 6-جيدا لوحات (1-1.5 × 105 خلايا/سم2).
    7. الطرد المركزي في أنبوب 50 مل في 200 س ز على RT لمدة 5 دقائق.
    8. نضح المادة طافية باستخدام ماصة وريسوسبيند الخلايا مع 1 مل من المرحلة المتوسطة 1A (RT) كل بئر. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية وإضافة 1 مل آخر للمرحلة المتوسطة 1A (مجموع 2 مل كل بئر).
    9. نضح المصفوفة الغشاء المخفف في آبار لوحات ثقافة الخلية أعده ماصة ميكروليتر 1,000 في خطوة 2.1.2. المضي قدما إلى الخطوة التالية مباشرة.
    10. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية في الخطوة 2.2.8 مرة أخرى. فورا بعد الاختلاط، نقل تعليق خلية (2 مل) في كل من لوحة 6-جيدا جيدا. وتغطي اللوحة برقائق ألومنيوم حماية اللوحة من الضوء. ضع اللوحة في مقاعد البدلاء نظيفة في RT لمدة 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: لا تقم بتحريك اللوحة بعد البذر.
    11. بلطف ضع اللوحة إلى 37 درجةمئوية، 5% CO2 حاضنة (جو هوميديفيد) والثقافة من أجل ح 24.
      ملاحظة: لا تهز اللوحة بعد البذر.
  3. الحث على التفرقة في الأنسجة نهائي (المرحلة 1B).
    1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى الآبار بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
      ملاحظة: لإزالة أي خلايا ميتة من أحادي الطبقة، هزة بلطف اللوحة أمام كل طموح.
    2. نضح دببس المستخدمة قبل ماصة وإضافة 4 مل من المرحلة المتوسطة 1B (37 درجةمئوية) في البئر. بلطف ضع اللوحة في حاضنة 37 درجةمئوية (الغلاف الجوي هوميديفيد من 5% CO2) والثقافة من أجل ح 48.
    3. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
      ملاحظة: إزالة الخلايا الميتة من أحادي الطبقة التي تهز لطيف قبل كل طموح.
    4. نضح دببس المستخدمة واسطة ماصة، وإضافة 4 مل من المرحلة المتوسطة 1B (37 درجةمئوية) في البئر. بلطف ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجةمئوية، جو هوميديفيد من 5% CO2) والثقافة من أجل ح 24.
  4. الحث على التفرقة في أنبوب القناة الهضمية البدائية (المرحلة 2).
    1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة.
      ملاحظة: إزالة الخلايا الميتة من أحادي الطبقة التي تهز لطيف قبل كل طموح.
    2. نضح دببس المستخدمة واسطة ماصة، وإضافة 4 مل من 2 المرحلة المتوسطة (37 درجةمئوية) في البئر. ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجةمئوية، جو هوميديفيد من 5% CO2) والثقافة لمدة 4 أيام.
  5. الحث على التفرقة في PDX1+ الخلايا (المرحلة 3).
    1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
    2. نضح دببس المستخدمة واسطة ماصة، وإضافة 4 مل من 3 المرحلة المتوسطة (37 درجةمئوية) في البئر. ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجةمئوية، جو هوميديفيد من 5% CO2) والثقافة لمدة 3 أيام.
  6. الحث التمايز إلى خلايا الغدد الصماء في البنكرياس.
    1. أداء NKX6.1+ خلية التعريفي (المرحلة 4، لمدة 8 أيام) متبوعاً بتحريض خلايا الغدد الصماء (المرحلة 5، لمدة 12 يوما) مع بروتوكولات تم وصفه مسبقاً3،،من1626. تميز والتحقق من صحة التفريق بين خلايا الغدد الصماء إيمونوستينينج والكمية في الوقت الحقيقي النسخ العكسي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (قرة-PCR) التحليل.
      ملاحظة: الرجوع إلى تويودا et al.16 و كيمورا وآخرون26 لإجراءات تجريبية مفصلة. يشير الجدول 1 لمتواليات التمهيدي المستخدمة لتحليل PCR قرة.

3-التدفق الخلوي (FCM)

  1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل من 0.5 مم أدتا إلى البئر بواسطة ماصة. كرر بالطموح وإضافة 0.5 مم يدتا مرة واحدة.
    ملاحظة: هز اللوحة برفق لإزالة أي خلايا ميتة من الخلايا أحادي الطبقة قبل كل طموح.
  2. لفصل الخلايا (حوالي 3-6 × 106 خلايا كل بئر)، وإضافة 2 مل من 0.25% التربسين التي تحتوي على 0.5 مم يدتا كل بئر. احتضان اللوحات في 37 درجةمئوية لمدة 5-10 دقائق.
  3. "الماصة؛" بلطف ولكن بسرعة فصل الخلايا تحبب خفيف إلى الخلايا المفردة. لا فقاعة تعليق الخلية أثناء بيبيتينج.
  4. إضافة 8-10 مل من قاعدة المتوسطة (RPMI 1640 أو إيميم، RT) تحتوي على 0.5 x الملحق خالية من المصل و 10 ميكرومترات Y-27632 كل جيدا وتخلط بتعليق خلية. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي.
  5. الطرد المركزي الأنبوب في 300 س ز على RT لمدة 5 دقائق.
  6. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 2 مل من 0.5 مم يدتا (RT). بلطف "الماصة؛" تعليق خلية.
  7. الطرد المركزي الأنبوب في 300 س ز على RT لمدة 5 دقائق.
  8. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت للتثبيت و permeabilization الواحدة 106 خلايا تحت غطاء محرك السيارة. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية تحت غطاء محرك السيارة. إبقاء الأنبوب في RT لمدة 30 دقيقة.
  9. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لمدة 5 دقائق.
  10. نضح المادة طافية تحت غطاء محرك السيارة وريسوسبيند الخلايا مع 500 ميكروليتر FCM عرقلة الحل الواحدة 106 خلايا. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية. إبقاء الأنبوب في RT لمدة 30 دقيقة.
  11. نقل 50 ميكروليتر من تعليق خلية لأنبوب (حوالي 1 × 105 الخلايا). الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 100 ميكروليتر من جسم الابتدائي المخفف (انظر الجدول للمواد) في FCM عرقلة الحل واحتضان في 4 °C > ح 16.
  12. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع ميكروليتر 180 1 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت.
  13. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 100 ميكروليتر من جسم الثانوي المخفف (انظر الجدول للمواد) في FCM عرقلة الحل. الخلايا RT لمدة 60 دقيقة أو 4 °C لاحتضان > ح 16 مع الحماية من الضوء.
  14. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع ميكروليتر 180 1 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت.
  15. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع ميكروليتر 180 من المصل حمار 2% في دببس.
  16. تصفية تعليق الخلية بنقل على مل 5 جولة الأنبوبة البوليستيرين أسفل الخلية مصفاة (35 قطار النايلون ميكرون) والحفاظ على 4 درجةمئوية مع حماية من الضوء حتى التحليل.
  17. تحليل نسبة خلايا إيجابية ملطخة ب تدفق سيتوميتير27.

4-إيمونوستينينج

  1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
    ملاحظة: بلطف يهز لوحة لإزالة أي خلايا ميتة من الخلايا أحادي الطبقة قبل كل طموح.
  2. إضافة 2 مل من 4% بارافورمالدهيد (PFA) (4 درجةمئوية) كل بئر ماصة تحت غطاء محرك السيارة. احتفظ باللوحة عند 4 درجةمئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. إزالة منهاج عمل بيجين ماصة تحت غطاء محرك السيارة. إضافة 2 مل دببس في الرايت إلى البئر ماصة تحت غطاء محرك السيارة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
  4. إضافة 2 مل من محلول حظر كل بئر وإبقاء اللوحة على RT لمدة 30 دقيقة.
  5. نضح الحل المستخدمة وإضافة 1 مل جسم الأولية (انظر الجدول للمواد) في عرقلة الحل كل بئر. احتضان RT لمدة 60 دقيقة أو 4 °C > ح 16.
  6. نضح الحل المستخدمة، إضافة 2 مل دببس التي تحتوي على 0.4% X-100 تريتون واحتضان في RT لأدنى 10 تكرار التطلع، بالإضافة للحل والحضانة مرة واحدة.
  7. نضح الحل المستخدمة وإضافة 1 مل جسم الثانوية (انظر الجدول للمواد) في عرقلة الحل كل بئر. تبني على RT لمدة 60 دقيقة مع الحماية من الضوء.
  8. نضح الحل المستخدمة، إضافة 2 مل دببس التي تحتوي على 0.4% Triton X-100 (RT) واحتضان في RT لمدة 5 دقائق مع الحماية من الضوء. كرر التطلع، بالإضافة للحل والحضانة مرتين.
  9. أن ميكروجرافس لدراسة كفاءة التمايز تحت مجهر الأسفار28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نشر هيبسكس (585A1،من2930) يتم تكثيفه وتشكيل المونولاير متجانسة (الشكل 1B) التي مناسبة للتمايز. هيبسكس غير متمايز (المرحلة 0) نات، وإعادة المصنف كخلايا مفردة في الخلية منخفضة الكثافة (1-1.5 × 105 خلايا/سم2). ضمن ح 1، مرفقة باللوحة الخلايا وتبدأ في إظهار نتوء. في يوم 1، تكاثرت الخلايا وتوزيع جيد لتغطية 80-90% مساحة السطح. أثناء المرحلة 1B، تظهر وسائل الإعلام غائم بسبب الخلايا الميتة. إزالة الخلايا الميتة بالغة الأهمية للتمايز ذات كفاءة عالية حيث الخلايا الميتة يحتمل تخل بالبقاء على قيد الحياة والتمايز للخلايا الواقعة تحت. في أيام 3-4، تشكيل خلايا ورقة عمل أحادي الطبقة متجانسة يمكن وصفه بأنه مظهر حصاة كبيرة. عند هذه النقطة، معظم الخلايا تتوقف عن التعبير عن الجنس تحديد المنطقة Y-المربع 2 (SOX2)، علامة للحصول على خلايا غير متمايزة، وبدلاً من ذلك التعبير عن علامة نهائي الأنسجة، SOX17، في أكثر من 90% (الشكل 2 أ و ب). SOX17 معظم الخلايا+ FOXA2 إكسبرس (الشكل 2A). بدءاً من التفريق بين تنازلات كثافة خلية غير مناسب كفاءة التمايز في هذه الخطوة (الشكل 3). في المراحل 2 و 3، يرتاح موت الخلية، والمتوسطة المستخدمة ليست غائم، كما الحال في المرحلة 1B. خلايا التعبير عن علامات أنبوب القناة الهضمية البدائية HNF1β و HNF4α (الشكل 2)، وفي النهاية أعرب عن علامة السلف المعي الخلفي/البنكرياس، PDX1، في أكثر من 90% (الشكل 2D و ه). PDX1+ خلية التعريفي استنساخه في آخر سطر هيبسك، 1231A3 31وخط هيسك، خس-3 32 (الشكل 4). نتائج qRT PCR التعبير مرناً من علامات المرحلة كانت متسقة مع إيمونوستينينج (الشكل 5A). التعبير مرناً من PDX1 واضح في المرحلة 3، وتزيد كثيرا من الحجية.

PDX1+ الخلايا في مراحل النمو المبكر لديها القدرة على التفريق في خلايا البنكرياس فقط لا بل أيضا المعدة التجويف الإثني عشر والقناة الصفراوية اكستراهيباتيك وجزء من الأمعاء 9. ولدت إمكانيات التمايز في المختبر PDX1+ يمكن تقييم الخلايا إلى خلايا البنكرياس بثقافة موسعة مع البروتوكولات المبلغ عنها للأنسجة البنكرياس وخلايا الغدد الصماء في البنكرياس163،، 26-التعبير عن علامة الأنسجة البنكرياس، NKX6.1، وعلامات الغدد الصماء البنكرياس الأنسولين، و الجلوكاجون، لوحظت في أيام 19 (المرحلة 4) و 31 (المرحلة 5)، على التوالي (الشكل 5).

Figure 1
رقم 1: الممثل مظهر الخلايا تحت التمايز التدرجي. (أ) بمخطط التمايز الموجهة من هبسكس إلى الأنساب البنكرياس. تشير الأرقام بين قوسين إلى تركيزات (تتم كتابة وحدات أدناه). (ب) مجال مشرق الممثل ميكروجرافس من هيبسكس في الخطوات الرئيسية لثقافة التفريق. هيبسكس 585A1 نات كالخلايا المفردة والتي يسببها لتفرق في الأنسجة نهائي وأنبوب القناة الهضمية البدائية والسلف المعي الخلفي/البنكرياس. لوحات أقل الموسع آراء الأفرقة علوية. ربمي، ربمي 1640؛ AA، أضافت (نانوغرام/مل)؛ الفصل، CHIR99021 (ميكرومتر)؛ KGF (نانوغرام/مل)؛ وتد، رأس (نانوغرام/مل)؛ الفتوة، سيكلوباميني 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl (ميكرومتر)؛ تنبب، حمض 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (نيو مكسيكو). تغيير حجم أشرطة = 300 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: توجيه الممثل نحو الأنساب البنكرياس من هيبسكس. (أ) نسبة SOX2–SOX17+ الخلايا التي تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي قبل التمايز (المرحلة 0)، وفي يوم 4 (المرحلة 1B). متمايز هيبسكس (SOX2+SOX17–) كانت متباينة في الأنسجة نهائي (SOX2–SOX17+). SOX17 معظم الخلايا+ FOXA2 أعرب عن المشاركة. (ب) ميكروجرافس إيمونوفلوريسسينت الممثل في يوم 4 (المرحلة 1B). كانت الملون الخلايا الثابتة SOX17 (الأخضر)، SOX2 (أحمر)، ونوى (أزرق). (ج) ميكروجرافس إيمونوفلوريسسينت ممثل في أيام 4 (المرحلة 1B) و 8 (المرحلة 2). الخلايا الثابتة كانت الملون (الأخضر) HNF1β، HNF4α (أحمر) ونوى (أزرق). (د) نسبة الخلايا إيجابية بالنسبة PDX1، كما حللت بالتدفق الخلوي في أيام 4 (المرحلة 1B) و 11 (المرحلة 3). (ه) ممثل ميكروجرافس إيمونوفلوريسسينت PDX1 (الأخضر) ونوى (الأزرق) يوم 11 (المرحلة 3). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تحريض الممثل نحو نهائي الأنسجة بدأت من خلية مختلفة الكثافات. (أ) الممثل الميداني مشرق ميكروجرافس ح 1 بعد تمايز الخلايا. هيبسكس نات كالخلايا المفردة والتي يسببها لتفرق في الأنسجة نهائي في خلية مختلفة الكثافة (1 × 104/cm2-50). لوحات أقل الموسع آراء الأفرقة علوية. (ب) نسبة SOX2–SOX17+ الخلايا التي تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي قبل التمايز (المرحلة 0)، وفي يوم 4 (المرحلة 1B). (ج) نسبة PDX1+ الخلايا التي تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي في أيام 8 (المرحلة 2) و 11 (المرحلة 3). تغيير حجم أشرطة = 300 ميكرومتر.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تحريض الممثل نحو PDX1+ الخلايا في هيبكس وهيسكس. خط هيبسك، 1231A3 (A)، وبند هيس، قيس-3 (ب)، كانت متباينة للأنسجة قاطع و PDX1+ الخلايا. وقد تم تحليل تكوين خلية بالتدفق الخلوي. نسبة SOX2–SOX17+ وقد تم تحليل الخلايا قبل التمايز (المرحلة 0)، وفي يوم 4 (المرحلة 1B). نسبة PDX1+ وقد تم تحليل الخلايا في أيام 8 (المرحلة 2) و 11 (المرحلة 3).  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تحريض الممثل نحو الأنسجة البنكرياس وخلايا الغدد الصماء. وقد ميزت هيبسكس (585A1) في PDX1+ الخلايا. كذلك كانت متباينة الخلايا في الأنسجة البنكرياس وخلايا الغدد الصماء البنكرياس مع البروتوكولات ذكرت3،،من1626. (أ) مرناً التعبير عن علامات المرحلة كانت تقاس بالكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرة-PCR). البيانات تم تطبيع للتعبير جابده وقدم الحظيرة--التغيير في التعبير الجيني بالنسبة لقيمة الذروة. لاحظ أن التعبير PDX1 زيد في > برنامج من أيام 8 (المرحلة 2) 11 (المرحلة 3) وفي > 100-fold من أيام 11 (المرحلة 3) و 19 (المرحلة 4). ويرد التعبير في البنكرياس البشري الكبار ك Panc. SOX2، أسود؛ SOX17، أرجواني؛ Β HNF1، البنى؛ HNF4α، البرتقال؛ PDX1، الضوء الأخضر؛ NKX6.1، أخضر؛ الأنسولين، الأزرق؛ الجلوكاجون، الأحمر. (ب) ميكروجرافس إيممونوفلوريسسينت ممثل علامة الأنسجة البنكرياس، NKX6.1 (أحمر)، في أيام 11 (المرحلة 3) و 19 (المرحلة 4). PDX1 (الأخضر) ونوى (أزرق) قد شاركت الملون. (ج) ميكروجرافس إيمونوفلوريسسينت ممثل لصانعي الغدد الصماء البنكرياس الأنسولين (الوظائف الخضراء) والجلوكاجون (فريق التنسيق العالمي، الأحمر)، في أيام 19 (المرحلة 4) و 31 (المرحلة 5). نوى (أزرق) قد شارك الملون.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

اسم الجين رمز الجينات التمهيدي إلى الأمام عكس التمهيدي
جليسيرالديهيدي-3-ال
نازعة الشركة المصرية للاتصالات		 جابده جاجتجاجتكجاجتك جاجاتجتجاتججاتتك
جمهورية يوغوسﻻفيا-مربع 2 SOX2 أجتكتككاجكجاكجاااا تتكاكجتتجكاكتجتكك
جمهورية يوغوسﻻفيا-مربع 17 SOX17 كجكاكجاتتجاكاجتا تاجكتككتككاجاجتجتج
HNF1 هوميوبوكس ب HNF1Β ككتكتككتككااكاجكتج تجتجككاتجتجاكتجات
تتمثل العوامل النووية 4 ألفا HNF4Α جاجكتجكاجاتكجاتجاكا تاكتجكجتكجتجاتجتا
هوميوبوكس البنكرياس والاثني عشر 1 PDX1 أجكاجتجكاجاجتكككتجت كاكاجككتكتاككتكجاك
NK6 هوميوبوكس 1 NKX6.1 أتتكجتجججاتجاكاجاج تججاتككاجاجكتاتج
الجلوكاجون فريق التنسيق العالمي جاتكاتتجكتتجكتغت كجككاجتتكتكاكات
الأنسولين الوظائف كتاككتاجتجتجكجججاك جكتجتاجاججاجكاجاتج

الجدول 1: كبسولة تفجير ل qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

جيل PDX1+ الخلايا وتتألف من خطوات متعددة؛ ولذلك، من المهم لعلاج الخلايا في الوقت المناسب. ومن بين الخطوات، كفاءة التعريفي الأنسجة نهائي يؤثر إلى حد كبير على كفاءة التعريفي النهائي، وربما بتدخل من تلويث النسب الخلايا الأخرى (أي mesoderm والأديم الظاهر)، التي قد تنتشر و/أو إفراز العوامل التي تعطيل التمايز محددة. إذا كانت نسبة SOX17+ الخلايا أقل من 80% في يوم 4 (المرحلة 1 باء)، كفاءة تنظيم دورات تعريفية ل PDX1+ خلايا من المرجح أن تتعرض للخطر.

تمسك الدول غير متمايزة من هبسكس كمستعمرات أو مجاميع من الخلايا المضغوطة. ومع ذلك، الأساليب التي تبدأ التمايز من المستعمرات أو المجاميع قد تعاني من التغاير، بسبب التصاق الخلايا المختلفة وكثافة في المستعمرة، مثل كما في مركز وهامش22، ونظرا لأن الخلايا تكون في مراحل مختلفة من دورة الخلية25. من ناحية أخرى، لدينا أسلوب يبدأ خلايا مفردة معزولة، التي تمكن دولة متجانسة نسبيا للالتصاق خلية من خلايا مفردة أو كثافة الخلايا في كل خلية مفردة. من حيث التعامل مع متجانسة لكل خلية، قد تكون أساليب عملنا أسهل من غيرها التي تبدأ مع ثقافات مستعمرة أو التجميع.

على الرغم من أن لدينا بروتوكول يمكن استخدامها لحمل PDX1+ الخلايا من خطوط هبسك متعددة، يمكن أن يكون التفريق بين ما زالت غير فعالة. في مثل هذه الحالات، يمكن أن تكون الاختلافات في حالة التصاق الحق بعد البذر بين خطوط هبسك القضية، ويمكن تعديل كثافة البذر حل33. وفي الواقع، يبين الشكل 3 هذا غير مناسب بذر الخلية كثافة الحلول التوفيقية التمايز في الأنسجة نهائي و PDX1+ الخلايا. من المثير للاهتمام، كثافة الخلية المثلى ل PDX1+ التعريفي الخلية كانت مختلفة فيما بين سكان الخلية التي تحقق > الأنسجة نهائي 90%. وثمة إمكانية أخرى للتمييز بين الكفاءة هو الشرط سوء الصيانة هبسكس غير متمايز، الذي ينال من نوعية بلوريبوتينسي وعلى الرغم من التعبير عن علامات للدولة غير متمايزة. وفي هذه الحالة، ينبغي أن استأنفت ثقافة التوسع هبسك من سن مبكرة تجميد الأرصدة أو الاستنساخ الفرعية ينبغي أن يقوم بالحصول على هبسكس في ظروف مناسبة. وفي حالة عدم كفاءة التمايز في أيام 8 (المرحلة 2) أو 11 (المرحلة 3)، ينبغي أن يكون الأمثل مدة هذه الخطوات. دعم هذه الفكرة، مدة المرحلة 3 قد ثبت حاسمة بالنسبة للحصول على خصائص الخلية المرحلة اللاحقة وهي الخلية تعتمد على الخط في النسب البنكرياس34.

جيل PDX1+ الخلايا أمر حاسم لتوليد خلايا البنكرياس في المختبر. PDX1 ضروري وظيفيا للبنكرياس التنمية القائمة على المعرفة من الفئران فارغة Pdx1، وهي أبانكريتيك35. الدوام، أظهرت الدراسات في المختبر والمجراه في زرع المستمدة من هبسك PDX1+ الخلايا يحتمل أن تتطور إلى جميع مكونات البنكرياس، بما في ذلك إفرازات وخلايا الغدد الصماء مثل خلايا البنكرياس بيتا3،16 , 36 , 37-وهكذا، كفاءة توليد PDX1+ الخلايا من هبسكس يؤدي إلى إمدادات مستقرة من خلايا البنكرياس لإنشاء خلية بيتا العلاج ضد داء السكري وفهم التنمية البشرية البنكرياس وأمراض البنكرياس.

القيود المفروضة على هذه الطريقة تتعلق بتنسيق الثقافة المونولاير ثنائي الأبعاد (2D)، الذي غير مناسب لبعض أنواع الخلايا وتجهيز الخلية. وفي السنوات الأخيرة، أظهرت ثلاثي الأبعاد (3D) الثقافات للنهوض بتوليد خلايا ناضجة والأنسجة، وربما بسبب محاكاة المكروية المجراة. على سبيل المثال، إنشاء خلايا بيتا في الثقافات 3D لكن الثقافات أحادي الطبقة 2D لا يمكن بلوغ القدرة على إفراز الأنسولين استجابة ل مستويات الغلوكوز خارج الخلية38.

لاستخدام PDX1+ الخلايا لتوليد أنواع الخلايا تنمويا لاحقاً، من المهم أن التحول إلى الثقافات ثلاثية الأبعاد، مثل تعليق الثقافات المجاميع مضمن في مصفوفة خارج الخلية والثقافات التجميعية في هواء سائل الواجهة3 , 16 , 37-وبالإضافة إلى ذلك، تتطلب ثقافات أحادي الطبقة 2D مزيد من المساحة السطحية لاستزراع من الثقافات تعليق، والحد من قابلية. تجهيز كميات كبيرة من الخلايا للاستخدام التجاري يتطلب إدخال تعديلات مثل الاستخدام ميكروبيدس. في الوقت نفسه، الأسلوب الحالي مناسبة لفحص العوامل الذي يحفز التمايز واستكشاف الآليات الجزيئية بنقل الجينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من "الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS) عن طريق Scientific Research (C) (JSPS كاكينهي Number15K09385 المنح و 18 ك 08510) T.T.، ومعونات للزملاء الباحثين JSPS (JSPS كاكينهي عدد المنح 17J07622) لحزب العدالة والتنمية، والوكالة اليابانية "الأبحاث الطبية" والتنمية (AMED) من خلال بحوثه منح "مركز الأساسية للبرامج المتكاملة أبحاث الخلايا، شبكة مركز البحوث لتحقيق الطب التجديدي" كو يشكر المؤلفون الدكتور بيتر كاراجيانيس لقراءة المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine Toronto Research Chemicals K171000 CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid Santa Cruz Biotechnology SC-203303 TTNPB
50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 339652
Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] Abcam Ab76541 Anti-CDX2, × 1/1000 dilution
B-27 Supplement (50 ×) Thermo Fisher Scientific 17504-044 Serum-free supplement
BD FACSAria II Cell Sorter BD Biosciences For flow cytometry
Biomedical freezer SANYO MDF-U538 For -30 °C storing
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber BIO-RAD 1450011 Counting slide glass
CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR Greiner bio-one 657165 For differentiation culture/6-well plate
Centrifuge TOMY AX-310 For cell culturing
Centrifuge TOMY MX-305 For RT-qPCR
CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386
CLEAN BENCH SHOWA KAGAKU  S-1601PRV Clean bench
Corning CellBIND 6-well plate Corning 3335 For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced Corning 354230 Basement membrane matrix
Corning Synthemax II-SC Substrate Corning 3535 For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs
Cryostat Leica Leica CM1510 S For immunostaining of aggregates.
Cytofix/Cytoperm Kit Becton Dickinson 554714 Perm/Wash buffer is  Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.
Dako pen Dako S2002 For immunostaining of aggregates
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher Scientific 18427-088 For RT-qPCR
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11055 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10036 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10040 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey Serum Merck Millipore S30 Donkey serum
D-PBS(-) without Ca or Mg Nacalai tesque 14249-95 DPBS
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer
Filter Tip, 1,000 µL Watoson 124-1000S Use together with pipettes
Filter Tip, 20 µL Watoson 124-P20S Use together with pipettes
Filter Tip, 200 µL Watoson 124-P200S Use together with pipettes
Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700 For immunostaining
Forma Steri-Cycle CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 370A Incubator
HNF-1β Antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-7411 Anti-HNF1β, × 1/200 dilution
HNF-4α Antibody (H-171) Santa Cruz Biotechnology sc-8987 Anti-HNF4α, × 1/200 dilution
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 For nucleus staining, × 1/200 dilution
Human Pancreas Total RNA Ambion AM7954 For RT-qPCR
Human PDX-1/IPF1 Antibody R&D Systems AF2419 Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution
Human SOX17 Antibody R&D Systems AF1924 Anti-SOX17, × 1/200 dilution
Improved MEM Zinc Option medium Thermo Fisher Scientific 10373-017 iMEM
Incubation chamber Cosmo Bio 10DO For immunostaining of aggregates
Latex Examination Gloves Adachi
MAS coated slide glass Matsunami Glass 83-1881 For immunostaining of aggregates
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific 4346907 For RT-qPCR
Microscope Olympus CKX41N-31PHP For cell culturing
Microtube Watoson 131-515CS
Monoclonal Anti-α-Fetoprotein SIGMA A8452 Anti-AFP, × 1/200 dilution
Nanodrop 8000 Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Oligo dT FASMAC Custom made Oligo  For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehyde, powder Nacalai tesque 26126-54 PFA, fixative, diluted in DPBS
Pharmaceutical refrigerator SANYO MPR-514 For 4 °C storing
PIPETMAN P  GILSON Pipette
Recombinant Human KGF/FGF-7 R&D Systems 251-KG KGF
Recombinant Human Noggin PeproTech 120-10C NOGGIN
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A R&D Systems 338-AC Activin A
ReverTra Ace (100 U/μL) TOYOBO TRT-101 For RT-qPCR
RNase-free DNase Set (50) QIAGEN 79254 For RT-qPCR
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74104 For RT-qPCR
RPMI 1640 with L-Gln Nacalai tesque 30264-85 RPMI 1640
Sealing Film for Real Time Takara NJ500 For RT-qPCR
Serological pipettes 10 mL Costar/Corning 4488 For cell culturing
Serological pipettes 25 mL Costar/Corning 4489 For cell culturing
Serological pipettes 5 mL Costar/Corning 4487 For cell culturing
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb Cell signaling 3579S Anti-SOX2, × 1/200 dilution
StepOnePlus Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Sucrose Nacalai tesque 30406-25 For immunostaining of aggregates
TB Green
Premix Ex Taq II 		 Takara RR820B For RT-qPCR
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450101J1 Automatic cell counter
Tissue-Tek OCT compound 4583  Sakura Finetechnical 4583 For immunostaining of aggregates
Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters Sakura Finetechnical 4566 For immunostaining of aggregates
Triton X-100 Nacalai tesque 35501-15
Trypan Blue BIO-RAD 1450021
Ultracold freezer SANYO MDF-U33V For -80 °C storing
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-038 Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Y-27632 Wako 251-00514

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).

Tags

علم الأحياء التنموي، 145 قضية، البنكرياس، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent، الخلايا الجذعية pluripotent البشرية، التمايز، والتنمية، والسلف البنكرياس، المعي الخلفي، الطب التجديدي، مرض السكري
كفاءة توليد من البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1<sup>+</sup> الخلفي المعي/البنكرياس "موروث" من هبسكس في "الثقافات الالتصاق"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toyoda, T., Kimura, A., Tanaka, H.,… More

Toyoda, T., Kimura, A., Tanaka, H., Osafune, K. Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures. J. Vis. Exp. (145), e57641, doi:10.3791/57641 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter