यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करने के लिए मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) में अग्ंयाशय/ग्रहणी homeobox प्रोटीन 1+ (PDX1+) कोशिकाओं को अग्नाशय के वंश के उत्पादन के लिए गैर कॉलोनी प्रकार monolayer वृद्धि के आधार पर वियोजित एकल कोशिकाएँ. यह विधि समरूप hPSC-व्युत्पन्न कोशिकाओं, आनुवंशिक हेरफेर और स्क्रीनिंग के उत्पादन के लिए उपयुक्त है ।
मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC)-प्राप्त अग्नाशय कोशिकाओं पुनर्योजी दवा के लिए एक होनहार सेल स्रोत और मानव विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मंच है । Stepwise का निर्देश दिया भिंनता है कि पुनर्पूंजीकरण विकासात्मक प्रक्रियाओं के प्रमुख तरीके अग्ंयाशय/ग्रहणी homeobox प्रोटीन 1+ (PDX1+) अग्नाशय के जनक कोशिकाओं सहित अग्नाशय की कोशिकाओं को उत्पंन करने में से एक है । पारंपरिक प्रोटोकॉल छोटी कालोनियों के साथ भेदभाव शीघ्र ही पारित होने के बाद शुरू करते हैं । हालांकि, कालोनियों या समुच्चय के राज्य में, कोशिकाओं विषमताओं के लिए प्रवण हैं, जो PDX1+ कोशिकाओं के लिए भेदभाव बाधा हो सकता है । यहां, हम PDX1+ कोशिकाओं में hPSCs अंतर करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रोटोकॉल चार चरणों के होते है और वियोजित एकल कोशिकाओं बोने के द्वारा भेदभाव शुरू करता है । SOX17 के प्रेरण+ निश्चित अन्तः कोशिकाओं दो आदिम आंत ट्यूब मार्करों, HNF1β और HNF4α की अभिव्यक्ति के बाद किया गया था, और PDX1+ कोशिकाओं में अंतिम भेदभाव । वर्तमान प्रोटोकॉल आसान हैंडलिंग प्रदान करता है और सुधार और कुछ hPSC लाइनों कि पहले endodermal वंश या PDX1+ कोशिकाओं में निकम्मेपन अंतर पाया गया की भिंनता दक्षता को स्थिर कर सकते हैं ।
अग्ंयाशय मुख्य रूप से बहिःस्त्रावी और अंत: स्रावी कोशिकाओं के होते हैं, और इसकी शिथिलता या अधिभार कई रोगों का कारण बनता है, ऐसे अग्नाशशोथ, मधुमेह और अग्नाशय के कैंसर के रूप में । pancreatopathy के रोगजनन को स्पष्ट करने के लिए, यह अग्नाशय कोशिकाओं के विकास की प्रक्रिया और समारोह का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है । इसके अतिरिक्त, कोशिका/ऊतक पूरकता चिकित्सा स्थापित करने के लिए सुदृढ़ गुणवत्ता वाली एक स्थिर कोशिका आपूर्ति की आवश्यकता होती है । मानव pluripotent स्टेम सेल (hpsc)-व्युत्पन्न अग्नाशय कोशिकाओं इन प्रयोजनों के लिए एक होनहार सेल स्रोत हैं, और अग्नाशय कोशिकाओं की ओर भेदभाव प्रोटोकॉल गहन अध्ययन किया गया है1,2,3, 4. अग्नाशय के β कोशिकाओं की विट्रो पीढ़ी में हाल ही में अग्रिमों वयस्क मानव में β कोशिकाओं की पीढ़ी नकल, और इन कोशिकाओं मधुमेह मॉडल चूहों2,3में आरोपण पर चिकित्सकीय प्रभावकारिता दिखाने. इसके अलावा, β कोशिकाओं के विश्लेषण से उत्पंन प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) के स्वस्थ और प्रकार 1 मधुमेह रोगी दाताओं से पता चला कोई कार्यात्मक मतभेद सहित जब तनाव के तहत5। इसके अलावा, रोग phenotypes आंशिक रूप से प्रेरित अग्नाशय के कोशिकाओं के साथ रोगी प्राप्त ipscs या hpscs रोगियों6,7के रूप में एक ही साइट में आनुवंशिक उत्परिवर्तन शरण में reproduced किया गया है.
hpscs से अग्नाशय कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए, पदश: का निर्देशन किया है कि विकास प्रक्रियाओं recapitulates का इस्तेमाल होता अग्ंयाशय प्रारंभिक भ्रूण, जो सेक्स का निर्धारण क्षेत्र Y-बॉक्स 17 (SOX17) और forkhead बॉक्स A2 (FOXA2)8व्यक्त की अन्तः परत से व्युत्पंन है । माउस के अध्ययन के आधार पर, endodermal परत आदिम पेट ट्यूब रूपों, जो हेपेटोसाइट परमाणु कारक 1 की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित है-बीटा (Hnf1β) और hepatocyte परमाणु फैक्टर 4-अल्फा (Hnf4α). आदिम आंत ट्यूब elongates और श्वसन तंत्र, पाचन तंत्र, और अंगों में विकसित करता है । बढ़ाव के बाद, पश् चवर्ती अग्रगट क्षेत्र कल्पित अग्नाशई क्षेत्र बन जाता है, जैसा कि प्रतिकारी कारक अग्ंयाशय/ग्रहणी होमोबॉक्स प्रोटीन 1 (PDX1)8,9,10की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित । PDX1+ आंत ट्यूब के पृष्ठीय और अधर भागों अग्नाशय कलियों, जो अग्ंयाशय प्रतिलेखन कारक 1 सबयूनिट अल्फा (PTF1A) और NK6 homeobox 1 (nkx 6.1)8,11के सह अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे है के रूप में गाढ़ा । इस अभिव्यक्ति अग्नाशय के ऑर्गेनिजेनेसिस के रूपात्मक शुरू के निशान । अग्नाशय अन्तः कोशिकाओं, जो अग्नाशई कलियों के घटक हैं, उपकला संरचनाओं12 के एक बंटी ट्यूबलर नेटवर्क फार्म और अंततः बहिःस्त्रावी और अंत: स्रावी कोशिकाओं में अंतर, इंसुलिन स्रावी β कोशिकाओं सहित और glucagon-छिपाना α-कोशिकाओं । PDX1 की अभिव्यक्ति पहले प्रकल्पशील अग्नाशय क्षेत्र है, जो तो पूरे अग्नाशय के विकास में मनाया जाता है पर पाया जाता है, और β-और δ कोशिकाओं9,13,14को स्थानीयकरण से पता चलता है । हालांकि Pdx1+ कोशिका क्षेत्र है कि Ptf1a या Nkx 6.1 व्यक्त नहीं करता है गैस्ट्रिक विवर, ग्रहणी, extraयकृत पित्त नलिका और मध्य में कुछ आंतों की कोशिकाओं में फर्क9चूहों में विकास के देर चरण के लिए, Pdx1+ कोशिकाओं मनुष्यों में प्रारंभिक विकास के स्तर पर अग्ंयाशय के progenitors माना जाता है ।
यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करने के लिए PDX1 में hPSCs अंतर+ अग्नाशय वंश की पीढ़ी के लिए कोशिकाओं । प्रोटोकॉल को वियोजित एकल कोशिकाओं15,16,17बोने के द्वारा भेदभाव शुरू करता है । सामान्यतया, अविभेदित एचपीएससीज को कालोनियों अथवा कोशिका समुच्चय के रूप में निलंबन अथवा आसंजन में रखा जाता है । नतीजतन, अधिकांश प्रोटोकॉल passaging के बाद शीघ्र ही भेदभाव शुरू करते हैं । हालांकि, कालोनियों या समुच्चय के राज्य में, कोशिकाओं स्थानिक और transcriptional विषमताओं18,19,20,21,22, जो बाधा हो सकती करने के लिए प्रवण हैं निश्चित अन्तः PDX1+ कोशिकाओं के लिए अकुशल भेदभाव के बाद की ओर पहला भेदभाव कदम । वर्तमान प्रोटोकॉल आसान हैंडलिंग में सुधार करने के लिए और कुछ hPSC लाइनों कि पहले endodermal वंश और PDX1+ कोशिकाओं23के लिए निकम्मेपन अंतर पाया गया की भिंनता दक्षता को स्थिर करने की पेशकश कर सकते हैं, 24 , 25.
PDX1+ कोशिकाओं की पीढ़ी के कई कदम शामिल है; इसलिए, यह उचित समय पर कोशिकाओं का इलाज करने के लिए महत्वपूर्ण है । कदम के अलावा, निश्चित अन्तः की प्रेरण दक्षता मुख्यतः अंतिम प्रेरण दक्षता को प्रभावित करता ह?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम के हिस्से में वैज्ञानिक अनुसंधान के माध्यम से विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS) से धन द्वारा समर्थित किया गया था (सी) (JSPS KAKENHI अनुदान Number15K09385 और 18K08510) टीटी करने के लिए, और अनुदान में सहायता JSPS अनुसंधान अध्येताओं के लिए (JSPS KAKENHI अनुदान संख्या 17J07622) के लिए मुख़र्जी, और जापान एजेंसी चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए (एमएड) अपने अनुसंधान अनुदान के माध्यम से “कोर केंद्र आईपीएस सेल रिसर्च के लिए, पुनर्योजी चिकित्सा की प्राप्ति के लिए अनुसंधान केंद्र नेटवर्क” K.O. करने के लिए लेखकों ने पांडुलिपि पढ़ने के लिए डॉ पीटर कर्गिआनस का शुक्रिया अदा की ।
3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
Latex Examination Gloves | Adachi | ||
MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
Microtube | Watoson | 131-515CS | |
Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
Y-27632 | Wako | 251-00514 |