Summary
ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC 由来細胞、遺伝子操作、スクリーニングに適しています。
Abstract
ひと多能性幹細胞 (hPSC)-派生膵臓細胞は、再生医療と人間の発達過程を研究するためのプラットフォームのための有望な細胞ソース。段階的発達過程を繰り返す分化、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+を含む膵細胞を生成する主要な方法の 1 つを監督 (PDX1+) 膵前駆細胞。従来のプロトコルは、通過後すぐの小さいコロニーと分化を開始します。しかし、植民地または集計の状態で細胞が不均一性は、PDX1 への分化を妨げる可能性がありますになりやすい+細胞。PDX1 に hPSCs を区別するために詳細なプロトコルを提案するここでは、+のセル。プロトコルは 4 つのステップで構成されています、シード解離単一細胞で分化を開始します。SOX17 の誘導+ PDX1 に決定的な内胚葉細胞 2 つの原始腸チューブ マーカー、HNF1β、HNF4α、および最終的な分化の式が続いた+細胞。議定書簡単処理を提供しますと改善や内胚葉系統または PDX1 に効率的に区別するために以前に発見されたいくつかの hPSC ラインの分化効率を安定させる+細胞。
Introduction
膵臓は外分泌と内分泌の細胞の主し、その機能不全またはオーバー ロードを引き起こすいくつかの疾患、膵炎、糖尿病、膵臓癌など。Pancreatopathy の病因を解明するには、発達過程と膵臓の細胞の機能を分析する必要は。また、細胞・組織の補充療法を確立する堅牢な品質と安定した供給が必要です。ひと多能性幹細胞 (hPSC)-派生膵臓細胞は、これらの目的の有望な細胞ソースと膵臓細胞へ分化プロトコルは集中的に調査1,2,3をされています。 4。膵 β 細胞の in vitro 生成における最近の進歩は、人間、大人の糖尿病モデル マウス2,3への注入時にこれらの細胞の治療効果 β 細胞の生成を模倣します。さらに、健康の誘導多能性幹細胞 (Ips) と 1 型糖尿病患者のドナーから生成された β 細胞の解析はストレス5のとき下を含む機能の相違を認めなかった。さらに、疾患表現型が部分的に患者由来の Ips または hPSCs 患者6,7と同じサイトで遺伝子変異を遺伝的に膵細胞の再現します。
膵臓の細胞を生成すると、hPSCs から、発達過程を繰り返す段階的分化を使用します。膵臓は地域 Y ボックス 17 (SOX17) を決定性を表現する初期胚の内胚葉層から派生した、フォーク ヘッド ボックス A2 (FOXA2)8。マウス研究に基づいて、内皮層は肝細胞核因子 1-β (Hnf1β) と肝細胞核因子 4 アルファ (Hnf4α) の式によってマークされている原始腸の管を形成します。原始腸の管を延長し、呼吸器、消化管や臓器に成長します。伸び後、臼歯前腸地域なる推定膵領域 1 (PDX1)8,9,10転写因子膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質の表現によって示されるように。背側と腹側部、PDX1+ 1 (NKX6.1)8,11膵臓転写因子 1 サブユニット α (PTF1A) および NK6 ホメオ ボックスの共発現によってマークされているフォーム膵芽腸チューブが厚きます。この式は、膵の器官の形態の開始をマークします。膵臓の芽のコンポーネントである膵臓内胚葉細胞上皮構造12分岐管ネットワークを形成し、最終的にインスリン分泌 β 細胞を含む、外分泌と内分泌の細胞に分化し、グルカゴン分泌 α-細胞。PDX1 の式は全体の膵開発全体を通して観察し、β、δ 細胞9,13,14にローカリゼーションを示します推定の膵領域で最初に検出されました。ただし、Pdx1+ Ptf1a または Nkx6.1 を表現していないセル領域を胃幽門部、十二指腸、胆管、マウス9、PDX1 開発の後期段階にいくつかの腸の細胞に区別する+細胞は、人間の初期の発達段階では膵前駆細胞と見なされます。
PDX1 に hPSCs を区別するために詳細なプロトコルを提案するここでは、+細胞膵臓系譜の生成のため。播種によるプロトコル開始分化には、単一細胞15,16,17が分離されます。一般的に、画一的な hPSCs、植民地または懸濁液、接着性細胞集塊として維持されます。その結果、ほとんどのプロトコルは、通過直後に分化を開始します。しかし、植民地または集計の状態でセルが空間と転写不均質18,19,20,21,22を妨げる可能性がありますになりやすい、決定的な内胚葉の分化第一歩は PDX1 に非効率的な分化に続く+細胞。この議定書の分化効率を安定させるために改善し扱いやすさを提供するかもしれない以前発見されたいくつかの hPSC ライン内胚葉系統および PDX1 に効率的に区別するために+細胞23,24,25。
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Protocol
HPSCs を用いた実験は、医学科と京都大学大学院医学研究倫理委員会で承認されました。
1 材料の準備
注:無菌環境で細胞培養のため、すべてのメディアと試薬を準備します。ウォーム アップを使用する前に室温 (RT) 基本培地。媒体の差別化は試薬のルート詳細を 6 時間以内に使用される材料のテーブルに表示されます。
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分化 (図 1 a)
- ステージ 1 a 媒体: 転送ピペットを使用してチューブに RPMI 1640 媒体。無血清サプリメント、アクチビン A、CHIR99021、および Y-27632 を 1 倍、100 ng/mL、3 μ M と 10 μ M の濃度にそれぞれ追加します。
- ステージ 1 b 中: 転送ピペットを使用してチューブに RPMI 1640 媒体。無血清サプリメント、アクチビン A と 1 x、100 ng/mL、1 μ M の濃度 CHIR99021 をそれぞれ追加します。
注: CHIR99021 の濃度は、ステージ 1 a の中でより低いべきと添加が不要で、細胞数は大きくなります。 - ステージ 2 メディア: ピペットを使用してチューブに転送改善 MEM (iMEM) 媒体。無血清サプリメントとケラチノ サイト成長因子 (KGF) を 0.5 倍と 50 ng/mL の濃度にそれぞれ追加します。
- ステージ 3 媒体: ピペットを使用してチューブに iMEM 媒体。無血清サプリメント、KGF、酒を飲むこと、3-ケト-N-アミノエチル-N'を追加 - aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC)、ピペットによる 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic 酸 (TTNPB)濃度 0.5 x 50 ng/mL、100 ng/mL、0.5 μ M と 10 nM、それぞれ。
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フローサイトメトリー (FCM)
- 透過/洗浄バッファー x 1: 管にピペットで水を転送します。1 x の濃度にピペットで透過/洗浄バッファーを追加します。
- FCM ソリューションをブロック: 管にピペットで透過/洗浄バッファー x 1 を転送します。ロバ血清ピペット濃度 2% (巻/巻) に追加します。
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免疫染色
- ソリューションをブロック: 転送ダルベッコ Phosphate-Buffered 生理食塩水 (DPBS) ピペットによって管に。ロバ血清およびトリトン X ピペットで 5% (巻/巻)、0.4% (巻/巻) の濃度をそれぞれ追加します。
2. hPSC 後部前腸細胞/膵前駆細胞への分化 (PDX1 細胞の+ )
注:生殖不能の技術を使用してすべての手順を実施します。hPSCs は、製造元の指示17,26によると hPSC 培地と hPSCs の合成表面素材を施した 6 ウェル プレートで保持されます。細胞に達する 50-80% の confluency (ステージ 0) は差別化のためそれらを使用します。
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基底膜マトリックス コーティング プレートを準備します。
- 転送管に RPMI 1640 (4 °C) の 6 mL は 4 °C 氷の上に冷却されます。基底膜マトリックス (4 °C) 冷却 1 mL ピペット チップで 2 mg を追加し、0.33 mg/mL 基底膜マトリックスに穏やかなピペッティングでよく混ぜます。
- ピペットで 6 も細胞培養プレートの各ウェルに希薄化後の基底膜マトリックスの 2 mL を転送します。37 °C の定温器で 60-90 分でプレートを配置します。その後、(3 h) 内で使用するまで RT でプレートを保ちます。
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シード、hPSCs、(ステージ 1 a) 決定的な内胚葉への分化を開始します。
- 使用される媒体を吸引し、6 ウェル プレートで培養した hPSCs を洗浄するピペットによってウェルあたり 0.5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (RT) 2 mL を追加します。
- 0.5 mM EDTA を吸引し、ピペットでよく当り 0.5 mM EDTA の 2 mL を追加します。37 °C で 5 分で版を孵化させなさい。
- 0.5 mM EDTA を吸引し、10 μ M を添加した常温 hPSC 培地 1 mL を追加あたりピペットによってよく Y-27632。ピペットの優しく、迅速を吹き飛ばすセルおよび単一セル周辺固定支持細胞を分離するに皿の上を添付します。ピペッティング時に細胞懸濁液をバブルアップしません。
- HPSC 常温 10 μ M を添加した培地 4 mL を含む 50 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送 Y-27632。細胞懸濁液をピペット優しく。
- トリパン ブルー染色除外手順を使用して細胞懸濁液の細胞数をカウントします。
- 細胞懸濁液の管内トリパン ブルーの 15 μ L ミックス 15 μ L。
- 複製内のスライドをカウントするセルに 10 μ L ピペットでトリパン ブルーで希釈細胞懸濁液の 10 μ L を転送します。
- セルの自動カウンター番号セルをカウントし、細胞懸濁液の細胞密度を計算します。生存率は、通常 > 98%。
- 6 ウェル プレート (1 〜 1.5 × 105セル/cm2) の井戸あたり 10 の6セル × 1 1.5 で 50 mL の遠心管の細胞懸濁液の約数。
- 200 x gで RT 5 分で 50 mL のチューブを遠心します。
- ピペットを使用して上清を吸引し、ウェルあたり 1 ml のステージ 1 a 媒体 (RT) の細胞を再懸濁します。優しく細胞懸濁液をピペット、ステージ 1 a 媒体 (ウェルあたりの合計、2 mL) の別の 1 mL を追加します。
- 2.1.2 の手順で 1,000 μ L ピペットにより作製した細胞培養皿の井戸で希薄化後の基底膜マトリックスを吸い出しなさい。すぐに次のステップに進みます。
- もう一度ステップ 2.2.8 に細胞懸濁液をピペット優しく。混合直後後 6 ウェル プレートの各ウェルに、細胞懸濁液 (2 mL) を転送します。カバー プレートを光から保護するためにアルミ箔をプレート。RT で 10-15 分のためのクリーン ベンチでプレートを配置します。
注:播種後プレートを移動しないでください。 - 37 °C、5% CO2インキュベーター (加湿雰囲気)、24 h の文化にプレートをそっと置きます。
注:播種後プレートを振るか。
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決定的な内胚葉 (ステージ 1 b) への分化を誘導します。
- 使用される媒体を吸引し、ピペットによって井戸に DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。
注:単層から任意の死んだ細胞を削除するには、各吸引前にプレートを軽く振る。 - 使用 DPBS をピペットで吸引し、ステージ 1 b 中 (37 °C) ウェルあたり 4 mL を追加します。48 h の 37 °C の定温器 (5% CO2の加湿雰囲気) 文化にプレートをそっと置きます。
- 使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。
注:各吸引前に穏やかな揺れで単層から死んだ細胞を削除します。 - 使用 DPBS をピペットで吸引し、ステージ 1 b 中 (37 °C) ウェルあたり 4 mL を追加します。インキュベーター (37 °C、5% CO2の加湿雰囲気) と 24 h の文化にプレートをそっと置きます。
- 使用される媒体を吸引し、ピペットによって井戸に DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。
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原始腸チューブ (ステージ 2) への分化を誘導します。
- 使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。
注: 各吸引前に穏やかな揺れで単層から死んだ細胞を削除します。 - 使用 DPBS をピペットで吸引し、ステージ 2 メディア (37 °C) ウェルあたりの 4 つの mL を追加します。4 日間のインキュベーター (37 °C、5% CO2の加湿雰囲気) と文化にプレートを配置します。
- 使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。
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PDX1 への分化を誘導する+細胞 (ステージ 3)。
- 使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。
- 使用の DPBS をピペットで吸引し、ステージ 3 媒体 (37 °C) ウェルあたりの 4 mL を追加します。3 日間のインキュベーター (37 °C、5% CO2の加湿雰囲気) と文化にプレートを配置します。
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膵内分泌細胞への分化を誘導します。
- 前述のプロトコル3,16,26NKX6.1+細胞誘導 (8 日間のステージ 4) 内分泌細胞誘導 (ステージ 5、12 日間) 続くを実行します。特徴および免疫染色と定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) 解析による内分泌細胞の分化を検証します。
注:豊田ら16木村ら26実験手順の詳細についてを参照してください。QRT pcr 用プライマー シーケンスの表 1を参照してください。
- 前述のプロトコル3,16,26NKX6.1+細胞誘導 (8 日間のステージ 4) 内分泌細胞誘導 (ステージ 5、12 日間) 続くを実行します。特徴および免疫染色と定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) 解析による内分泌細胞の分化を検証します。
3 フローサイトメトリー (FCM)
- 使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで 0.5 ミリメートルの EDTA の 2 mL を追加します。吸引と 0.5 mM EDTA 添加 1 回繰り返します。
注:優しく単層細胞ごと吸引する前にから任意の死んだ細胞を削除するプレートを振る。 - (約 3-6 × 106ウェルあたりの細胞) の細胞を分離、0.25% の 2 mL を加えてトリプシン ウェルあたり 0.5 mM EDTA を含みます。37 °C で 5-10 分で版を孵化させなさい。
- 単一セル周辺固定支持細胞を分離、すばやく、やさしくピペットします。ピペッティング時に細胞懸濁液をバブルアップしません。
- 基本媒体 (RPMI 1640 または RT iMEM) の 8-10 mL を追加 0.5 x 無血清サプリメントと 10 μ M を含む Y-27632 あたりも、細胞懸濁液をミックスします。遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。
- 300 x gで RT 5 分でチューブを遠心します。
- 上清を吸引し、2 ml の 0.5 mM EDTA (RT) の細胞を再懸濁します。細胞懸濁液をピペット優しく。
- 300 x gで RT 5 分でチューブを遠心します。
- 上清を吸引し、フードの下で 10 の6セルごとを固定・透過バッファー 100 μ l 細胞を再懸濁します。優しく、フードの下に細胞懸濁液をピペットします。常温 30 分の管を保ちます。
- 400 x gで RT 5 分でチューブを遠心します。
- フードの下で上清を吸引し、10 の6セルごと 500 μ L FCM 遮断ソリューションと細胞を再懸濁します。細胞懸濁液をピペット優しく。常温 30 分の管を保ちます。
- 50 μ L の細胞懸濁液をチューブ (約 1 x 10 の5セル) に転送します。400 x g常温で 5 分間削除でチューブに上清を遠心しを希釈した一次抗体 100 μ l 細胞を再懸濁します (材料の表を参照してください) FCM の解決を妨げる、4 °C の孵化させなさい > 16 h。
- 400 x g常温で管を遠心分離機 5 分、上清を除去し、パーマ/洗浄バッファー x 1 の 180 μ L と細胞を再懸濁します。
- 400 x g常温で 5 分間削除でチューブに上清を遠心しを希釈した二次抗体 100 μ l 細胞を再懸濁します (材料表参照) FCM ソリューションをブロックで。4 °C のまたは 60 分のための RT で細胞をインキュベート > 16 h 光からの保護。
- 400 x g常温で管を遠心分離機 5 分、上清を除去し、パーマ/洗浄バッファー x 1 の 180 μ L と細胞を再懸濁します。
- 上澄み 400 x gで 5 分間削除常温で管を遠心し、2% ロバ血清 DPBS 180 μ L と細胞を再懸濁します。
- 細胞懸濁液をフィルターするには、分析までの光からセル ストレーナー (35 μ m ナイロン メッシュ) と 4 °C の保護と維持底部ポリスチレン チューブ ラウンド 5 mL に転送します。
- 流れの cytometer27によって積極的に陽性細胞の割合を分析します。
4. 染色
- 使用される媒体を吸引し、井戸の中にピペットで DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。
注:各吸引前に単層細胞から任意の死んだ細胞を削除するプレートを軽く振る。 - 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 2 mL を追加 (4 °C)、フードの下でピペットによってウェルあたり。4 °C 20 分間プレートを維持します。
- フードの下のピペット、PFA を削除します。フードの下のピペットで RT にも DPBS 2 mL を追加します。吸引と DPBS 添加 1 回繰り返します。
- ウェルあたりブロッキング溶液 2 mL を追加し、常温で 30 分間プレートを維持します。
- 使用されるソリューションを吸引し、一次抗体の 1 つの mL を追加 (材料の表を参照してください) ウェルあたり解決を妨げるのです。4 °C のため、60 分間室温でインキュベート > 16 h。
- 使用されるソリューションを吸引、DPBS 0.4% を含む 2 mL を加えるトリトン X-100 10 分繰り返す誤嚥、ソリューションと 1 つの時間の追加 RT でインキュベートし、。
- 使用されるソリューションを吸引し、二次抗体の 1 つの mL を追加 (材料の表を参照してください) ウェルあたり解決を妨げるのです。RT で光からの保護と 60 分間インキュベートします。
- 使用されるソリューションを吸引、DPBS 0.4% を含む 2 mL を加えるトリトン X-100 (RT) と RT で光からの保護で 5 分間インキュベートします。吸引、ソリューションとインキュベーションの追加を 2 回繰り返します。
- 28蛍光顕微鏡下で分化効率を調べる顕微鏡写真を取る。
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Representative Results
伝搬 hiPSCs (585A129,30) 凝縮と分化に適した均質な膜 (図 1 b)。画一的な hiPSCs (ステージ 0) 解離、低細胞密度 (1 〜 1.5 × 105セル/cm2) にある単一セルとして再シードします。1 h 内のセルは、プレートに取り付け、突起を表示を開始します。1 日目、セルを増殖して表面積の 80-90% をカバーする分散も。ステージ 1 b の中にメディアが死んだ細胞により曇り表示します。死んだ細胞が邪魔生存と分化細胞の下に横になっているので、非常に効率的な分化の死んだ細胞の除去が欠かせません。日 3-4 細胞はコブルス トーン外観と称される均質膜シートを形成します。この時点で、ほとんどの細胞は領域 Y ボックス 2 (SOX2)、未分化細胞のマーカーを特定するセックスを表現するを停止し、代わりに決定的な内胚葉マーカー SOX17、(図 2 a と B) の 90% 以上を表現します。ほとんど SOX17+細胞エクスプレス FOXA2 (図 2 a)。この手順 (図 3) の分化効率不適切なセル密度妥協を許さず分化を開始します。ステージ 2 と 3、細胞死を緩和、および使用される媒体はステージ 1 b だと曇りではないです。セル表現原始腸チューブ マーカー HNF1β と HNF4α (図 2) し、最終的に後部前腸・膵前駆細胞マーカー、PDX1、(図 2 D および E) の 90% 以上を表現。PDX1+細胞誘導は別による線、1231A3 31, hESC ライン、KhES 3 32 (図 4) で再現。qRT PCR 結果ステージ マーカーの発現は免疫染色 (図 5 a) 安定していた。PDX1 の mRNA の発現はステージ 3 で明らかであるし、あとがきが大幅に向上します。
PDX1+初期の発達段階でセルも胃幽門部、十二指腸、肝外胆管と腸9部がないだけ膵臓細胞に分化する可能性があります。体外の微分の潜在性生成 PDX1+膵内胚葉の報告されたプロトコルで拡張された文化によって評価される膵臓細胞に細胞と膵内分泌細胞の3,16, 26. 膵内胚葉のマーカー、 NKX6.1、および 2 つの膵内分泌マーカー、インスリンとグルカゴンの式はそれぞれ 19 (ステージ 4) と 31 (段階 5) の日に観察された (図 5)。
図 1: 段階的分化細胞の代表的な外観します。HPSCs から膵臓系譜への分化監督の A (A) 方式です。括弧内の数字は、濃度 (単位は下に書いてあります) を示します。(B) 代表的な明るいフィールド顕微鏡分化誘導培養のキーの手順で hiPSCs の。585A1 hiPSCs は単一セルとして解離され、決定的な内胚葉、原始腸チューブおよび後部前腸・膵前駆細胞に分化誘導されます。下のパネルは、上部のパネルの拡大ビューです。RPMI RPMI 1640;AA、アクチビン (ng/mL);CH, CHIR99021 (Μ M);KGF (ng/mL);ノグ、頭 (ng/mL);サイク、3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (μ M);TTNPB、4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic 酸 (nM)。スケール バー = 300 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: hiPSCs から膵臓系譜への代表的な誘導します。SOX2 の割合 (A)-SOX17+細胞分化 (ステージ 0) の前に、(ステージ 1 b) 4 日目フローサイトメトリーで分析しました。HiPSCs 未分化 (SOX2+SOX17-) 決定的な内胚葉に分化した (SOX2-SOX17+)。ほとんど SOX17+細胞の共発現 FOXA2。(B) 代表的な蛍光顕微鏡写真 (ステージ 1 b) 4 日目。固定細胞染色による SOX17 (緑), SOX2 (赤) と核 (青)。(C) 代表的な蛍光顕微鏡写真日 4 (ステージ 1 b) と 8 (ステージ 2)。固定のセルは、(青) HNF1β (緑), HNF4α (赤) と核の染色された.(D) 日 4 (ステージ 1 b) と 11 (ステージ 3) フローサイトメトリーによる解析 PDX1、陽性細胞の割合。(E) PDX1 (緑) と 11 (ステージ 3) 日核 (青) の代表的な蛍光顕微鏡。スケール バー = 100 μ m。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 異なるセル密度から開始された決定的な内胚葉への代表的な誘導します。(A) 代表的な明るいフィールド顕微鏡細胞分化後 1 h。hiPSCs 単一細胞として解離し、異なるセル密度 (1-50 104/cm2x) で決定的な内胚葉に分化誘導されます。下のパネルは、上部のパネルの拡大ビューです。SOX2 の割合 (B)-SOX17+細胞分化 (ステージ 0) の前に、(ステージ 1 b) 4 日目フローサイトメトリーで分析しました。(C) PDX1 の割合+セル日 8 (ステージ 2) と 11 (ステージ 3) フローサイトメトリーで分析しました。スケール バー = 300 μ m。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表的な誘導 PDX1 に向かって+細胞 hiPCSs と hESCs 。によるライン、1231A3 (A) hESC ライン、KhES-3 (B) が決定的な内胚葉および PDX1 に区別されたと+細胞。フローサイトメトリーによる細胞組成を分析しました。SOX2 の割合-SOX17+細胞を分化 (ステージ 0) の前に、(ステージ 1 b) 4 日目に行った。PDX1 の割合+日 8 (ステージ 2) と 11 (ステージ 3) 細胞を調べた。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 代表的な誘導する内分泌細胞と膵内胚葉へ。hiPSCs (585A1) は PDX1 に区別された+細胞。セルはさらに報告されたプロトコル3,16,26膵内分泌細胞と膵内胚葉に分化しました。(A) mRNA の段階のマーカーの表現を量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) によって測定しました。データは、 GAPDH式に正規化され、フォールドのピーク値に相対的な遺伝子発現の変更として提示します。PDX1式がで増加したことに注意してください > 20 日 8 (ステージ 2) 11 (ステージ 3) から > 100 日 19 (ステージ 4) 11 (ステージ 3) から。大人のひと膵臓内の式は、Panc として表示されます。SOX2、黒です。SOX17、紫;HNF1β、茶色です。HNF4α、オレンジ;PDX1、ライト グリーン。NKX6.1、緑;インスリン、青い;グルカゴン赤。(B) 代表的な蛍光顕微鏡写真の膵内胚葉のマーカー、NKX6.1 (赤), 11 (ステージ 3) と 19 (ステージ 4) の日。PDX1 (緑) と (青) の核共同ステンド グラスでした。(C) 2 つの膵内分泌メーカー、インスリン (INS、緑)、日 19 (ステージ 4) と 31 (ステージ 5) グルカゴン (GCG、赤) の代表的な蛍光顕微鏡。核 (青) が共同ステンド グラス。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 遺伝子名 | 遺伝子シンボル | 前方のプライマー | 逆プライマー |
| グリセルアルデヒド-3-なリン テ ・脱水素酵素 |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| Sry 遺伝子ボックス 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| Sry 遺伝子ボックス 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| HNF1 ホメオ ボックス B | HNF1Β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| 肝細胞核因子 4 α | HNF4Α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| 膵臓と十二指腸ホメオ ボックス 1 | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| NK6 ホメオ ボックス 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| グルカゴン | GCG | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| インスリン | INS | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
表 1: qPCR 用プライマー。
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Discussion
PDX1 の世代+のセルが複数の手順で構成されていますしたがって、適切な時期に細胞を治療するために重要です。手順の中で決定的な内胚葉の誘導効率主最終誘導効率に影響を与える、おそらく他汚染系統の細胞 (すなわち、中胚葉と外胚葉) 増殖または分泌することができるからの干渉によって要因特定の分化を混乱させます。場合 SOX17 の割合+ 80% 未満の細胞は日 4 (ステージ 1 b)、PDX1 への効率的な誘導に+細胞が危険にさらされる可能性があります。
HPSCs の未分化状態は植民地または最適化された細胞の集合体として維持されます。ただし、コロニーまたは集計から分化を開始するメソッド苦しむことがありますの不均一性の異なる細胞接着とコロニーの密度のためこのような細胞のさまざまな段階では、中心と周縁22のように細胞周期の25。その一方で、私たちのメソッドは、単一のセルまたはすべての単一細胞での細胞密度の細胞接着の比較的均質な状態を可能にする解離の単一細胞で開始します。各セルの均質なハンドリングの面で私たちの方法はコロニーや集計の文化で始まる他のものより簡単かもしれません。
PDX1 を誘導するために我々 のプロトコルを使用できますが+は複数の hPSC 線から細胞分化まだ非効率的かもしれない。このような場合は、hPSC ラインの間で播種直後後接着状態の違いが原因であるし、播種密度の変更可能性があります解決策33。確かに、図 3に示しますその不適切な播種細胞密度の妥協への分化決定的な内胚葉および PDX1+細胞。PDX1 の最適な細胞密度興味深いことに、+細胞誘導は達成細胞集団の間で異なっていた > 90% 決定的な内胚葉。非効率的な分化のもう一つの可能性は、未分化状態のマーカーの発現にもかかわらず多能性の質を落とす未分化の hPSCs の整備不良状態です。この場合、hPSC 拡張文化は株を凍結初期一節から再開する必要があります。 またはサブのクローン作成を実行して、適切な状態で hPSCs を取得します。日 8 (ステージ 2) または 11 (ステージ 3) 非効率的な分化の場合手順の期間を最適化してください。このアイデアをサポートするには、ステージ 3 の期間後ステージ セル特性の獲得のために重大が示されているし、セルは、膵系統34行に依存します。
PDX1 の世代+細胞は膵臓細胞の in vitro における生成のため非常に重要です。PDX1 は機能的 apancreatic35Pdx1 null マウスからの知識に基づく膵臓の開発にとって不可欠です。一貫して、in vitro および in vivo の注入研究示した hPSC 派生 PDX1+細胞外分泌を含むすべての膵コンポーネントへと発展する可能性があるし、内分泌細胞では、膵 β 細胞の3,16,36,37。 したがって、PDX1 の効率的な生成+細胞 hPSCs リードからの安定的な膵細胞供給の糖尿病に対する β 細胞治療の確立およびひと膵臓の開発および膵疾患の理解のために。
このメソッドの制限は、いくつかの細胞の種類や細胞処理には適していません、二次元 (2 D) 単層文化形式に関連しています。近年、三次元 (3 D) 文化が成熟した細胞や体内の微小環境の模倣のための組織の生成を促進するために示されています。たとえば、3 D の文化で β 細胞が生成されますがない 2次元単層培養細胞外グルコース レベル38の応答でインスリンを分泌する能力を達成できます。
PDX1 を使用する+の発達後のセルタイプの生成細胞懸濁培養細胞外マトリックスに埋め込まれている集計など、3 D の文化にシフトすることが重要だし、空気液体集計文化インタ フェース3,16,37します。 さらに、2次元単層培養は培養、スケーラビリティを制限するよりも培養するためより多くの表面積を必要とします。商業使用のための細胞の大量の処理には、マイクロ ビーズの使用などの変更が必要です。同時に、本法は分化誘導因子のスクリーニングと遺伝子導入による分子機構の探査に適しています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事はから資金援助によって日本社会のための科学振興) Scientific Research (C) (日本学術振興会科研費補助金 Number15K09385 と 18 K 08510) を通じてに科研費と技術移転、日本学術振興会研究員 (日本学術振興会科研費助成番号の部分で支えられました17J07622) A.K.、および医学研究開発 (アメッド) その研究を通じて機構に k. o. に「iPS 細胞研究、再生医療実現に向けた研究センター ネットワークの中核拠点」を付与著者が原稿を読んで博士ピーター Karagiannis をありがちましょう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
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