Summary
Burada, pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut (PDX1+) hücreleri pankreas soy nesil için alan koloni sigara türü monolayer büyüme üzerinde tek hücre ayrışmış. Bu yöntem homojen hPSC elde edilen hücreleri, genetik manipülasyon üreten ve eleme için uygundur.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücre (hPSC)-türetilmiş pankreas hücreleri rejeneratif tıp ve insan gelişim süreçlerini incelemek için bir platform için umut verici bir hücre kaynağı vardır. Stepwise gelişimsel süreçleri beyannamedir farklılaşma pankreas hücreleri pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ de dahil olmak üzere oluşturmak için en önemli yollarından biri yönlendirilir (PDX1+) pankreas progenitör hücre. Geleneksel iletişim kuralları ile küçük koloniler farklılaşma geçişini kısa bir süre sonra Başlat. Ancak, koloniler veya toplamları, hücre farklılaşması için PDX1 engel heterogeneities eğilimli durumdadır+ hücreleri. Burada, hPSCs PDX1 ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut+ hücreleri. Protokol dört adımlardan oluşur ve farklılaşma tohumlama Disosiye tek hücreleri tarafından başlatır. SOX17 indüksiyon+ kesin endoderm hücreleri PDX1 iki ilkel gut tüp işaretleri, HNF1β ve HNF4α ve nihai farklılaşma ifade tarafından takip edildi+ hücreleri. Mevcut Protokolü kolay kullanım sağlar ve geliştirmek ve verimsiz endodermal soy veya PDX1 ayırt etmek için daha önce bulunan bazı hPSC satırları farklılaşma verimliliğini stabilize+ hücreleri.
Introduction
Pankreas esas ekzokrin ve endokrin hücreleri oluşur ve onun disfonksiyon ya da aşırı pankreatit, diyabet ve pankreas kanseri gibi birçok hastalıklara neden olur. Pancreatopathy pathogeny aydınlatmak için pankreas hücrelerinin işlevini ve gelişim sürecinin analiz etmek gereklidir. Buna ek olarak, istikrarlı hücre kaynağı sağlam kalite ile hücre/doku takviyesi terapi kurmak için gereklidir. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC)-türetilmiş pankreas hücreleri bu amaçlar için umut verici bir hücre kaynak vardır ve farklılaşma Protokolü pankreas hücreleri doğru çalışılmış1,2,3, oldu 4. Pankreas β hücrelerinin tüp üretimi son gelişmeler yetişkin insan ve bu hücreleri Haritayı terapötik etkinlik implantasyon diyabetik modeli fareler2,3içine üzerine β hücrelerinin üretimi taklit. Buna ek olarak, çözümleme İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) sağlıklı ve tip 1 diyabet hasta bağış üretilen β hücrelerinin stres5ne zaman altında dahil olmak üzere hiçbir işlevsel farklılıklar ortaya. Ayrıca, hastalık fenotipleri kısmen hasta elde iPSCs veya hasta6,7aynı sitedeki Genetik mutasyonlar yataklık hPSCs ile indüklenen pankreas hücrelerinde yeniden.
HPSCs pankreas hücreleri üretmek için gelişimsel süreçleri beyannamedir kademeli yönlendirilmiş farklılaşma kullanılır. Pankreas bölgesi Y-box 17 (SOX17) belirleme seks ifade erken embriyonun endoderm katmandan türetilir ve forkhead kutusu A2 (FOXA2)8. Tabanlı üzerinde fare çalışmaları, Hepatosit nükleer faktör 1-beta (Hnf1β) ve Hepatosit nükleer faktör 4-alfa (Hnf4α) ifade tarafından işaretlenir ilkel gut tüp endodermal katman oluşturur. İlkel gut tüp hisli ve solunum aygıtı, sindirim sistemi ve organları gelişir. Uzama sonra meşru pankreas bölge posterior foregut bölge oluyor 1 (PDX1)8,9,10transkripsiyon faktörü pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein ifade tarafından işaretlenmiş gibi. PDX1 dorsal ve ventral bölümlerini+ gut tüp kalınlaşmasına 1 (NKX6.1)8,11pankreas transkripsiyon faktörü 1 alt birim alfa (PTF1A) ve NK6 homeobox ortak ifade tarafından işaretlenen formu pankreas tomurcukları için. Bu ifade pankreas organogenesis morfolojik başlangıcı işaretler. Bileşenleri pankreas tomurcukları olan pankreas endoderm hücreleri epitelyal yapıları12 dallı bir borulu ağı ve sonunda insülin salgılayan β-hücreleri de dahil olmak üzere ekzokrin ve endokrin hücrelere ayırt etmek ve glukagon salgılayan α-hücreleri. PDX1 ifade ilk, o zaman tüm pankreas geliştirme görülmektedir ve yerelleştirme β ve δ hücreleri9,13,14gösterir meşru pankreas bölge tespit edilmiştir. Her ne kadar Pdx1+ Ptf1a veya Nkx6.1 ifade değil hücre alan ayırır Gastrik test, oniki parmak bağırsağı, extrahepatic safra kanalını ve bazı bağırsak hücreleri geç aşamada fareler9, PDX1 geliştirme ortasında içine+ hücrelerin CSF'den pankreas insanlarda erken gelişimsel aşamada kabul edilir.
Burada, hPSCs PDX1 ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut+ hücreleri pankreas soy nesil için. Tohum tarafından Protokolü başlatır farklılaşma tek hücreler15,16,17ayrışmış. Genel olarak, farklılaşmamış hPSCs koloniler veya hücre toplamları süspansiyon veya yapışma olarak korunur. Sonuç olarak, kısa bir süre sonra passaging farklılaşma çoğu protokolleri başlatın. Koloniler veya toplamları durumda, hücre hangi engel kayma ve transkripsiyon heterogeneities18,19,20,21,22' ye, ancak, yatkındır kesin endoderm doğru ilk farklılaşma adım takip verimsiz farklılaşma tarafından PDX1 için+ hücreleri. Mevcut Protokolü geliştirmek ve farklılaşma verimlilik için kolay kullanım sunabilir verimsiz endodermal soy ve PDX1 ayırt etmek için daha önce bulunan bazı hPSC satırları23, + hücreleri 24 , 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HPSCs kullanarak deneyler tıp bölümü ve lisansüstü tıp Fak., Kyoto Üniversitesi Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. malzeme hazırlanması
Not: Tüm medya ve reaktifler hücre kültüründe steril bir ortam hazırlamak. Temel kültür ortamına oda sıcaklığında (RT) kullanmadan önce ısınmak. Orta farklılaşma reaktifleri ayrıntılarını RT. 6 h içinde kullanılan Malzemeler tabloiçinde listelenir.
-
Farklılaşma (şekil 1A)
- Sahne 1A orta: Transfer RPMI 1640 orta bir pipet kullanarak bir tüp içine. Serum ücretsiz ek, aktivin A, CHIR99021 ve Y-27632 1 x, 100 ng/mL, 3 mikron ve 10 mikron, konsantrasyon için sırasıyla ekleyin.
- Sahne 1B orta: Transfer RPMI 1640 orta bir pipet kullanarak bir tüp içine. Serum ücretsiz ek, aktivin A ve CHIR99021 1 x, 100 ng/mL, ≤1 mikron, konsantrasyon için sırasıyla ekleyin.
Not: CHIR99021 konsantrasyonu sahne 1A ortamı, daha düşük olması gerekir ve ayrıca gerekli değildir ancak cep numarasını artırır. - 2. aşama orta: Transfer geliştirilmiş MEM (iMEM) orta bir pipet kullanarak bir tüp içine. Serum ücretsiz ek ve keratinosit büyüme faktörü (KGF) 0.5 x ve 50 ng/mL, konsantrasyon için sırasıyla ekleyin.
- 3. aşama orta: Transfer iMEM orta bir pipet kullanarak bir tüp içine. Serum ücretsiz ek, KGF, kafa, 3-Keto-N-aminoethyl-N'Ekle - aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) ve pipet için tarafından 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic asit (TTNPB) 0,5 konsantrasyonlarda x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0.5 mikron ve 10 nM, anılan sıraya göre.
-
Akış Sitometresi (FCM)
- 1 x Permeabilization/yıkama arabellek: Transfer su bir tüp tarafından bir pipet. Permeabilization/yıkama arabellek bir pipet tarafından 1 x konsantrasyon için ekleyin.
- FCM çözüm engelleme: 1 x Permeabilization/yıkama arabellek bir tüpün içine bir pipet tarafından Transfer. Eşek serum bir pipet tarafından %2 (vol/vol) bir konsantrasyon için ekleyin.
-
Immunostaining
- Çözüm engelleme: Transfer Dulbecco'nın Phosphate-Buffered serum fizyolojik (DPBS) içine bir tüp tarafından bir pipet. Eşek serum ve Triton X pipet tarafından % 5 (vol/vol) ve %0,4 (vol/vol), konsantrasyonları sırasıyla ekleyin.
2. hPSC Posterior Foregut hücreler/pankreas ataları için farklılaşma (PDX1+ hücreleri)
Not: Steril teknikleri kullanarak tüm prosedürlerini yürütecektir. hPSCs tarafından hPSC bakım orta üreticinin yönergeleri17,26göre ile hPSCs için sentetik yüzey malzeme kaplı 6-şey plakaları sürdürülür. Hücreleri ulaştığınızda 50-%80 confluency (sahne 0) onları farklılaşma için kullanın.
-
Membran matris kaplı plakalar hazırlayın.
- Transfer RPMI 1640 (4 °C) bir tüp içine 6 mL soğutmalı 4 °C buz üzerinde. 2 mg (4 °C) membran matrisinin soğutmalı 1 mL-pipet ipuçları ve de nazik 0,33 mg/mL membran matris yapmak pipetting tarafından karıştırın.
- Havalesiyle seyreltilmiş membran Matrix 2 mL 6-şey hücre kültür plakaların her şey için bir pipet. Plakayı yerleştirmek 37 °C 60-90 dk bir kuluçka için. Daha sonra tabakları RT (3 h içinde) kullanmak kadar devam et.
-
HPSCs tohum ve farklılaşma için kesin endoderm (sahne 1A) başlatın.
- Kullanılan orta Aspire edin ve 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (RT) 2 mL 6-şey levhalar yaylıdır kültürlü hPSCs yıkamak için pipet tarafından iyi ekleyin.
- 0,5 mM EDTA Aspire edin ve pipet ile 0,5 mM EDTA iyi başına 2 mL ekleyin. Plakayı 37 °C 5 min için kuluçkaya.
- 0,5 mM EDTA Aspire edin ve hPSC bakım orta 1 mL 10 mikron ile desteklenmiş RT eklemek de pipet tarafından başına Y-27632. Yavaşça pipet ama hızlı bir şekilde ekmeye hücreleri plakaları ve olmalı hücreleri tek hücre içine ayırmak için bağlı. Hücre süspansiyon pipetting sırasında kabarcık yok.
- 50 mL santrifüj tüpü 10 mikron ile desteklenmiş RT hPSC bakım orta 4 mL içeren hücre süspansiyon transfer Y-27632. Yavaşça hücre süspansiyon pipette.
- Trypan mavi leke dışlama yordamı kullanarak hücre süspansiyon hücre saymak.
- Mix 15 μL hücre süspansiyon ve Trypan mavi 15 μL bir tüp.
- Tarafından 10 μL pipet Çoğalt slaytları sayma hücre üzerine Trypan mavi ile seyreltilmiş hücre süspansiyon 10 μL aktarın.
- Hücre bir otomatik hücre sayacı ile sayı saymak ve hücre süspansiyon hücre dansitesi hesaplayın. Canlılık olduğunu genellikle > % 98.
- Aliquot 50 mL santrifüj tüpü 1-1,5 x 6-şey tabak (105 hücreleri/cm2x 1-1.5) kuyu başına 106 hücre hücre süspansiyon.
- 50 mL tüp, 200 x g de RT için 5 dk santrifüj kapasitesi.
- Bir pipet kullanarak süpernatant Aspire edin ve 1 mL sahne 1A orta (RT) içeren hücreleri de resuspend. Yavaşça hücre süspansiyon pipette ve sahne 1A orta (Toplam, iyi 2 mL) başka bir 1 mL ekleyin.
- 2.1.2. adımda bir 1000 μL pipet tarafından hazırlanan hücre kültür plakaların Wells seyreltilmiş membran matris Aspire edin. Hemen bir sonraki adıma geçin.
- Yavaşça tekrar adım 2.2.8 hücre süspansiyon pipette. Hemen karıştırma sonra hücre süspansiyon (2 mL) 6-şey plaka her kuyunun içine aktarın. Plaka ışıktan korumak için alüminyum folyo ile plaka kapak. 10-15 dk için RT, tezgah temiz tabak yerleştirin.
Not: Plaka tohum sonra hareket ettirmeyin. - Yavaşça plaka bir 37 °C, % 5 CO2 kuluçka (oksijen atmosfer) ve 24 saat için kültür içine yerleştirin.
Not: Plaka tohum sonra sallama.
-
Farklılaşma kesin endoderm (sahne 1B) içine neden.
- Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL wells için pipet tarafından ekleyin. Aspirasyon ve ilavesi DPBS bir kez yineleyin.
Not: Herhangi bir ölü hücreleri monolayer kaldırmak için hafifçe her aspirasyon önce plaka sallayın. - Bir pipet tarafından kullanılan DPBS Aspire edin ve sahne 1B orta (37 °C) iyi başına 4 mL ekleyin. Yavaşça plaka 37 °C İnkübatör (oksijen atmosferini %5 CO2) ve 48 h için kültür içine yerleştirin.
- Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL kuyuya pipet tarafından ekleyin. Aspirasyon ve ilavesi DPBS bir kez yineleyin.
Not: Ölü hücreleri nazik her aspirasyon önce sallayarak monolayer kaldırın. - Pipet tarafından kullanılan DPBS Aspire edin ve sahne 1B orta (37 °C) iyi başına 4 mL ekleyin. Yavaşça plaka İnkübatör (37 °C, % 5 CO2oksijen atmosfer) ve 24 saat için kültür içine yerleştirin.
- Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL wells için pipet tarafından ekleyin. Aspirasyon ve ilavesi DPBS bir kez yineleyin.
-
Farklılaşma (Aşama 2) ilkel gut tüp içine neden.
- Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL kuyuya pipet tarafından ekleyin.
Not: ölü hücreleri nazik her aspirasyon önce sallayarak monolayer kaldırın. - Pipet tarafından kullanılan DPBS Aspire edin ve Stage 2 Orta iyi (37 °C) 4 mL ekleyin. Plaka 4 gündür İnkübatör (37 °C, % 5 CO2oksijen atmosfer) ve kültür yerleştirin.
- Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL kuyuya pipet tarafından ekleyin.
-
PDX1 içine farklılaşma neden+ hücreleri (Stage 3).
- Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL kuyuya pipet tarafından ekleyin. Aspirasyon ve ilavesi DPBS bir kez yineleyin.
- Pipet tarafından kullanılan DPBS Aspire edin ve Stage 3 orta iyi (37 °C) 4 mL ekleyin. Plaka 3 gün boyunca İnkübatör (37 °C, % 5 CO2oksijen atmosfer) ve kültür yerleştirin.
-
Pankreatik endokrin hücrelere farklılaşma neden.
- Endokrin hücre indüksiyon (12 gün sahne 5) ardından NKX6.1+ hücre indüksiyon (8 gün için Stage 4) yukarıda açıklanan protokoller3,16,26ile gerçekleştirin. Karakterize ve endokrin hücre farklılaşması immunostaining ve nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analizi doğrulayın.
Not: Toyoda ve ark.16 ve Kimura vd.26 ayrıntılı deneysel yordamlar için başvurun. Tablo 1 qRT-PCR çözümlemesi için kullanılan astar serileri için başvurun.
- Endokrin hücre indüksiyon (12 gün sahne 5) ardından NKX6.1+ hücre indüksiyon (8 gün için Stage 4) yukarıda açıklanan protokoller3,16,26ile gerçekleştirin. Karakterize ve endokrin hücre farklılaşması immunostaining ve nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analizi doğrulayın.
3. Akış Sitometresi (FCM)
- Kullanılan orta Aspire edin ve 2 mL 0.5 mM EDTA kuyuya pipet tarafından ekleyin. Aspirasyon ve 0,5 mM EDTA eklenmesi bir kez yineleyin.
Not: Yavaşça her aspirasyon önce monolayer hücrelerden herhangi bir ölü hücreleri kaldırmak için plaka sallamak. - Hücreleri (yaklaşık 3-6 × 106 hücre başına iyi) ayırmak için 2 mL % 0.25 ekleyin şey başına 0,5 mM EDTA içeren tripsin. Plakayı 37 °C 5-10dk için kuluçkaya.
- Yavaşça olmalı hücreleri tek hücre içine hızlı bir şekilde ayırmak için ama pipet. Hücre süspansiyon pipetting sırasında kabarcık yok.
- Temel Orta (RPMI 1640 veya iMEM, RT) 8-10 mL ekleyin 0.5 x ek serum-Alerjik ve 10 mikron içeren Y-27632 başına iyi ve hücre süspansiyon karıştırın. Hücre süspansiyon bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Santrifüj tüpü 300 x g de RT 5 min için kapasitesi.
- Süpernatant Aspire edin ve 2 mL 0.5 mm EDTA (RT) içeren hücreleri resuspend. Yavaşça hücre süspansiyon pipette.
- Santrifüj tüpü 300 x g de RT 5 min için kapasitesi.
- Süpernatant Aspire edin ve bir başlık altında 106 hücre başına 100 μL fiksasyon ve permeabilization arabelleği hücrelerle resuspend. Yavaşça bir başlık altında hücre süspansiyon pipette. Tüp RT için 30 dakika tutun.
- Tüp, 400 x g de RT 5 min için santrifüj kapasitesi.
- Bir başlık altında süpernatant Aspire edin ve 500 μL FCM engelleme çözüm hücrelerle başına 106 hücre resuspend. Yavaşça hücre süspansiyon pipette. Tüp RT için 30 dakika tutun.
- Hücre süspansiyon 50 μL bir tüp (yaklaşık 1 x 105 hücreleri) aktarın. 400 x g de RT 5 dk. Kaldır at tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve seyreltilmiş birincil antikor 100 μL hücrelerle resuspend ( Tablo malzemelerigörmek) FCM içinde çözüm engelleme ve kuluçkaya 4 °C için > 16 h.
- 5 dk. süpernatant kaldırmak ve 1 perma/yıkama arabellek x 180 μL hücrelerle resuspend RT de 400 x g , tüp santrifüj kapasitesi.
- 400 x g de RT 5 dk. Kaldır at tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve seyreltilmiş ikincil antikor 100 μL hücrelerle resuspend ( Tablo malzemelerigörmek) çözüm engelleme FCM içinde. Hücreleri 60 dk için RT veya 4 °C için kuluçkaya > Işık koruma ile 16 h.
- 5 dk. süpernatant kaldırmak ve 1 perma/yıkama arabellek x 180 μL hücrelerle resuspend RT de 400 x g , tüp santrifüj kapasitesi.
- 5 dk. Kaldır RT de 400 x g , tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve % 2 eşek serum DPBS içinde 180 μL hücrelerle resuspend.
- Hücre süspansiyon 5 mL yuvarlak alt polistren tüp üzerinde tutun 4 °C koruma ile bir hücre süzgeç (35 µm naylon mesh) ile gelen ışık kadar analiz aktararak filtre.
- Olumlu lekeli hücrelerin bir kısmı tarafından bir Akış Sitometresi27analiz.
4. Immunostaining
- Kullanılan orta Aspire edin ve DPBS 2 mL kuyuya pipet tarafından ekleyin. Aspirasyon ve ilavesi DPBS bir kez yineleyin.
Not: Yavaşça her aspirasyon önce monolayer hücrelerden herhangi bir ölü hücreleri kaldırmak için plaka sallamak. - %4 paraformaldehyde (PFA) 2 mL ekleyin (4 °C) bir başlık altında pipet kuyusunun başına. Plaka tutmak 4 °C 20 dk için.
- PFA pipet bir başlık altında çıkarın. DPBS 2 mL RT pipet bir başlık altında tarafından kuyuya ekleyin. Aspirasyon ve ilavesi DPBS bir kez yineleyin.
- İyi ücret engelleme çözüm 2 mL ekleyin ve plaka RT için 30 dk tutun.
- Kullanılan çözüm Aspire edin ve birincil antikor 1 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) çözüm iyi başına kapatmaktır. 60 dk için RT veya 4 °C için kuluçkaya > 16 h.
- Kullanılan çözüm Aspire edin, %0,4 içeren DPBS 2 mL ekleyin Triton X-100 ve RT 10 dk. tekrar aspirasyon, çözüm ve kuluçka bir kez eklenmesi için kuluçkaya.
- Kullanılan çözüm Aspire edin ve ikincil antikor 1 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) çözüm iyi başına kapatmaktır. RT ışık koruma ile 60 dk için kuluçkaya.
- Kullanılan çözüm Aspire edin, %0,4 içeren DPBS 2 mL ekleyin Triton X-100 (RT) ve ışık koruma 5 min için RT kuluçkaya. Aspirasyon, çözüm ve kuluçka ek iki kere tekrar edin.
- Farklılaşma verimliliği bir floresan mikroskop28altında incelemek için filmler al.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yayılıyor hiPSCs (585A129,30) farklılaşma için uygun olan bir homojen monolayer (şekil 1B) form ve konsantre. Farklılaşmamış hiPSCs (sahne 0) ayrışmış ve düşük hücre yoğunluğu (105 hücreleri/cm2x 1-1.5) adlı tek hücreler olarak yeniden seçilir. 1 h içinde hücreleri plakasına eklenir ve çıkıntı göstermeye başlar. 1 günde hücreleri hızla ve de yüzey alanı yüzde 80-90'ını kapsayacak şekilde dağıtılmış. Sahne 1B sırasında ortam nedeniyle ölü hücreleri bulutlu görünür. Ölü hücreleri kaldırılması için yüksek verimli farklılaşma kritik olduğu için hayatta kalma ve farklılaşma hücre altında yatan ölü hücreleri muhtemelen rahatsız. Gün 3-4, Arnavut kaldırımı görünüm tarif edilebilir bir homojen monolayer sayfası hücreleri oluşturur. Bu noktada, en hücreleri bölgesi Y-kutusu 2 (SOX2), farklılaşmamış hücreleri, avans belirleme seks ifade durdurmak ve bunun yerine daha--dan %90 (şekil 2A ve B) SOX17, kesin endoderm marker ifade eder. Çoğu SOX17+ hücreleri hızlı FOXA2 (şekil 2A). Farklılaşma (şekil 3). bu adım farklılaşma verimlilikle bir uygunsuz hücre yoğunluğu uzlaşma ile başlayan. Etap 2 ve 3, hücre ölümü rahatlatır ve kullanılan orta olarak sahne 1B adımında bulutlu değil. Hücreleri ifade ilkel gut tüp işaretleri HNF1β ve HNF4α (şekil 2C) ve sonunda bir posterior foregut/pankreas progenitör marker, PDX1, daha--dan %90 (şekil 2B ve E) hızlı. PDX1+ hücre indüksiyon hiPSC bir tane, 1231A3 31ve hESC çizgisi, KhES-3 32 (şekil 4) tekrarlanabilir. sahne işaretlerinin mRNA ifadenin sonuçlarını qRT-PCR immunostaining (şekil 5A) ile tutarlı edildi. PDX1 mRNA ifade sahne 3'te belirgindir ve afterword önemli ölçüde artırır.
PDX1+ hücreleri erken gelişim aşamalarında, ama aynı zamanda mide test, oniki parmak bağırsağı, extrahepatic safra kanalını ve bağırsak 9bir parçası sadece pankreas hücrelerine ayırt etmek için potansiyeli var. Farklılaşma potansiyeli tüp bebek PDX1 üretilen+ hücrelere pankreas hücreleri pankreas endoderm için bildirilen iletişim kuralları ile genişletilmiş kültür tarafından değerlendirildi ve pankreatik endokrin hücreleri3,16, 26. pankreas endoderm marker, NKX6.1ve iki pankreatik endokrin işaretleri, İNSÜLİNve GLUKAGON, ifadeleri gün 19 (Stage 4) ve 31 (sahne 5), sırasıyla gözlendi (şekil 5).
Şekil 1: kademeli farklılaşma altında hücrelerinin temsilcisi görünümü. (A) A düzeni pankreas soy için hPSCs üzerinden yönlendirilmiş farklılaşma. Ayraç (birimleri aşağıda yazılır) konsantrasyonları gösterir. HiPSCs farklılaşma kültürünün önemli adımlar, (B) temsilcisi parlak alan filmler. 585A1 hiPSCs tek hücreler olarak ayrışmış ve kesin endoderm, ilkel gut tüp ve posterior foregut/pankreas progenitör ayırt etmek için indüklenen. Alt panelleri üst panelleri genişlemiş görünümleridir. RPMI, RPMI 1640; AA, aktivin bir (ng/mL); CH, CHIR99021 (MİKRON); KGF (ng/mL); NOG, kafa (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (mikron); TTNPB, 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic asit (nM). Ölçek çubukları 300 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: pankreas soy hiPSCs üzerinden doğru temsilcisi indüksiyon. (A) SOX2 oranı-SOX17+ hücreleri tarafından incelendi Akış Sitometresi farklılaşma (sahne 0) önce ve günde 4 (sahne 1B). HiPSCs farklılaşmamış (SOX2+SOX17-) kesin endoderm ayrıştırılan (SOX2-SOX17+). Çoğu SOX17+ hücreleri ortak ifade FOXA2. (B) temsilcisi immünfloresan Filmler günde 4 (sahne 1B). Sabit hücre SOX17 (yeşil), SOX2 (kırmızı) ve çekirdek (mavi) için lekeli. (C) temsilcisi immünfloresan Filmler günlerde 4 (sahne 1B) ve 8 (Aşama 2). Sabit hücre HNF1β (yeşil), HNF4α (kırmızı) ve çekirdekler için (mavi) lekeli. (D) hücreleri tarafından Akış Sitometresi gün 4 (sahne 1B) ve 11 (Stage 3) analiz gibi PDX1 için pozitif oranı. (E) PDX1 (yeşil) ve çekirdek (mavi) gün 11 (Stage 3) temsilcisi immünfloresan filmler. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: kesin endoderm farklı hücre yoğunluğu başlatılan doğru temsilcisi indüksiyon. (A)temsilcisi parlak alan filmler hücre farklılaşması sonra 1 h. hiPSCs tek hücreler olarak ayrışmış ve farklı hücre yoğunluğu (x 104/cm21-50), kesin endoderm içine ayırt etmek için indüklenen. Alt panelleri üst panelleri genişlemiş görünümleridir. (B) SOX2 oranı-SOX17+ hücreleri tarafından incelendi Akış Sitometresi farklılaşma (sahne 0) önce ve günde 4 (sahne 1B). (C) PDX1 oranı+ gün 8 (Aşama 2) ve 11 (Stage 3) Akış Sitometresi tarafından analiz hücreleri. Ölçek çubukları 300 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Temsilcisi indüksiyon PDX1 doğru+ hücreleri hiPCSs ve hESCs. Bir hiPSC satır, 1231A3(a)ve KhES-3 (B), bir hESC hatta farklı kesin endoderm ve PDX1+ hücreleri. Hücre kompozisyon Akış Sitometresi tarafından analiz edildi. SOX2 oranı-SOX17+ hücre farklılaşma (sahne 0) önce ve günde 4 (sahne 1B) analiz. PDX1 oranı+ hücreleri gün 8 (Aşama 2) ve 11 (Stage 3) analiz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: pankreas endoderm ve endokrin hücreleri doğru temsilcisi indüksiyon. hiPSCs (585A1) PDX1 ayırt+ hücreleri. Hücreleri daha fazla içine pankreas endoderm ve endokrin pankreas hücreleri ile bildirilen protokolleri3,16,26farklı. (A)mRNA ifadeler sahne işaretlerinin nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) tarafından ölçülen. Veri GAPDH ifade için normalleştirilmiş ve kat-değişiklik gen ifadesinin en yüksek değerine göre olarak sundu. PDX1 ifadesi, yükseltilmiştir Not > 20-fold gün 8 (Aşama 2) 11 (Stage 3) ve, > 100-fold gün 11 (Stage 3) 19 (Stage 4). Yetişkin insan pankreas ifadede Panc gösterilir. SOX2, siyah; SOX17, mor; HNF1β, kahverengi; HNF4α, turuncu; PDX1, açık yeşil; NKX6.1, yeşil; İNSÜLİN, mavi; GLUKAGON, kırmızı. (B) bir pankreas endoderm marker, NKX6.1 (kırmızı), 11 (Stage 3) ve 19 (Stage 4) günlerinde temsilcisi immünfloresan filmler. PDX1 (yeşil) ve çekirdek (mavi) Co lekeli. (C) temsilcisi immünfloresan Filmler iki pankreatik endokrin üreticileri, (Ins, yeşil) insülin ve glukagon (GCG, kırmızı), gün 19 (Stage 4) ve 31 (sahne 5). Çekirdek (mavi) Co lekeli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Gen adı | Gene sembolü | İleri astar | Ters astar |
| gliseraldehit-3-phospha te dehidrogenaz |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| SRY-kutusu 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| SRY-box 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| HNF1 homeobox B | HNF1β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| Hepatosit nükleer faktör 4 alfa | HNF4α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| pankreas ve duodenal homeobox 1 | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| NK6 homeobox 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| glukagon | GCG | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| insülin | INS | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
Tablo 1: Astar qPCR için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PDX1 üretimi+ hücreleri oluşur birden çok adımı; Bu nedenle, uygun bir zamanda hücreleri tedavi için önemlidir. Adımları arasında kesin endoderm indüksiyon verimliliğini büyük ölçüde son indüksiyon verimliliği etkiler, muhtemelen çoğalırlar salgılar ve/veya diğer bulaşıcı lineage (yani, mesoderm ve hücrelerindeki ektoderm), girişim tarafından faktörler belirli farklılaşma bozabilir. Eğer SOX17 oranı+ hücreleri %80 düşük günde 4 (sahne 1B), PDX1 için verimli bir indüksiyon+ hücreleri tehlikeye olasılığı.
HPSCs farklılaşmamış Birleşik koloniler veya sıkıştırılmış hücresi korunur. Ancak, farklılaşma koloniler veya toplamları başlatma yöntemleri heterojenite, farklı hücre adezyon ve koloni, yoğunluk nedeniyle böyle Merkezi ve çevre22gibi ve hücreler farklı aşamalarında olduğundan sorunlara neden olabilmektedir Hücre döngüsü25. Öte yandan, bizim yöntem tek hücre veya hücre yoğunluğu her tek hücrede hücre adezyon nispeten homojen bir devlet sağlayan Disosiye tek hücreleri ile başlar. Her hücre için homojen işleme açısından bizim yöntemleri koloni veya toplama kültürleri ile başlayan diğerlerinden daha kolay olabilir.
Bizim Protokolü PDX1 ikna etmek için kullanılabilir, ancak birden çok hPSC satırlarından+ hücre farklılaşması hala verimsiz olabilir. Bu gibi durumlarda hemen sonra hPSC satırları arasında tohum yapışma durumu farklılıklar neden olabilir ve tohum yoğunluğu modifikasyonu bir çözüm33olabilir. Nitekim, o uygunsuz tohumlama hücre yoğunluğu tavizler farklılaşma kesin endoderm ve PDX1 şekil 3 gösterir+ hücreleri. İlginçtir, PDX1 için en uygun hücre yoğunluğu+ hücre indüksiyon elde hücre popülasyonlarının arasında farklı > % 90 kesin endoderm. Başka bir olasılık için verimsiz farklılaşma pluripotency farklılaşmamış devlet için işaretleri ifade rağmen kalitesini ödün vermez farklılaşmamış hPSCs kötü bakım durumdur. Bu durumda, hPSC genişleme kültür erken geçiş hisse senetleri donmuş olduğunu veya alt klonlama hPSCs uygun koşullarda elde etmek için yapılmalıdır. Gün 8 (Aşama 2) ya da 11 (Stage 3) verimsiz farklılaşma söz konusu olduğunda aşağıdaki adımları süresi optimize edilmelidir. Bu fikri destekleyen, Stage 3 süresi daha sonraki aşamada hücre özelliklerini edinme için kritik gösterildiği ve hücre satırı-bağımlı pankreas lineage34.
PDX1 üretimi+ hücreleri pankreas hücreleri tüp üretimi için önemlidir. PDX1 pankreas geliştirme apancreatic35Pdx1 null fareler bilgisinden temel işlevsel olarak gereklidir. Sürekli olarak, tüp bebek ve içinde vivo implantasyon çalışmalar gösterdi hPSC elde edilen PDX1+ hücrelerin ekzokrin pankreas bileşenlerinin, geliştirmek için potansiyel ve endokrin pankreas β3,16 hücreleri gibi hücreler , 36 , 37. PDX1 böylece, verimli nesil+ hücreleri hPSCs yol bir istikrarlı pankreas hücresi sağlamak için β hücre tedavisi diyabet karşı kurulması ve insan pankreas geliştirme ve pankreas hastalıkları anlayışı.
Bu yöntem sınırlamaları bazı hücre tipleri ve hücre işlenmesi için uygun değildir iki boyutlu (2D) monolayer kültür biçimi ile ilgili. Son yıllarda, üç boyutlu (3D) kültür üretimi olgun hücre ve dokuların içinde vivo microenvironment taklit eden yüzünden, tanıtmak için gösterilmiştir. Örneğin, 3D kültürlerde β hücrelerinin oluşturulan ancak değil 2D monolayer kültürler ekstraselüler glikoz düzeyleri38yanıt olarak insülin salgılar yeteneği elde.
+ Hücreleri gelişimsel olarak daha sonra hücre tipleri, üretimi için PDX1 kullanmak için bir hücre dışı matriks içinde gömülü toplamları kültürleri süspansiyon gibi 3D kültürler kaymak önemlidir ve bir hava-sıvı üzerinde toplama kültürler arabirim3 , 16 , 37. buna ek olarak, 2D monolayer kültürler ölçeklenebilirliğini sınırlayan süspansiyon kültürleri kültür için daha fazla yüzey alanı gerektirir. Hücreleri ticari kullanım için büyük miktarda işlem lastikteki kullanmak gibi değişiklikler gerektirir. Aynı zamanda, mevcut yöntem farklılaşma indükleyici faktörler ile taranması ve moleküler mekanizmaları gen transferi tarafından keşfi için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser kısmen Japonya toplumdan için promosyon, bilim (JSP'ler) Scientific Research (C) (JSP'ler KAKENHI Grant Number15K09385 ve 18 K 08510) aracılığıyla T.T. ve Grant-in-Aid JSP'ler araştırma Fellows (JSP'ler KAKENHI Grant numarası için finansman tarafından desteklenen 17J07622) A.K. ve tıbbi araştırma ve geliştirme (AMED) kendi araştırma yoluyla Japonya ajansı "IP'leri hücre araştırma, Araştırma Merkezi ağ rejeneratif tıp gerçekleşmesi için çekirdek Merkezi" K.O. için vermek Yazarlar Dr Peter Karagiannis yazı okumak için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
