Chronische Wunden werden aus akuten Wunden auf einem diabetischen Mausmodell entwickelt, indem sie nach einer schweren Kutanwunde einen hohen Grad an oxidativem Stress induzieren. Die Wunde wird mit Inhibitoren für Katathase und Glutathionperoxidase behandelt, was zu einer beeinträchtigungen Heilung und Biofilmentwicklung durch Bakterien im Hautmikrobiom führt.
Chronische Wunden entwickeln sich als Folge einer fehlerhaften Regulation in einem oder mehreren komplexen zellulären und molekularen Prozessen, die an der richtigen Heilung beteiligt sind. Sie wirken sich auf 6,5 Millionen US-Dollar aus und kosten allein in den USA 40 Milliarden US-Dollar pro Jahr. Obwohl erhebliche Anstrengungen unternommen wurden, um zu verstehen, wie sich chronische Wunden beim Menschen entwickeln, bleiben grundlegende Fragen unbeantwortet. Kürzlich haben wir ein neuartiges Mausmodell für diabetische chronische Wunden entwickelt, die viele Merkmale menschlicher chronischer Wunden aufweisen. Mit db/db-/- Mäusen können wir chronische Wunden erzeugen, indem wir unmittelbar nach der Wundwunde hohe Konzentrationen von oxidativem Stress (OS) im Wundgewebe induzieren, wobei eine einmalige Behandlung mit Inhibitoren speziell für die antioxidativen Enzyme Catalase und Glutathionperoxidase. Diese Wunden haben ein hohes OS-Niveau, entwickeln Biofilm natürlich, werden innerhalb von 20 Tagen nach der Behandlung vollständig chronisch und können mehr als 60 Tage offen bleiben. Dieses neuartige Modell hat viele Merkmale diabetischer chronischer Wunden beim Menschen und kann daher wesentlich dazu beitragen, das grundlegende Verständnis davon zu fördern, wie Wunden chronisch werden. Dies ist ein großer Durchbruch, weil chronische Wunden beim Menschen erhebliche Schmerzen und Leiden für Patienten verursachen und zu einer Amputation führen, wenn sie ungelöst sind. Darüber hinaus sind diese Wunden sehr teuer und zeitaufwändig zu behandeln und führen zu erheblichen Einkommensverlusten für die Patienten. Fortschritte in diesem Studienbereich durch die Verwendung unseres chronischen Wundmodells können die Gesundheitsversorgung von Millionen von Menschen, die unter diesem schwächenden Zustand leiden, erheblich verbessern. In diesem Protokoll beschreiben wir ausführlich das Verfahren, um akute Wunden chronisch zu werden, was bisher nicht geschehen ist.
Die Wundheilung umfasst komplexe zelluläre und molekulare Prozesse, die zeitlich und räumlich reguliert sind, in sequenziellen und überlappenden Stadien organisiert sind, die viele verschiedene Zelltypen umfassen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Immunantwort und die Gefäße. System1. Unmittelbar nachdem die Haut eine Verletzung erlitten hat, aggregieren sich Faktoren und Blutzellen zur Wundstelle und initiieren die Gerinnungskaskade zu einem Gerinnsel. Nachdem die Homöostase erreicht ist, glaudern die Blutgefäße, um Sauerstoff, Nährstoffe, Enzyme, Antikörper und chemotaktische Faktoren, die Polymorphonukleozyten zur Räumung des Wundbettes von fremdem Schutt reinigen und proteolytische Enzyme absondern, in die Wundstelle zu lassen. 2. Aktivierte Blutplättchen sezernieren eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren, um die Keratinozyten an der Wundkante zu stimulieren, um den verwundeten Bereich neu zu epithelisieren. Monozyten, die an der Wundstelle rekrutiert werden, differenzieren sich in Makrophagen, die Phagozytosebakterien und tote Neutrophile phagozytosieren und zusätzliche Faktoren absondern, um keratinozyte proliferative und pro-wandernde Signale aufrechtzuerhalten. In der Proliferationsphase, während die Reepithelisierung anhält, setzt neues Granulationsgewebe, bestehend aus Fibroblasten, Monozyten/Makrophagen, Lymphozyten und Endothelzellen, den Wiederaufbauprozess fort2. Die Angiogenese wird durch die Förderung der Endothelzellproliferation und -migration stimuliert, was zu einer neuen Gefäßentwicklung führt. Die Epithelisierung und Remodellierung der extrazellulären Matrix konstruieren eine Barriere gegen die Umwelt. Wenn sich die Wunde heilt und sich granulationsgewebe zu einer Narbe entwickelt, eliminiert Apoptose entzündliche Zellen, Fibroblasten und Endothelzellen, ohne zusätzliche Gewebeschäden zu verursachen. Die Zugfestigkeit des Gewebes wird durch Fibroblasten verstärkt, die verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix wie Kollagen umbauen, so dass das neu gebildete Gewebe fast so stark und flexibel ist wie die unverwundete Haut2.
Jede Abweichung von dieser stark abgestimmten Progression hin zum Wundverschluss führt zu beeinträchtigten und/oder chronischen Wunden3. Chronische Wunden sind gekennzeichnet durch erhöhten oxidativen Stress, chronische Entzündung, beschädigte Mikrovaskulatur und abnorme Kollagenmatrix in der Wunde4. Oxidativer Stress, insbesondere in derWunde, kann den Wundverschluss 2,5verzögern. Wenn in der ersten Phase der Wundheilung die Entzündliche Phase unreguliert wird, geht das Wirtsgewebe aufgrund eines kontinuierlichen Zustroms von Entzündlichen Zellen5, die zytotoxische Enzyme freisetzen, einer Zunahme freier Sauerstoffradikale und unregulierte Entzündungsmediatoren, die zum Zelltod6,7führen.
In dieser zerstörerischen Mikroumgebung nutzen biofilmbildende Bakterien wirtsnährstoffe und tragen zur Schädigung des Wirtsgewebesbei 2. Diese Biofilme sind schwer zu kontrollieren und zu entfernen, da die hydratisierten extrazellulären polymeren Substanzen, die aus Proteinen, DNA, RNA und Polysacchariden bestehen, es Bakterien, die im Inneren leben, ermöglichen, gegenüber konventionellen Antibiotikatherapien tolerant zu sein und sich der angeborene und adaptive Immunantwort des Wirts2,8,9.
Das Studium chronischer Wunden ist von entscheidender Bedeutung, da sie 6,5 Millionen Us-Dollar betreffen und allein in den USA 40 Milliarden DOLLAR pro Jahr kosten10. Patienten mit Diabetes haben ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung chronischer Wunden, die einer Amputation bedürfen, um die Ausbreitung der Infektion einzudämmen. Diese Patienten haben ein Sterblichkeitsrisiko von 50 % innerhalb von 5 Jahren nach der Amputation, das dem Pathophysiologiemechanismus von Diabetes11zugeschrieben wird. Die Beziehung zwischen dem Immunsystem des Wirts und dem Mikrobiom in der Wundheilung ist ein wichtiges Thema der laufenden Forschung, da die Folgen chronischer Wunden, wenn ungelöst, Amputation und Tod12umfassen.
Obwohl erhebliche Anstrengungen unternommen wurden, um zu verstehen, wie sich chronische Wunden beim Menschen entwickeln, ist es immer noch unklar, wie und warum sich chronische Wunden bilden. Experimente zur Untersuchung der Mechanismen der beeinträchtigungen Heilung sind beim Menschen schwierig durchzuführen, und Wundheilungsspezialisten sehen nur Patienten mit chronischen Wunden, die bereits seit Wochen bis Monaten die Chronik erreicht haben. So sind Spezialisten nicht in der Lage zu untersuchen, welche Prozesse schief gelaufen sind, die die Wunde zu entwickeln, um chronisch zu werden2. Es fehlt an Tiermodellen, die die Komplexität menschlicher chronischer Wunden rekapitulieren. Bis zur Entwicklung unseres Modells gab es kein Modell für chronische Wundstudien.
Das chronische Wundmodell wurde bei Mäusen entwickelt, die eine Mutation im Leptinrezeptor haben (db/db-/-) 13. Diese Mäuse sind fettleibig, diabetisch, und haben beeinträchtigte Heilung, aber entwickeln keine chronischen Wunden14. Der Blutzuckerspiegel liegt im Durchschnitt bei 200 mg/dL, kann aber bis zu 400 mg/dL15betragen. Wenn ein hoher oxidativer Stress (OS) im Wundgewebe unmittelbar nach der Wundverwundung induziert wird, wird die Wunde chronisch16. Die db/db-/- Wunden gelten von 20 Tagen als chronisch und bleiben 60 Tage oder mehr geöffnet. Biofilm, der von Bakterien produziert wird, entwickelt sich ab drei Tagen nach der Verwundung; ein ausgereifter Biofilm ist 20 Tage nach der Verwundung zu sehen und besteht bis zum Wundenverschluss. Die biofilmbildenden Bakterien, die wir in diesen Mäusen finden, finden sich auch in menschlichen diabetischen chronischen Wunden.
Oxidativer Stress wird induziert, indem die Wunden mit zwei Inhibitoren antioxidativer Enzyme, Kataalase und Glutathionperoxidase, zwei Enzymen mit der Fähigkeit, Wasserstoffperoxid abzubauen, behandelt werden. Wasserstoffperoxid ist eine reaktive Sauerstoffspezies und kann durch die Oxidation von Proteinen, Lipiden und DNA zelluläre Schäden verursachen. Kataase katalysiert die Zersetzung von Wasserstoffperoxid in weniger schädliche Chemikalien Sauerstoff und Wasser. 3-Amino-1,2,4-Triazol (ATZ) hemmt die Kataalase durch spezifische und kovalente Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms und inaktiviert es17,18,19. ATZ wurde verwendet, um die Auswirkungen von oxidativem Stress sowohl in vitro als auch in vivo durch die Hemmung der Kataalase20,21,22,23,24zu untersuchen. Glutathionperoxidase katalysiert die Reduktion von Wasserstoffperoxid durch das Antioxidans Glutathion und ist ein wichtiges Enzym, das die Zelle vor oxidativem Stress schützt25. Mercaptosuccinsäure (MSA) hemmt Glutathionperoxidase durch Bindung an die Selenocystein-aktive Stelle des Enzyms mit Thiol, inaktiviert es26. MSA wurde verwendet, um die Auswirkungen von oxidativem Stress in vitro und in vivo sowie20,27,28zu untersuchen.
Dieses neuartige Modell chronischer Wunden ist ein mächtiges Modell zu studieren, weil es viele der gleichen Merkmale in menschlichen diabetischen chronischen Wunden beobachtet teilt, einschließlich längerer Entzündung entzeln von erhöhten OS und natürliche Biofilmbildung aus Hautmikrobiom. Die Wunden haben eine beeinträchtigte dermal-epidermale Wechselwirkung, abnormale Matrixablagerung, schlechte Angiogenese und beschädigte Vaskulatur. Chronische Wunden entwickeln sich sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen, so dass beide Geschlechter verwendet werden können, um chronische Wunden zu untersuchen. Daher kann das chronische Wundmodell wesentlich dazu beitragen, das grundlegende Verständnis dessen, wie solche Wunden beginnen, zu fördern. Mit diesem chronischen Wundmodell können Antworten auf grundlegende Fragen darüber gegeben werden, wie Die Chronik durch Beiträge aus der Physiologie der beeinträchtigten Wundheilung und dem Mikrobiom des Wirts initiiert/erreicht wird.
Sobald chronische Wunden an den Mäusen entstehen, kann das Modell verwendet werden, um beeinträchtigte Wundheilungsprozesse zu untersuchen, die an der Initiierung der Chronik beteiligt sind. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit einer breiten Palette von Chemikalien und Medikamenten zu testen, die chronische Wundentwicklung und beeinträchtigungsende Heilung umkehren und zu Wundverschluss und Heilung führen können. Es können verschiedene Zeitpunkte nach Beginn der Chronik untersucht werden: z…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
B6.BKS(D)-Leprdb/J | The Jackson Laboratory | 00697 | Homozygotes and heterozygotes available |
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin | Nair | a chemical depilatory | |
Buprenex (buprenorphine HCl) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0.3 mg/ml, Class 3 |
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) | TCI | A0432 | |
Mercaptosuccinic acid (MSA) | Aldrich | 88460 | |
Phosphate buffer solution (PBS) | autoclave steriled | ||
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
Oxygen | Tank must be compatible with vaporizing system | ||
Isoflurane vaporizer | JA Baulch & Associates | ||
Wahl hair clipper | Wahl | Lithium Ion Pro | |
Acu Punch 7mm skin biopsy punches | Acuderm Inc. | P750 | |
Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Transparent film dressing (6 cm x 7 cm) |
Heating pad | Conair | Moist Dry Heating Pad | |
Insulin syringes | BD | 329461 | 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2") |
70% ethanol | |||
Kimwipes | |||
Tweezers | |||
Sharp surgical scissors | |||
Thin metal spatula | |||
Tubing | |||
Mouse nose cone | |||
Gloves | |||
small plastic containers |