इस अध्ययन के एक सत्यापित और अलगाव और मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं की संस्कृति के लिए प्रक्रिया को इन विट्रो decidualization परख में आचरण प्रस्तुत करता है । इसके अलावा, यह अध्ययन कुशलतापूर्वक मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं में siRNAs का उपयोग कर एक विशिष्ट जीन पछाड़ना करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है ।
fibroblast से मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं (HESC) के भेदभाव स्रावी decidua में उपस्थिति की तरह मातृ गर्भ के गर्भाशय अस्तर में भ्रूण आरोपण के लिए आवश्यक परिवर्तन है । अनुचित decidualization आरोपण विफलता और बाद में जल्दी भ्रूण गर्भपात के लिए एक मूल कारण के रूप में स्थापित किया गया है । इसलिए, decidualization अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझना सफल जन्मों की दर में सुधार करने के लिए लाभप्रद है । vivo आधारित अध्ययनों में कृत्रिम decidualization के अक्सर मानव अनुसंधान के साथ जुड़े नैतिक दुविधाओं के कारण सीमित कर रहे हैं, साथ ही पशु मॉडलों के भीतर अनुवाद जटिलताओं. एक परिणाम के रूप में , इन विट्रो परख प्राथमिक सेल संस्कृति के माध्यम से अक्सर हार्मोन के माध्यम से decidualization के मॉडुलन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । यह अध्ययन HESC के अलगाव और बाद में कृत्रिम decidualization हार्मोन की पूरकता के माध्यम से संवर्धन माध्यम के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है । इसके अलावा, यह अध्ययन लिपिड आधारित सिरना transfections का उपयोग करके ब्याज की किसी भी जीन पछाड़ना करने के लिए एक अच्छी तरह से डिजाइन विधि प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल संस्कृति पवित्रता के अनुकूलन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उत्पाद उपज परमिट, जिससे एक विश्वसनीय विधि के रूप में इस मॉडल का उपयोग करने आणविक decidualization अंतर्निहित तंत्र को समझने की क्षमता अधिकतम, और बाद के ठहराव decidualized एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं द्वारा गुप्त एजेंटों ।
मिनार्चे और रजोनिवृत्ति के चरणों के बीच, प्रजनन आयु की महिलाओं को मासिक धर्म के रूप में जाना जाता है एक प्रक्रिया में गर्भावस्था के लिए तैयारी में हार्मोन विनियमित एंडोमेट्रियल प्रसार, भेदभाव, और बाद में बहा से गुजरना ,2. मानव अंतर्गर्भाशयकला के इस तरह के भौतिक संशोधन गर्भाशय की दीवार1में उचित भ्रूण आरोपण के लिए आवश्यक हैं । अंतर्गर्भाशयकला के परिवर्तन, दोनों रूपात्मक और जैव रासायनिक रूपांतरों सहित, डिम्बग्रंथि स्टेरॉयड हार्मोन एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन (पी 4)3,4,5के माध्यम से मासिक धर्म चक्र भर में मध्यस्थता कर रहे हैं. प्रफलन (या तोंसिल्लितिस) चरण के भीतर, preovulatory एस्ट्रोजन का स्तर बढ़ाने के लिए, अंतर्गर्भाशयकला और अधिक मोटा होना आरंभ । निम्नलिखित ovulation, स्रावी (या लुटियल) चरण पी 4 सांद्रता में एक महत्वपूर्ण वृद्धि को बढ़ावा देता है, एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन उत्प्रेरण (ESC) से fibroblast की तरह उपस्थिति गोल करने के लिए, उपकला की तरह decidual कोशिकाओं decidualization4,6के रूप में जाना एक प्रक्रिया में । अनुचित decidualization आरोपण विफलता और बाद में जल्दी भ्रूण गर्भपात4,7,8के लिए एक मूल कारण के रूप में स्थापित किया गया है । इसलिए, आणविक decidualization अंतर्निहित तंत्र को समझने के निदान और जल्दी गर्भावस्था के नुकसान के उपचार के लिए लाभप्रद है ।
वर्तमान में, कई तरीकों एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं पर decidualization के अंतर्निहित प्रभावों का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । vivo में, माउस गर्भाशय कृत्रिम रूप से यांत्रिक उत्तेजना के माध्यम से decidualization के लिए प्रेरित किया जा सकता है (यानी,, scratching) या एक हार्मोनल में एक प्रधान गर्भाशय में तेल इंजेक्शन9. मनुष्यों से अलग, इस सिंथेटिक उत्तेजना ब्लास्टोसिस्ट उपस्थिति, एक कदम है कि कुतर10,11में decidualization की दीक्षा के लिए आवश्यक है की उपस्थिति प्रदान करके गर्भाशय लुमेन के भेदभाव को बढ़ावा देता है । तदनुसार, अनुवाद के कारण पशु मॉडल के साथ जुड़े जटिलताओं और मानव में vivo आधारित अध्ययन में आसपास के नैतिक दुविधाओं, decidualization आधारित मॉडल सबसे सफलतापूर्वक इन विट्रो में अध्ययन कर रहे हैं ।
इस अध्ययन में, विषयों दोनों स्थानीय अंग्रेजी और स्पेनिश अखबारों में विज्ञापनों के स्थान के माध्यम से भर्ती कर रहे हैं । इस अध्ययन के लिए उपयुक्त उंमीदवारों के रूप में पहचाने गए विषयों को अनुसंधान समंवयक के साथ मिलने के लिए लाया जाता है, जिसमें संभावित जोखिमों का पूर्ण प्रकटीकरण चर्चा में होता है । संभावित जोखिम शामिल की एक पूरी समझ की पुष्टि पर, विषयों की सहमति दोनों लिखित और मौखिक रूपों में प्राप्त होता है । विषय सहमति के लिए अनुमति शामिल है (1) phlebotomy से गुजरना (2) भावी अनुसंधान प्रयोजनों के लिए अपने ऊतकों की लंबी अवधि के भंडारण और (3) एकत्र ऊतक नमूनों से प्राथमिक संस्कृतियों के निर्माण के लिए सहमत हैं । सहमति के बाद, विषयों को पूरा करने के लिए एक फार्म दिया जाता है जिसमें स्वयं की अनुमति की दौड़ की पहचान/जातीयता और/ एक बाद की यात्रा के लिए अंतर्गर्भाशयकला है विषय मासिक धर्म चक्र के आधार पर बायोप्सी प्राप्त करने के लिए निर्धारित है । स्वयंसेवकों इस अध्ययन के लिए भर्ती दोनों जातीय और नस्लीय जनसांख्यिकी के रूप में अनुसूचित जनजाति लुई महानगरीय क्षेत्र के २०१२ जनगणना द्वारा प्रलेखित और गर्भवती महिलाओं, भ्रूण, भ्रूण सहित किसी भी कमजोर आबादी की भागीदारी को शामिल नहीं किया है, 18 वर्ष से कम आयु के बच्चे, या अंय संवेदनशील समूह । बायोप्सी नमूना संग्रह में भाग लेने के लिए पात्रता आवश्यकताओं में शामिल हैं (1) 18-45 वर्ष की आयु के बीच किया जा रहा (2) नियमित माहवारी चक्र होने (25-32 दिन) (3) कोई वर्तमान गर्भावस्था या हार्मोनल/अंतर्गर्भाशयी डिवाइस गर्भ निरोधक का उपयोग कर 30 दिनों के लिए नामांकन से पहले (4) कोई वर्तमान योनि संक्रमण या यौन संचारित रोगों (5) कोई वर्तमान एंटीबायोटिक उपचार होने, और (6) कोई वर्तमान असामांय पीएपी धब्बा होने ।
इस अध्ययन के भीतर, मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं (HESC) और संस्कृति और कृत्रिम रूप से हार्मोन की पूरकता के माध्यम से decidualization इन विट्रो में से गुजरना करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं (एस्ट्राडियोल (E2), medroxyprogesterone एसीटेट (MPA), और चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (cAMP)) को यम से । इस विधि में, decidualization की डिग्री हार्मोनल उपचार के दिनों की कुल संख्या के आधार पर बदल दिया है । cytoskeletal पुनर्व्यवस्था के साथ संयोजन के रूप में, हार्मोन अनुपूरण जैव रासायनिक रूपांतरों जो decidual कोशिकाओं स्रावी तरह के गुणों का अनुभव2,4लाती है । पहचान जीन की अभिव्यक्ति, जैसे प्रोलैक्टिन (PRL) और इंसुलिन जैसे विकास कारक बंधन प्रोटीन 1 (IGFBP1), की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जा सकता है और HESC decidualization5,12की डिग्री यों तो 13 , 14. महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता जीन विशिष्ट पछाड़ना आचरण भी प्रदर्शन किया है ।
मादा प्रजनन मासिक धर्म चक्र लुटियल चरण भर में प्रोजेस्टेरोन के स्तर में वृद्धि की विशेषता है, जिससे दौर में ESC के decidualization उत्प्रेरण, उपकला की तरह स्रावी कोशिकाओं3,8. decidualization की दीक्षा प्…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
10 mL Syringe | BD | 302995 | |
1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |