Summary

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

Published: September 01, 2018
doi:

Summary

Bu çalışmada yalıtım ve kültür vitro decidualization tahlil yapmak için insan endometrium stromal hücre için doğrulanmış ve en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunar. Ayrıca, bu çalışmada çift insan endometrium stromal hücreler kullanarak belirli bir gen için verimli bir şekilde devirme detaylı bir yöntem sağlar.

Abstract

İnsan endometrium stromal hücrelerden (HESC) fibroblast benzeri görünüm salgı decidua içine farklılaşma anne rahim rahim astarı içine embriyo implantasyonu için gerekli bir dönüşümdür. Yanlış decidualization implantasyon başarısızlığı ve sonraki erken embriyo düşük için kök neden olarak kurulmuştur. Bu nedenle, decidualization temel moleküler mekanizmaları anlama başarılı Doğum oranı artırmak için avantajlıdır. Yapay decidualization dayalı in vivo çalışmalar kez etik ikilemler içinde hayvan modelleri translasyonel komplikasyonlar yanı sıra insan araştırma ile ilişkili nedeniyle sınırlı hale gelir. Sonuç olarak, vitro deneyleri birincil hücre kültürü aracılığıyla sık sık decidualization modülasyon hormonlar keşfetmek için kullanılmaktadır. Bu çalışmada HESC yalıtım ve sonraki yapay decidualization kodlamayla orta hormonların takviyesi ile detaylı bir protokol sağlar. Daha fazla, bu çalışmada nakavt iyi tasarlanmış bir yönteme herhangi bir gen ilgi lipid tabanlı siRNA transfections kullanarak sağlar. Bu iletişim kuralı kültür saflık yanı sıra ürün verim, böylece bu modeli moleküler mekanizmalar decidualization ve bir sonraki miktar temel anlamak için güvenilir bir yöntem kullanma özelliğini maksimize optimizasyonu izin verir. decidualized rahim stromal hücreler tarafından salgılanan ajanlar.

Introduction

Marche aşamaları ve menopoz arasında üreme çağındaki kadınların rahim yayılması hormon düzenlenir, farklılaşma ve sonraki gebelikte adet1 bilinen bir işlem için hazırlık dökülme aylık döngüleri geçmesi ,2. İnsan endometrium tür fiziksel değişiklikler1rahim duvarı içine uygun embriyo implantasyonu için gereklidir. Morfolojik ve biyokimyasal uyarlamaları, dahil olmak üzere endometrium, değişikliklere aracılı yumurtalık steroid hormonlar östrojen ve progesteron (P4) üzerinden adet döngüsü boyunca3,4,5. (Veya) foliküler proliferatif faz içinde endometrium kalınlaşma başlatılıyor artış, preovulatory östrojen düzeyleri. Yumurtlama, salgı (ya da luteal) evre rahim stromal hücre (ESC) morfolojik dönüştürme inducing P4 konsantrasyonlarda önemli bir artış fibroblast benzeri çıkışı yuvarlak hücrelere, epitel benzeri decidual teşvik decidualization4,6bilinen bir işlem içinde. Yanlış decidualization implantasyon başarısızlığı ve sonraki erken embriyo düşük4,7,8için bir kök neden olarak kurulmuştur. Bu nedenle, decidualization temel moleküler mekanizmaları anlama tanı ve tedavisinde erken gebelik kaybı için avantajlıdır.

Şu anda, çeşitli metodolojiler endometrium stromal hücre decidualization temel etkilerini araştırmak için kullanılmaktadır. Vivo, fare rahim yapay olarak mekanik stimülasyon (tırmalamakYani,) üzerinden decidualization için indüklenen veya yağ enjeksiyonu hormonal astarlanmalıdır rahim9. Farklı insanlar, sentetik Bu uyarımı rahim lümen farklılaşma blastosist varlığı, kemirgenler10,11decidualization başlatılması için gerekli bir adım görünümünü sağlayarak teşvik etmektedir. Buna göre hayvan modelleri ve temel in vivo çalışmalar insanlarda çevreleyen etik ikilemler ile ilgili translasyonel komplikasyonlar nedeniyle decidualization dayalı modelleri en başarılı bir şekilde incelendiği tüp bebek.

Bu çalışmada, konular aracılığıyla yerel hem İngilizce hem de İspanyolca gazete reklam yerleşimini işe. Bu çalışma için uygun adaylar olarak tanımlanan konular potansiyel riskleri tam açıklanması açıklanmıştır araştırma koordinatörü ile karşılamak için toplanırlar. Potansiyel risklerini tam bir anlayış onayı, yazılı ve sözlü formlarda konularda izni elde edilebilir. Konu izni izni (1) geçmesi flebotomi (2) uzun süreli depolama gelecekteki araştırma amacıyla onların dokuların ve kabul (3) birincil kültürler oluşturma için toplanan doku örnekleri içerir. Rıza konular yarış/etnisite ve/veya sağ gizlilik için izin verilen hangi kendi içinde tamamlamak için bir form verilir. Bir sonraki ziyaret ilgilinin adet döngüsü üzerinde dayalı endometrium biyopsi ulaşmak için planlanmıştır. Bu çalışma için işe gönüllü St. Louis metropolitan bölgesi etnik ve ırksal demografisi 2012 sayım tarafından belirtildiği gibi yansıtmak ve hamile kadınlar, fetus, embriyo de dahil olmak üzere herhangi bir savunmasız nüfus katılımı dahil değil, 18 yaş altı yaş veya diğer korunmasız grupların çocuklar. Uygunluk şartları biyopsi örnek koleksiyon katılım için yaş arası 18-45 yıl (2) (3) hiçbir geçerli gebelik veya hormonal/intrauterin aygıt kontraseptif kullanımı sahip normal siklus (25-32 gün) sahip olmak (1) dahil hiçbir geçerli vajinal enfeksiyon veya cinsel yolla bulaşan hastalıklar (5) hiçbir mevcut antibiyotik tedaviler ve (6) sahip sahip için 30 gün önce kayıt (4) hiçbir geçerli anormal Pap smear sahip.

Bu çalışma içinde insan endometrium stromal hücreler (HESC) kültürlü ve vitro decidualization (estradiol (E2), medroxyprogesterone asetat (MPA) ve siklik adenozin hormonların takviyesi üzerinden geçmesi yapay indüklenen monofosfattır (kampı)) orta. Bu yöntemde, decidualization derecesine göre gün hormonal tedavinin toplam sayısı değişir. Hücre iskeleti düzenlenmesi ile birlikte, hormon takviyesi biyokimyasal uyarlamalar decidual hücreler salgı benzeri nitelikleri2,4deneyim neden olmaktadır. Prolaktin (PRL) ve insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein 1 (IGFBP1), gibi hallmark genlerin ifade onaylamak ve HESC decidualization5,12, derecesini ölçmek için kullanılması gereken 13 , 14. önemli, gen belirli nakavt yapmak için bu iletişim kurallarını canlılığı de gösterdi.

Protocol

Bu çalışma için toplanan tüm insan endometrium biyopsi Washington Üniversitesi St. Louis, kadın hastalıkları Bölümü’nden elde ve bir kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) kullanarak kadın hastalıkları yazılı onayı formu onaylı. 1. hazırlık 1 x Hank’in dengeli tuz çözüm (HBSS) 500 mL (HBSS + aracı olarak daha fazla başvurulan) medya içeren şişe 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ekleyerek hazırlayın. Dulbecco’nın modifiye kartal orta 500 …

Representative Results

HESC kültür decidualization Yalıtım, insan endometrium stromal hücreler için monolayer oluşumu ile % 80-90 confluency kültürlü ve vitro decidualization için 10 nM E2, 1 µM MPA ve 50 µM kampı ile tedavisi ile indüklenen (EPC). Vitro decidualization ile ilişkili morfolojik vardiya Şekil 1A’ görüntülenir. Decidualization HESCs uzun, fibroblastic h?…

Discussion

Kadın üreme adet döngüsü progesteron seviyeleri luteal faz boyunca böylece ESC decidualization yuvarlak, epitel benzeri salgı hücreleri3,8inducing bir artış ile karakterizedir. Decidualization inisiyasyon bağımlı türüdür. Fareler blastosist varlığı10,11gerektirir, ancak insanlarda decidualization progesteron konsantrasyon, yükselişi kendiliğinden oluşur. Decidualization bu tutarsız…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar ifşa gerek yok.

Materials

Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium Gibco 31985-070 For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X) Gibco 11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061 For cell count
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183018A For RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control Life Technologies 4319413E For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter Abcam ab176753
Human Prolactin ELISA Kit Invitrogen EHIAPRL
16% Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 Fixative
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778150 Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum Sigma F6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reagent Fisher Scientific 45001749
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetate Sigma M1629-1G For EPC Media
Estradiol Sigma E1024-1G For EPC Media
cAMP Sigma A6885-100MG For EPC Media
Fine straight stitch scissors Fine Science Tools 15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe Applied Biosystems 4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10-082-147
Antibiotic-antimycotic Thermo Scientific 15240062
Hank’s Balanced Salt Solution  Corning 21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352098
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dish VWR 75845-546
40 micron cell strainer Midsci 229481
Isotemp 215 Water bath Fisher Scientific FS-215
LSE Centrifuge  Corning 6755
Human NCOA2 siRNA  Dharmacon L-020159-00 Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator  Thermo Scientific 51030301
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline  Fisher Scientific 50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate Corning 3506
Pipet Controller Ultra Corning 4099
Photoshop Adobe 19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 7200876
Triton X-100 Sigma X100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352099
10 mL Syringe BD 302995
1300 Series A2 Biological Safety Hood Thermo Scientific 1377
accuspin Micro17 centrifuge Fisher Scientific 13100675
7500 Fast real time PCR system Applied Biosystems 3052632
EVOS FL Immunofluorescence Microscope Life Technologies 01414-155G-291
Leica Inverted Light Microscope Leica DMi1
Illrustrator Adobe 22.0.1.253
Excel Spreadsheets Microsoft 2016
Deckglaser 18 mm cover glasses NeuVitro GG-18
Reichert Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629-1EA
2-mercaptoethanol Fisher Bioreagents BP176-100 For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430658 For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D2650-100mL For freezing media

References

  1. Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
  2. Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
  3. Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
  4. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
  5. Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
  6. Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
  7. Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
  8. Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
  9. Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
  10. Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
  11. Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
  12. Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
  13. Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
  14. Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
  15. Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
  16. Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
  17. Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).

Play Video

Cite This Article
Michalski, S. A., Chadchan, S. B., Jungheim, E. S., Kommagani, R. Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization. J. Vis. Exp. (139), e57684, doi:10.3791/57684 (2018).

View Video