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エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

Published: September 01, 2018
doi:

Summary

本稿ではエストロージェンの in vitroアッセイを行うひと子宮内膜間質細胞の分離文化の検証と最適化されたプロシージャ。さらに、この研究では、ひと子宮内膜間質細胞で Sirna を使用して特定の遺伝子の効率的にノックダウンする詳細な方法が提供します。

Abstract

分泌脱落膜に線維芽細胞のような外観からひと子宮内膜間質細胞 (HESC) の分化は、母親の子宮の子宮内に胚移植に必要な変換です。着床障害とそれに続く初期胚流産の根本的な原因として不適切なエストロージェンを設置します。したがって、エストロージェンの分子機構を理解することは成功した出生率向上に有利であります。人工エストロージェンの生体内研究は人間研究として動物モデル内での並進運動合併症に関連付けられている倫理的なジレンマのためしばしば制限しています。その結果、一次電池文化を通しての in vitroアッセイがホルモンを介してエストロージェンの変調を探るにしばしば用いられます。この研究は、悪名高くの分離と培養の培地にホルモンの補充によるその後の人工エストロージェンの詳しいプロトコルを提供します。さらに、この研究は、siRNA の脂質ベースの transfections を利用してノックダウンするうまく設計された方法興味の任意の遺伝子を提供します。このプロトコルにより、文化純度としてエストロージェンとの後の定量化の基礎となる分子機構を理解するための信頼性の高い方法としてこのモデルを活用する能力を最大化する製品の歩留まりの最適化decidualized 子宮内膜間質細胞因子を分泌します。

Introduction

生殖年齢の女性がホルモンによって調節される子宮内膜の増殖・分化・月経1 として知られているプロセスで妊娠の準備のためにその後放出の毎月のサイクルを受ける初潮の段階と月経閉止期の間 ,2。ひと子宮内膜のような物理的な変更が必要1子宮壁に適切な胚移植です。形態学的および生化学的適応を含む子宮内膜の変化は卵巣性ステロイド ホルモンのエストロゲンとプロゲステロン (P4) を介して月経サイクルを通して仲介される3,4,5。増殖 (または卵胞) フェーズの中で排卵エストロゲン レベルが高く、子宮内膜肥厚を開始します。次の排卵、分泌 (または黄体) 相は丸め、上皮のような脱落膜細胞線維芽細胞のような外観から子宮内膜間質細胞 (ESC) の形態学的変化を誘導する P4 濃度の大幅な上昇を促進します。エストロージェン4,6として知られているプロセス。注入の失敗とその後初期流産胚4,7,8根本原因として不適切なエストロージェンを設置します。したがって、エストロージェン分子機構の解明、診断と妊娠初期の損失の治療に有利であります。

現在、子宮内膜間質細胞のエストロージェンの根本的な影響を探検するいくつかの手法が利用されています。生体内で、マウス子宮機械的刺激 (すなわち、, 傷) を介してエストロージェンの人工的に誘導することができますまたは油ホルモン プライミング子宮9で注入。人間とは異なる、この合成の刺激は、胚盤胞の存在、齧歯動物の1011エストロージェンの開始のために必要なステップの外観を提供することで子宮内腔の分化を促進します。したがって、並進合併症の動物モデルと人間の生体内で調査を囲む倫理的なジレンマに関連するのためエストロージェン ベース モデルはほとんどが正常に研究体外

本研究では被験者は両方のローカル英語とスペイン語の新聞広告の配置によって募集しています。この研究に適した候補として識別される科目は、研究コーディネーター、潜在的なリスクの完全な情報開示の説明に会うため持って来られます。潜在的なリスクの完全な理解の確認後、被験者の同意は書面と口頭の両方の形態で得られます。被写体の同意には、(1) 今後の研究目的のための組織の瀉血 (2) 長期的なストレージを受けるし、(3) 収集した組織標本から初代培養の作成に同意する権限が含まれています。同意、次科目は、人種/民族および/または機密保持のための権利を許可された自己で完了するフォームを与えられています。その後の訪問は、サブジェクトの月経周期に基づく子宮内膜生検を達成する予定です。この研究に募ったボランティア 2012年国勢調査によって文書化されたセントルイス都市圏の民族、人種的な人口を反映し、妊娠中の女性、胎児、胚を含む任意の脆弱な人口の参加を伴わない18 歳未満の年齢、または他の弱者の子供。生検サンプル コレクションに参加するための資格要件は、(1) 歳の 18-45 年 (2) (3) を持たない現在の妊娠や避妊薬ホルモン/子宮内のデバイスの使用規則的な月経周期 (25-32 日) を持つが現在膣感染症や性感染症 (5) ない現在の抗生物質治療と (6) を持たない登録 (4) 前 30 日間ないこと現在の異常な Pap 汚れ。

この研究では、ひと子宮内膜間質細胞 (HESC) を培養し、人工的に誘導した体外ホルモン (エストラジ オール (E2)、酢酸メドロキシプロゲステロン (MPA)、および環状アデノシンのサプリメントからエストロージェンを受けることに一リン酸塩 (キャンプ)) 媒体に。このメソッドは、エストロージェンの程度は、ホルモン治療日数の合計数に基づいて変更されます。細胞骨格再配置に伴い、ホルモン補充は脱落膜細胞が分泌のような資質2,4を発生生化学的適応を誘発します。プロラクチン (PRL) とインスリン様成長因子結合蛋白質 1 (IGFBP1) などの認刻極印の遺伝子の表現を活用して、確認、HESC エストロージェン5,12,の程度を定量化すること13,14します。 重要なことは、遺伝子の特定の打撃を行うこのプロトコルの生存性も実証されています。

Protocol

ワシントン大学セントルイス、産科から本研究のために収集するすべてのひと子宮内膜生検が可能し、婦人科制度審査委員会 (IRB) を使用して書面による同意フォームを承認します。 1. 準備 1 x ハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) の 500 mL を準備するには、(さらには HBSS + 媒体として参照される) メディア含むボトルに 100 U/mL ペニシリンおよび 100 μ g…

Representative Results

HESC 文化エストロージェン 次の分離、ひと子宮内膜間質細胞は 80-90% の confluency による単分子膜形成に培養し、体外エストロージェンの 10 nM E2、1 μ M MPA、50 μ M のキャンプと治療による (EPC)。エストロージェン体外に関連付けられている形態学的変化は、図 1 aに, 可視化さ?…

Discussion

女性の月経周期は、それによって分泌細胞が上皮のようにラウンド、38に ESC のエストロージェンを誘導中黄体期のプロゲステロンのレベルの上昇によって特徴付けられます。エストロージェンの開始は、依存する生物です。ヒトでは、エストロージェンは、自発的にプロゲステロン濃度の上昇マウス胚盤胞の存在10,<sup …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者が明らかに何もありません。

Materials

Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium Gibco 31985-070 For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X) Gibco 11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061 For cell count
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183018A For RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control Life Technologies 4319413E For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter Abcam ab176753
Human Prolactin ELISA Kit Invitrogen EHIAPRL
16% Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 Fixative
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778150 Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum Sigma F6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reagent Fisher Scientific 45001749
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetate Sigma M1629-1G For EPC Media
Estradiol Sigma E1024-1G For EPC Media
cAMP Sigma A6885-100MG For EPC Media
Fine straight stitch scissors Fine Science Tools 15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe Applied Biosystems 4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10-082-147
Antibiotic-antimycotic Thermo Scientific 15240062
Hank’s Balanced Salt Solution  Corning 21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352098
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dish VWR 75845-546
40 micron cell strainer Midsci 229481
Isotemp 215 Water bath Fisher Scientific FS-215
LSE Centrifuge  Corning 6755
Human NCOA2 siRNA  Dharmacon L-020159-00 Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator  Thermo Scientific 51030301
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline  Fisher Scientific 50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate Corning 3506
Pipet Controller Ultra Corning 4099
Photoshop Adobe 19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 7200876
Triton X-100 Sigma X100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352099
10 mL Syringe BD 302995
1300 Series A2 Biological Safety Hood Thermo Scientific 1377
accuspin Micro17 centrifuge Fisher Scientific 13100675
7500 Fast real time PCR system Applied Biosystems 3052632
EVOS FL Immunofluorescence Microscope Life Technologies 01414-155G-291
Leica Inverted Light Microscope Leica DMi1
Illrustrator Adobe 22.0.1.253
Excel Spreadsheets Microsoft 2016
Deckglaser 18 mm cover glasses NeuVitro GG-18
Reichert Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629-1EA
2-mercaptoethanol Fisher Bioreagents BP176-100 For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430658 For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D2650-100mL For freezing media

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Cite This Article
Michalski, S. A., Chadchan, S. B., Jungheim, E. S., Kommagani, R. Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization. J. Vis. Exp. (139), e57684, doi:10.3791/57684 (2018).

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