Summary
Este estudo apresenta um processo otimizado e validado para o isolamento e a cultura de células do estroma endometriais humanas para realizar o ensaio de decidualization em vitro . Além disso, este estudo fornece um método detalhado para eficientemente "knockdown" um gene específico usando siRNAs em células do estroma endometriais humanas.
Abstract
A diferenciação das células do estroma endometriais humanas (HESC) da aparência de um fibroblasto em secretora decidua é uma transformação necessária para a implantação do embrião no revestimento do útero do ventre materno. Decidualization impróprio foi estabelecida como das causas para a falha de implantação e subsequente aborto precoce do embrião. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes decidualization é vantajoso melhorar a taxa de nascimentos bem sucedidos. In vivo com base em estudos de decidualization artificial estão limitando muitas vezes devido a dilemas éticos associadas à investigação humana, bem como complicações translacionais em modelos animais. Como resultado, em vitro ensaios através de cultura de células primárias são frequentemente utilizados para explorar a modulação de decidualization através de hormônios. Este estudo fornece um protocolo detalhado para o isolamento de HESC e subsequente decidualization artificial através da suplementação de hormônios para o meio de cultivo. Ainda mais, este estudo fornece um método bem projetado para nocaute qualquer gene de interesse utilizando transfections de siRNA baseadas em lipídios. Este protocolo permite a otimização da pureza da cultura, bem como rendimento de produto, maximizando assim a capacidade de utilizar este modelo como um método confiável para compreender os mecanismos moleculares subjacentes à decidualization e a posterior quantificação dos agentes secretados pelas células do estroma endometriais decidualized.
Introduction
Entre os estágios da menarca e menopausa, as mulheres em idade reprodutiva sofrem ciclos mensais de proliferação endometrial hormônio-regulada, diferenciação e subsequente derramamento em preparação para a gravidez em um processo conhecido como menstruação1 ,2. Tais modificações físicas do endométrio humano são necessárias para a implantação do embrião adequado para a parede uterina1. Alterações do endométrio, incluindo adaptações morfológicas e bioquímicas, são mediadas por todo o ciclo menstrual através de hormônios esteroides ovarianos estrógeno e progesterona (P4)3,4,5. No âmbito da fase proliferativa (ou folicular), os níveis de estrogênio preovulatory aumento, iniciando o espessamento do endométrio. Após a ovulação, a fase secretora (ou lútea) promove um aumento significativo nas concentrações de P4, induzindo a transformação morfológica das células do estroma endometriais (ESC) da aparência de fibroblasto arredondados, células epiteliais-decidual em um processo conhecido como decidualization4,6. Decidualization impróprio foi estabelecida como das causas para o fracasso do implante e posterior início embrião aborto espontâneo de4,de7,8. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes decidualization é vantajoso para o diagnóstico e o tratamento de perda de gravidez precoce.
Atualmente, várias metodologias são utilizadas para explorar os efeitos subjacentes de decidualization em células do estroma endometriais. In vivo, o útero de rato pode ser induzida artificialmente para decidualization através de estimulação mecânica (i.e.,coçar) ou injeção em um útero hormonalmente condicionadas9de óleo. Distintos dos humanos, esta estimulação sintética promove a diferenciação do lúmen uterino, fornecendo a aparência da presença de blastocisto, um passo que é necessário para a iniciação de decidualization em roedores10,11. Nesse sentido, devido as complicações translacionais associadas com modelos animais e os dilemas éticos que cercam na vivo com base em estudos em seres humanos, modelos de decidualization com base são estudados com mais êxito in vitro.
Neste estudo, os sujeitos são recrutados através da colocação de anúncios em dois jornais locais, inglês e espanhol. Indivíduos identificados como candidatos adequados para este estudo são trazidos para se reunir com o coordenador da pesquisa, em que uma divulgação completa dos riscos potenciais são discutidos. Após a confirmação de uma compreensão completa dos riscos potenciais envolvidos, consentimento dos sujeitos é atingido nas formas verbais e escritas. Consentimento do sujeito inclui permissão para (1) submetido a armazenagem (2) a longo prazo de flebotomia de seus tecidos para fins de pesquisa futura e (3) concordar com a criação de culturas primárias de amostras de tecido coletadas. Após consentimento, indivíduos recebem um formulário para preencher no qual auto-identificação permitida de raça/etnia e/ou o direito de não-divulgação. Uma visita subsequente é programada para atingir a biópsia de endométrio com base no ciclo menstrual do sujeito. Voluntários recrutados para este estudo, refletem a demografia étnica e racial da região metropolitana de St. Louis, como documentado pelo censo de 2012 e que não envolvem a participação de qualquer população vulnerável, incluindo mulheres grávidas, fetos, embriões, crianças menores de 18 anos de idade, ou de outros grupos vulneráveis. Requisitos de elegibilidade para participação na coleção de amostra de biópsia incluem (1) estar entre as idades de 18-45 anos (2) ter ciclos menstruais regulares (25-32 dias) (3) não ter nenhuma gravidez atual ou uso de dispositivo intra-uterino hormonal/contraceptivos por 30 dias antes da inscrição (4) sem qualquer infecção vaginal atual ou doenças sexualmente transmissíveis (5) tendo nenhum atuais tratamentos com antibióticos e (6) não tendo nenhum atual de Papanicolau anormais.
Dentro deste estudo, células do estroma endometriais humanas (HESC) são cultivadas e induzidas artificialmente a submeter-se decidualization em vitro através da suplementação de hormônios (estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona (MPA) e adenosina cíclica monofosfato (cAMP)) ao meio. Neste método, o grau de decidualization é alterado com base no número total de dias de tratamento hormonal. Em conjunto com o rearranjo do citoesqueleto, suplementação hormonal induz adaptações bioquímicas em que as células decidual experimentam de qualidades secretoras2,4. A expressão de genes de marca, tais como a prolactina (PRL) e proteína fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGFBP1), pode ser utilizada para confirmar e quantificar o grau de HESC decidualization5,12, 13 , 14. importante, a viabilidade do presente protocolo realizar knockdown específicos do gene também é demonstrada.
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Protocol
Todas as biópsias de endométrio humano coletadas para este estudo foram alcançadas na Universidade de Washington em St. Louis, departamento de obstetrícia e Ginecologia usando um institucional Review Board (IRB) aprovou o formulário de consentimento por escrito.
1. preparação
- Prepare 500 mL de 1 x do Hank equilibrado sal solução (HBSS) adicionando 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL para o frasco contendo mídia (mais referenciado como meio HBSS +).
- Preparar 500 mL de meio de águia de Dulbecco modificado: F-12 mistura de nutrientes (DMEM/F12) com vermelho de fenol, L-glutamina e 15mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) adicionando 1% solução de antibiótico antimicótico (a concentração final é de 0,25 µ g/mL, 100 µ g/mL Estreptomicina e 100 U/mL penicilina Fungizone) para a mídia contendo o frasco (ainda mais referenciado como meios de isolamento HESC).
- Preparar 500 mL de DMEM/F12 com vermelho de fenol, L-glutamina e 15 mM HEPES, adicionando 10% de soro Fetal bovino (FBS), 1 x at2HCO3e 1% penicilina (10.000 U/mL) e estreptomicina (10.000 µ g/mL) (caneta Strep) à mídia contendo frasco (mais referenciado como HESC Media).
- Preparar 500 mL de meio de soro reduzido com L-glutamina, bicarbonato de sódio 2,4 g/L e HEPES com 2% carvão despojado Fetal soro bovino (csFBS) e 1% Strep caneta à mídia contendo frasco (mais referenciado como Decidualization Media).
- Prepare 500 mL de vermelho de fenol livre DMEM/F12, adicionando 2% carvão despojado de soro fetal bovino (csFBS) na mídia contendo frasco (mais referenciado como mídia de mudança).
- Prepare-se 10 nM estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona 1 µM (MPA) e 50 µM adenosina monofosfato cíclica (cAMP) em um tubo cónico polipropileno de 15 mL e adicionar a 2 mL por alíquota bem de mídia previamente preparado decidualization para in vitro ensaio de decidualization (mais referenciado como EPC Media).
- Prepare 50 mL de congelação mídia com 90% FBS e 10% dimetilsulfóxido (DMSO) 50 mL polipropileno cónica (mais referenciada como meios de congelamento).
- Pre-pesar 25 mg de colagenase e 5 mg de DNase I em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e loja a-20 ° C.
2. aquisição de biópsia de endométrio humana
- Obter amostras de biópsia de endométrio humano coletadas na fase proliferativa (dia 9 - dia 12) do ciclo menstrual da clínica em HBSS IRB aprovado.
- Lavar as amostras de biópsia com 1 mL de escaldadas 37 ° C HBSS + médio e agite suavemente para remover o excesso de sangue e muco.
3. isolamento de células do estroma Endometrial humanas (HESC)
Nota: Este procedimento de isolamento é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
- Transferir a biópsia com Pinças esterilizadas em um tubo de centrifuga conico de polipropileno de 50 mL contendo 10 mL HBSS fresco.
- Centrifugue a biópsia à temperatura ambiente a 500 x g, durante 90 s.
- Se as rupturas de pellet celular, re-spin a biópsia a 2.000 x g, durante 90 s.
- Remova a mídia usando uma pipeta de 1 mL e lavar com 10 mL de 37 ° C pré-aquecido HESC isolamento Media seguido por centrifugação a 500 x g durante 90 s.
- Remova a mídia usando uma pipeta de 1 mL e vigorosamente, adicionar 3 mL de mídia de isolamento HESC fresco para desalojar a biópsia.
- Decante a biópsia para uma placa de Petri contendo 5 mL de HESC isolamento Media.
- Picar a biópsia em como pequenas peças possível usando #5 pinças e tesouras de costura reta bem por cerca de 20 minutos.
- Preparar a DNase I e enzimas colagenase, adicionando 10 mL de HESC isolamento Media para pré-pesados DNase I (0,5 mg/mL) e colagenase (2,5 mg/mL). Misture com pipeta.
- Pipeta de corta amostras de tecido usando uma pipeta de 1 mL para um tubo de polipropileno cônico de novo 50 mL. Lavar com 7 mL de meios de isolamento HESC e adicionar ao tubo de polipropileno para adquirir a amostra completa.
- Centrifugar a amostra à temperatura ambiente a 800 x g por 2 min. Retire com cuidado o sobrenadante com uma pipeta.
- Filtre o DNase I e solução de colagenase através de filtro de 0,2 µm anexados a seringa de 10 mL diretamente na pelota.
- Vórtice de 10 s para resuspenda o pellet.
- Digest em banho de água a 37 ° C por 1,5 h, num Vortex para 10 s minuciosamente cada 10 min, até tecido é digerido.
- Filtre a amostra através de um filtro de célula 40 µm empilhados sobre um tubo de polipropileno cônico de 50 mL para remover as células epiteliais e restos de tecido.
Nota: As células estromais são no tubo de polipropileno cônico de 50 mL. - Centrifugar o tubo polipropileno cônico de 50 mL a 800 x g, durante 2,5 min à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL.
- Resuspenda o pellet em 10 mL de HESC isolamento Media.
- Centrifugar a 800 x g, durante 2,5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e depois Ressuspender as células em 6 mL de mídia HESC e pipeta para diante e reversa para misturar.
- Lentamente a camada em 3 mL de mídia gradiente de densidade para as células ressuspensa separar restantes células do sangue das células do estroma, tomando cuidado para não misturar as camadas.
- Centrifugar o tubo de polipropileno de 15 mL a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente.
- Coletar 5 mL do sobrenadante em um novo tubo de polipropileno de 50 mL e adicionar um adicionais 5 mL HESC mídia para Ressuspender as células.
- Centrifugar a 800 x g durante 2,5 min à temperatura ambiente, seguida pela remoção do líquido sobrenadante e adição de 6 mL HESC Media. Vórtice da amostra durante 10 segundos e mistura pipetando para a frente e reverter 5 vezes.
- Alíquota de 10 µ l de células re-suspensas para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para contagem de células.
- Adicione 10 µ l de 0,4% de azul de Trypan manchar a alíquota de pilha e misture com pipeta. Carregar 10 µ l da alíquota e contar as células usando um hemocytometer.
- As células em um frasco apropriado dependente contagem celular total em 15 mL HESC Media da placa.
- Se o número total de células é menor que 1 milhão, placa todas as células em balão de 25 cm com 6 mL de HESC Media. Se o número total de células é mais de 1 milhão, placa todas as células de 75cm frasco com 15 mL de HESC Media.
- Cultura de células em uma 5% CO2 incubadora a 37 ° C por um período mínimo de 6 h para assegurar a aderência de célula apropriada e alterar os meios de comunicação para mídia HESC.
- Cultura a HESC isolado numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C por um período de 3-5 dias até que as células formam uma monocamada alcançar confluência de 80-90% em um balão chapeado.
- Alterar HESC Media em dois dias.
- Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.
- Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).
- Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.
- Uma vez HESC se tornar confluente de 80-90%, as células de transferência de 25 cm para balão de 75 cm ou de um balão de 75 cm para três frascos de 75 cm.
Nota: HESC pode ser congelado e armazenado para uso posterior neste momento para experiências futuras.
4. congelamento e descongelamento HESCs
- Mídia de balão de 75 cm, Aspire e adicionar 2 mL de EDTA-tripsina.
- Incube numa incubadora 5% CO2 para 2-3 min a 37 ° C até que as células desalojar do recipiente.
- Adicione 7 mL de mídia HESC e misture bem por pipetagem, frente e verso.
- Centrifugar a 800 x g, durante 2,5 min e aspirar o sobrenadante.
- Etiqueta congelamento tubos com linha celular, data e número de passagem.
- Ressuspender o centrifugado em 5 mL de congelamento de mídia.
- Alíquotas de 1ml da HESC re-suspenso a cada tubo e transferência tubos de freezer-80 ° C.
- Transferi os tubos para nitrogênio líquido dentro de 24 horas.
Nota: Se pretende descongelar células no futuro imediato, armazene células congeladas em-80 ° C durante um mês. - Para descongelar os HESCs pré-aquecer HESC Media por 20 min.
- Adicione 8 mL de pré-aquecido HESC Media 25cm balão.
- Recuperar o tubo congelante do tanque de nitrogênio líquido ou -80 ° C e mergulhe o tubo em banho de água a 37 ° C durante 1-2 minutos descongelar as células.
- Transferir HESC descongelado para um balão de 25 cm com HESC mídia e incubá-los numa incubadora 5% CO2 durante a noite a 37 ° C.
- No dia seguinte, mudar a mídia HESC e esperar 2-3 dias até HESC se tornar confluente e transferir células para balão de 75 cm, conforme detalhado abaixo no protocolo 5.
- Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.
- Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).
- Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.
5. cultivo de células do estroma Endometrial humanas (HESC)
Nota: Este procedimento de Culturing é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
- Pré-aquece o HESC Media a 37 ° C em banho-maria por 20-30 min.
- Aspirar a mídia do recipiente e adicionar o ácido de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) do tripsina 0,25% (1 mL para o frasco de 25 cm ou 2 mL para o frasco de 75 cm).
- Incube em uma 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min até desalojar as células.
- Bata levemente as paredes de balão para desalojar as células restantes. Adicione 7 mL de mídia HESC e misture bem por pipetagem, frente e verso.
- Pipetar a mistura de células em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e centrifugar 800 x g por 2,5 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em Media HESC.
- Adicione 15 mL para o frasco de 25 cm ou 45mL para o frasco de 75 cm (15 mL cada).
- Adicione 5 mL ou 15 mL de suspensão de células para cada balão de 25 cm ou 75 cm, respectivamente.
- Cultura a HESC isolado numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C por um período de 3-5 dias até que as células formam uma monocamada alcançar confluência de 80-90% em um balão chapeado.
- Alterar HESC Media em dois dias.
- Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.
- Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).
- Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.
6. humano chapeamento de célula (HESC) do estroma Endometrial e siRNA Transfection
Nota: Este procedimento de transfeccao é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
- Aspire HESC Media de balão de 75 cm e adicionar 2 mL de solução de EDTA-tripsina 0,25%.
- Incube em 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min até desalojar as células.
- Uma vez que as células são desalojadas do recipiente, adicionar 7 mL de mídia HESC e misture suavemente pipetando para diante e reversa 5 vezes.
- Pipetar a mistura de células em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e centrifugar 800 x g por 2,5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 mL de HESC Media.
Nota: Se chapear pilhas de mais de um balão, simplesmente aumente o volume de mídia HESC. - Contar as células usando um Hemocytometer.
- Alíquota de 10 µ l de células re-suspensas em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Adicione 10 µ l de 0,4% azul Trypan manchar a célula alíquota e misturar pipetando para frente e reversa.
- Placa de 0,8 x 105 células por poço em placas 6-boas. Depois de dois dias, as células devem ser 60-70% de confluencia para transfeccao ideal.
- Para cada amostra de transfeccao siRNA, prepare complexos usando siRNA (60 nanomoles) de reagente de transfeccao.
- Diluir 5 µ l de reagente de Transfeccao de 150 µ l de meios livres de soro reduzida e incubar durante 5 min.
- Diluir 60 nanomoles de siRNA em 100 µ l de meios livres de soro reduzida e incubar durante 5 min.
- Após 5 minutos, combinar siRNA diluído com solução de reagente de transfeccao diluídos e misture suavemente pipetando para a frente e reverter 5 vezes.
Nota: Se transfecting um ou mais siRNA em vários poços, mestre mix em 10 mL prepare tubos de poliestireno. - Incube a complexos de reagente de transfeccao siRNA por 5 min à temperatura ambiente.
- Durante esta incubação, adicione 1 mL de meios de comunicação de mudança a cada poço.
- Depois de 5 min. de incubação, centrifuga tubos a 500 x g por 2 min coletar a solução e adicionar a 250 µ l de complexos de reagente de transfeccao siRNA a bem, contendo células e mídia.
- Misture suavemente agite e incube as celulas a 37° C numa incubadora 5% CO2 por 5 h.
- Após 5h, mude os meios de comunicação de mídia HESC.
- Incube as células a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 2 dias em preparação para um ensaio de decidualization em vitro .
7. ensaio de Decidualization in Vitro
Nota: Este ensaio é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
- Preparar a mídia EPC antes de iniciar o tratamento decidualization em vitro , conforme descrito em Camden et al 3 (ver 1.6).
- Aspire a mídia da hora post-48 transfectada linha de HESC incubada da etapa 6.16.
- Adicione 2 mL de EPC Media em cada poço.
Nota: como um controle, deixar um conjunto de células não tratado com Media de EPC. Em vez disso, adicione 2 mL de mídia HESC para os poços de controle. - Incube as celulas em 5% CO2 incubadora a 37 ° C por 6 dias.
- Altere a mídia de EPC em 48 horas.
- Aquecer e preparar a mídia de EPC em banho maria a 37 ° C por 15-20 min.
- Aspirar a mídia do poço e adicionar mídia fresco do EPC.
- Coloque a placa de volta para a 5% CO2 incubadora a 37 ° C.
- Altere a mídia de EPC em 48 horas.
- Após o sexto dia, analise o grau de decidualization de células do estroma através de ELISA e qRT-PCR (conforme descrito abaixo).
8. validação de Decidualization In Vitro utilizando PCR em tempo Real quantitativo (qRT-PCR)
Nota: qRT-PCR é completada conforme descrito em Kommagani et al.10.
- Isole o RNA total de HESC utilizando o protocolo de um kit de isolamento de RNA comercialmente disponível.
- Analise a quantidade de RNA e pureza (um260/A280) usando um NanoDrop ou metodologia similar, conforme descrito em Garcia-Elias et al.15.
- Sintetiza o cDNA de 1 µ g de RNA total através de um protocolo do kit de transcrição reversa comercialmente disponível.
- Execute uma reação de qRT-PCR, conforme descrito em um protocolo do kit de qRT-PCR comercialmente disponível.
- Gene específico testes junto com controles do sistema interno (18s, PRLe IGFBP1) e realizar a reação usando uma mistura de mestre de PCR em tempo real disponível comercialmente.
9. validação de Decidualization In Vitro utilizando ELISA
- Quantificar os níveis de prolactina secretados dos meios de cultura de tecidos utilizando um kit de prolactina ELISA comercialmente disponível.
10. validação de Decidualization In Vitro utilizando faloidina coloração.
- Introduza cada poço de uma placa bem 12 lamínulas estéreis.
- Repita as etapas de 6.1-6.5.
- Placa de 0,8 x 105 células por poço de um prato bem 12.
- Incube as celulas em 5% CO2 incubadora a 37 ° C por 2 dias.
- Aspire os meios de comunicação.
- Repita as etapas 7.3-7.4.
- Consertar as células em paraformaldeído 4% (PFA) em solução salina tamponada fosfato (PBS) à temperatura ambiente por 30 min.
- Aspirar a solução de fixação e lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.
- Adicione 0,1% de éter de fenil tensoativo não-iônico polietilenoglicol tert-octil em PBS por 5 min para as células fixas para aumentar a permeabilidade.
- Lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.
- Adicione 100 µ l de solução faloidina por lamela e incubar a temperatura ambiente por 90 min.
- Prepare a diluição de 1: 100 em PBS de usar uma solução estoque faloidina em 1 unidade por 5 µ l.
- Lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.
- Monte as lâminas com meio de montagem contendo 4' 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
- Observe as células utilizando um microscópio confocal.
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Representative Results
Decidualization em cultura HESC
Após isolamento, células do estroma endometriais humanas foram cultivadas a uma formação de monocamada com confluência de 80-90% e induzido para decidualization em vitro , tratando com 10 nM E2, 1 µM MPA e acampamento de 50 µM (EPC). Mudanças morfológicas associadas em vitro decidualization foram visualizadas na figura 1A. Sobre decidualization, HESCs submeter-se a reorganização do citoesqueleto das células alongadas, fibroblástica a arredondados de células epitelioides. Assim, faloidina coloração foi executado para confirmar a reorganização do citoesqueleto durante decidualization HESC. Faloidina é um peptídeo altamente seletivo bicíclico qual é utilizado para manchar por filamentos de actina, desse modo, visualizando o rearranjo do citoesqueleto consistente com decidualization em vitro (figura 1B).
Com seis dias de tratamentos de EPC de post, PRL e os níveis do mRNA de IGFBP1 foram avaliados através de qRT-PCR para confirmar o grau de decidualization (Figura 2A). Os níveis de PRL e IGFBP1 foram aumentou significativamente em comparação com a HESC tratado com veículo de controle (p < 0,001). As alterações bioquímicas associadas com decidualization também foram avaliadas através da quantificação dos níveis PRL segregados do meio de cultivo (Figura 2B). Consistente com os níveis de transcrição, os níveis PRL foram altamente elevados em EPC cultivadas HESC comparado ao controle (p < 0,001).
O efeito da revogação do gene específico sobre as alterações celulares e moleculares de HESCs decidualization foram avaliados usando SRC-2 como gene candidato (Figura 3). Após 48 horas do transfection com controle ou SRC-2 siRNA, HESC foram cultivados em 6 dias na mídia EPC. Controle siRNA transfectadas HESC demonstrada alterações de celular e moleculares consistente com decidualization adequada, incluindo uma alteração morfológica de paralelepípedos e os níveis de transcrição aumento dos marcadores decidualization PRL e IGFBP1. Como esperado, com queda de siRNA SRC-2 , HESC permanecido fibroblástica na aparência, em comparação com o controle siRNA transfectadas HESC (Figura 3A). Consistente com essa alteração celular, PRL e transcrição de IGFBP1 os níveis foram significativamente menores dentro SRC-2 siRNA transfectadas HESC, indicando um descarrilamento na programação decidualization com "knockdown" SRC-2 (* * *p < 0,001). SRC-2 níveis de transcrição foram significativamente menores no SRC-2 siRNA transfectadas HESC quando comparado para controlar siRNA, indicando um silenciamento de genes eficiente com o nosso método (* * *p < 0,001) (Figura 3B).
Figura 1 : Alterações celulares de células do estroma endometriais humanas durante em vitro decidualization. HESCs foram isoladas e cultivadas por seis dias em meios contendo o veículo ou E2, MPA e acampamento (EPC). A) célula imagens ilustrando as alterações na morfologia celular de fibroblástica de células epitelioides. B) faloidina manchado imagens de HESC ilustrando as alterações do citoesqueleto (em verde) associadas em vitro decidualization, onde o azul representa o núcleo (DAPI). A seta vermelha representa células decidualized. A seta preta mostra células fibroblástica. Barra de escala: 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Alterações moleculares em células do estroma endometriais humanas durante em vitro decidualization. A) total RNA foi isolado a partir HSECs cultivadas durante seis dias em meios contendo o veículo ou E2, MPA e acampamento (EPC) e submetidas a análise de qRT-PCR para detectar níveis de transcrição de IGFBP1 e PRL . B) níveis de PRL secretada para os meios de cultura foram medidos utilizando um ensaio de ELISA com base de HESC cultivada durante seis dias, em qualquer veículo de EPC. p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Knockdown de SRC-2 em células do estroma endometriais humanas afeta em vitro decidualization. A) morfológicas alterações no siRNA transfectadas HESC após 6 dias de cultura com mídia EPC (top painéis: controle siRNA em tempo aponta dia 0 e dia 6, painéis de fundo: SRC-2 siRNA em tempo aponta dia 0 e 6 dias). B) transcrição os níveis de PRL, SRC-2e IGFBP1 no dia 0 e o dia 6 de EPC trataram HESC transfectada com controle ou SRC-2 siRNA. A seta preta representa células decidualized. A seta branca mostra células fibroblástica. Barra de escala: 200 µm. * * * p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O ciclo menstrual reprodutivo feminino é caracterizado por um aumento nos níveis de progesterona durante a fase lútea, induzindo assim a decidualization de ESC em redondo, epitelial, como as células secretoras de3,8. A iniciação de decidualization é dependente de espécies. Em humanos, decidualization ocorre espontaneamente sobre o aumento da concentração de progesterona, enquanto ratos requerem blastocisto presença10,11. Essa incoerência na decidualization exemplifica os benefícios translacionais de estudar a diferenciação celular em linhas de células humanas. Ensaios in vitro através de cultura de células primárias são frequentemente utilizados para explorar a modulação de decidualization através de hormônios4,6,10. No entanto, as limitações desse método podem ocorrer mediante a disponibilidade de um tamanho de amostra grande de tecido humano sem variações significativas na história de gravidez e a fase do ciclo. No entanto, podem tomar-se medidas para garantir que as limitações são minimizadas pelo planejamento do estudo suficiente antecedência para garantir amplas amostras e biópsias agendamento na fase proliferativa (dia 9 - dia 12) do ciclo menstrual.
Neste estudo, HESC são cultivadas e decidualized artificialmente através de um método novo, descrita pela primeira vez em Brosens et al 16 quais hormônios E2, P4 e acampamento são completados ao meio de cultivo ao longo de um período de incubação de 6 dias. Tipicamente, métodos alternativos,12,14 aprontado célula culturas para decidualization artificial através da adição de E2 e MPA durante um período de incubação prolongado dia 14. A suplementação de acampamento para os meios de cultivo em sinergia amplifica o decidualization de ESC em um período de tempo reduzido enquanto simultaneamente estrogenos a expressão de genes que contém regiões de promotor do acampamento elemento responsivo (i.e., PRL e IGFBP1)12,13. Este método, baseado no protocolo descrito em Kommagani et al . 10, permite a otimização do isolamento e cultura de HESC. Pureza de cultura de células foi otimizada através da utilização de um filtro de célula 40 µm para separar linhas de células epiteliais e do estroma. Além disso, o reagente Ficoll-Paque PLUS foi aplicado para garantir um isolamento viável, alto rendimento de células estromais puros sobre a remoção de células do sangue da amostra. Um passo de centrifugação adicional (400 x g durante 30 minutos) foi incluído seguinte aditamento de Ficoll, para garantir a eliminação completa das células sanguíneas da população celular. Finalmente, o rendimento e viabilidade HESC foram otimizados ao cultivo de células até a confluência de 95% para decidualization. No total, estes passos adicionais assegurada a cultura pura de viável, alto rendimento HESC.
O grau de decidualization foi avaliado utilizando qRT-PCR, ELISA e faloidina coloração para observar o rearranjo do citoesqueleto e upregulation de genes de marca registrada. No qRT-PCR, foram avaliados os níveis de transcrição de marcadores decidualization PRL e IGFBP1 . Sobre decidualization de HESC, os níveis de PRL e IGFBP1 aumentou de forma tempo-dependente, conforme estabelecido a partir de pesquisa anterior6. O aumento de tempo-dependente dos níveis PRL secretados também foi confirmado, examinando os meios de cultura de tecido HESC através de ELISA. Além disso, alterações morfológicas das células do estroma em células decidual podem ser visualizadas através do costaining de filamentos de actina via faloidina e marcador nuclear 4' 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)17. Juntos, esses resultados experimentais confirmaram a eficácia de cultivo HESC através da suplementação de E2, MPA e acampamento.
A capacidade do presente protocolo para estudar knockdown específicos do gene também foi avaliada utilizando siRNA contra SRC-2. Morfologicamente, SRC-2 transfectadas HESC permanecido fibroblástica, Considerando que a HESC tratados com controle siRNA decidualized em células epitelioides. SRC-2 "knockdown" eficiência foi avaliada através do nível de transcrição e foi significativamente diminuída, indicando uma bem sucedida silenciamento do gene específico com nosso protocolo. Assim, o nosso protocolo pode ser um recurso útil para investigadores com interesse em delinear o papel de genes específicos no endométrio decidualization.
Enquanto foram feitos avanços em compreender os mecanismos moleculares subjacentes da decidualization, existe ainda uma lacuna de conhecimento significativo sobre as especificidades. Decidualization impróprio foi estabelecida como das causas para a falha de implantação e posterior início embrião aborto4,6,7,10. Portanto, a exploração mais adicional em relação a fatores epigenéticos e caracterização das vias moleculares é necessária para o diagnóstico e tratamento da insuficiência de gravidez.
Em conclusão, o protocolo apresentado ao longo deste estudo estabelece um método eficiente para isolar e cultura uma linha pura e viável de células do estroma endometriais humanas. Completando o hormônios E2, MPA e acampamento para os meios de cultivo, decidualization artificial pode ser induzida como confirmado por qRT-PCR, ELISA e a faloidina mancha. Além disso, nosso protocolo descreve etapas detalhadas necessárias para o nocaute eficiente de um gene específico de interesse usando siRNA e transfections baseados em lipídios. No total, esse método apresenta a capacidade de estudar o subjacente celular e molecular mecanismo (s) associados com decidualization HESC.
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Disclosures
Este trabalho é apoiado por financiamento de institutos nacionais de saúde (NIH) / Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano (FORMULADORES) grant (R00 HD080742) e start-up Washington University School of Medicine fundos para R.K. Gostaríamos de agradecer a clínica de fertilidade de Universidade de Washington para fornecer as amostras de biópsia endometrial.
Acknowledgments
Os autores não têm nada para divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
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