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Cancer Research

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

doi: 10.3791/57685 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Aqui nós descrevemos um método para separar e enriquecer os componentes do microambiente de imune e não imune a tumor em tumores subcutâneos estabelecidas. Esta técnica permite a análise separada de infiltrar imune tumor e frações não imune tumor que podem permitir a caracterização abrangente do microambiente imune do tumor.

Abstract

O microambiente imune tumor (tempo), recentemente, tem sido reconhecida como um mediador crítico da resposta do tratamento em tumores sólidos, especialmente para imunoterapias. Recentes avanços clínicos em imunoterapia destacam a necessidade de métodos pode ser reproduzidos com precisão e completamente caracterizar o tumor e seu associado infiltrado imune. Digestão enzimática do tumor e análise do fluxo cytometric permitam ampla caracterização dos vários subconjuntos de células imunes e fenótipos; no entanto, profundidade de análise muitas vezes é limitada pela fluoróforo restrições no projeto do painel e a necessidade de adquirir amostras de tumor grande observar raras populações imunes de interesse. Assim, nós desenvolvemos um método eficaz e alta taxa de transferência para separar e enriquecendo o infiltrado imune tumor dos componentes não imune tumor. A digestão de tumor descrito e separação centrífuga baseado em densidade técnica permite separada caracterização do tumor e tumor infiltrar imune fracções e preserva a viabilidade celular e assim, fornece uma ampla caracterização do tumor estado imunológico. Este método foi usado para caracterizar extensa espacial imune heterogeneidade em tumores sólidos, que demonstra ainda mais a necessidade de técnicas de perfil imunológica de tumor todo consistente. Em geral, esse método proporciona uma técnica eficaz e adaptável para a caracterização imunológica do subcutâneos tumores sólidos de murino; como tal, esta ferramenta pode ser usada para melhor caracterizar as características imunológicas tumorais e na avaliação pré-clínica de novas estratégias de imunoterapia.

Introduction

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O tempo supressivo recentemente tem sido reconhecido como uma marca registrada de câncer e é conhecido por desempenhar um papel significativo no desenvolvimento e progressão, proteção de cânceres de tumor sólido, bem como atenuar sua susceptibilidade à imunoterapia1. O tempo é composto por vários subconjuntos celulares e fenótipos, os quais fornecem a introspecção crítica do estado imunológico do tumor. Estes subconjuntos imunológicos podem ser ainda mais estratificados em células de origem mieloide, ou linfócitos, que juntos constituem a maioria das respostas de imune inata e adaptativa2,3. Recentes avanços no campo da imunoterapia têm demonstrado que as estratégias de imunoterapia (i.e., inibidores da barreira imune, receptor de antígeno quimérico células-T, etc.) têm o potencial para induzir câncer durável regressões; no entanto, eles permanecem relativamente ineficazes em tumores sólidos cancros4,5. Numerosos grupos mostraram o obstáculo crítico que o tempo pode jogar no tratamento sucesso6,7, e ainda assim, há uma necessidade de avaliar com precisão novas imunoterapias no cenário pré-clínico enfocando especificamente seus capacidade de modular ou superar o tempo8.

Os esforços atuais para caracterizar o tempo normalmente utilizam ou microscopia ou fluem cytometry juntamente com anticorpo rotulagem estratégias para identificar subconjuntos de celulares imunes e suas características9,10. Estas duas estratégias fornecem informações excepcionalmente diferentes, como microscopia permite valorização espacial de subconjuntos de celulares e citometria de fluxo fornece alto rendimento e quantificação mais ampla de mudanças celulares. Apesar das recentes melhorias no multiplex fluorescente imuno-histoquímica otimizando sistemas de imagem espectrais, que agora podem suportar até 7 parâmetros, tamanho limitado do painel torna nível mais amplo imune de perfil difícil e, portanto, esta técnica é frequentemente reservados para mais focada análises. Como resultado, citometria de fluxo permanece um do mais amplamente utilizado imunológico técnicas de criação de perfil. Apesar de seu uso generalizado na caracterização do tempo, os métodos utilizados para processamento e coloração são bastante variável. Mais frequentemente protocolos utilizam um tumor dissociando enzima (ou seja, colagenases, DNase, etc.) e métodos de dissociação manual para atingir as suspensões de célula única, seguido por anticorpo manchando e análise7. Apesar dos benefícios de cada método, numerosos grupos mostraram a extensa variabilidade que pode ser induzida através destas técnicas11. Isto faz comparações de estudo transversal de tumor microambiente perfil extremamente difícil, mesmo quando avaliar o mesmo modelo de tumor murino. Além disso, esses métodos fornecem um potencial limitado para avaliar tumor celular e imunológico tumor infiltrar componentes independente, desde que ambos os componentes são intercalados após a digestão. Quantidade de amostra então limita multi-painel manchando e análise, que se torna um grande problema ao tentar caracterizar subconjuntos imunológicos raros (i.e., tumor-específicas células T)12. Técnicas mais recentes como citometria de massa ou citometria por hora de voo (CyTOF), permitem alta dimensão análise fenotípica de subconjuntos de celulares com alguns sistemas de apoio a projetos de painel superior a 42 parâmetros independente13. Apesar do enorme poder da CyTOF tecnologia em perfil imune, continua a ser limitada devido a despesa, conhecimentos de análise e o acesso ao equipamento. Além disso, muitos protocolos de CyTOF recomendam purificação de subconjuntos imunes para melhorar a relação sinal-ruído14, e, assim, sugerimos que o nosso método de enriquecimento poderia ser usado a montante da análise CyTOF para melhorar a qualidade dos dados.

Neste documento descrevemos uma digestão de microambiente do tumor e análise método que incorpora imune tumor infiltrar na separação. A finalidade desse método é permitir que independente da elevado-produção de perfil do infiltrado imune tumor e frações celulares do tumor para caracterização mais ampla do microambiente do tumor. Usando esse método, demonstramos ainda mais a importância da realização de análises de todo tumor, como um modelo de tumor sólido subcutânea foi encontrado para ter significativa heterogeneidade espacial de imunológica. Em geral, esse método pode com mais precisão e de forma consistente comparar entre amostras porque enriquece para subconjuntos celulares imunes dentro do tumor e permite a caracterização independente das células do tumor e imunes frações de um tumor.

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Protocol

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Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) do Baylor College of Medicine e institucional Cuidado Animal.

1. digestão e colheita tumor

Nota: O tempo necessário para a colheita é ~ 3-5 min/tumor e o tempo necessário para o processamento é ~ 1 h + 2-3 min/tumor.

  1. Eutanásia em ratos por inalação de dióxido de carbono e uma mangueirada cada rato com etanol a 70% antes da colheita para evitar a contaminação de cabelo. Cirurgicamente remover tumores subcutâneos de ratos e certifique-se de que os tumores são livres de qualquer contaminante tecido (i.e., cabelo, pele, peritônio, etc.). Coloque cada tumor em 1,8 mL de base RPMI-1640 mídia sem soro fetal bovino (FBS) em uma placa de 24. Para maiores colheitas, manter placas frias no gelo para preservar a viabilidade celular.
    Nota: Se esterilidade é necessária, todas as dissecções de tumor precisará ser realizada em uma armário com instrumentos cirúrgicos estéreis (i.e., tesouras, pinças, etc.), bem como quaisquer outras medidas de biossegurança. Tumores com o maior diâmetro entre 0,5 - 1 cm são ideais, e tumores de maiores ou menores exigirá dimensionamento dos reagentes.
  2. Use uma tesoura para cortar os tumores em menos de 1 mm3 peças dentro de cada poço.
  3. Preparar um cocktail de digestão de 10x dissolvendo colagenase que 10mg/mL, IV de colagenase em 2.500 U/mL e DNase eu a 200 U/mL em base meios de RPMI-1640 (sem FBS).
    Nota: A digestão cocktail pode ser preparada um dia de antecedência e armazenada a-20 ° C; no entanto, um armazenamento prolongado não é recomendado como enzimas vão perder atividade ao longo do tempo uma vez dissolvido.
  4. Adicionar 200 µ l de 10 x dissociação cocktail contendo colagenase I, IV colagenase e DNase I para cada poço com pedaços de3 a 1 mm.
  5. Permitir que as amostras digerir durante 1 h a 37 ° C, agitando levemente 60-100 RPM usando um agitador orbital de placa.
    Nota: A elevação da temperatura a 37 ° C durante a digestão enzimática pode causar ativação de células imunes.
  6. Depois de 1 h, neutralize a reação adicionando 1 mL de RPMI-1640 mídia suplementada com 5% FBS e 2 mM de EDTA para cada poço.
  7. Pipete a digestão do tumor e o restante do tumor em um coador de célula de 40 µm sentado em cima de um tubo de centrífuga de 50 mL.
    Nota: Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 mL para fácil transferência de digestão do tumor para o filtro.
  8. Use um êmbolo de seringa de 10 mL para desagregar mecanicamente as peças do tumor através do filtro. Periodicamente, lave o filtro com 2 mL de completados mídia RPMI-1640 (contendo 5% FBS) e repita até que o filtro célula está livre de tumor.
    Nota: Cerca de 4-10 mL de mídia total deve ser suficiente para enxaguar adequadamente o coador de tumor.
    Nota: Colocar as amostras no gelo, até que essa etapa for concluída para todas as amostras preservar a viabilidade celular.
  9. Ajuste cada tubo de centrífuga de 50 mL para o mesmo volume utilizando o meio RPMI 1640 completado.
    Nota: O ajuste do volume é essencial para balanceamento de centrífuga. Pular esta etapa pode resultar em lesões pessoais ou danos de centrífuga.
  10. Centrifugar as suspensões celulares (5 min, 805 x g, 4 ° C), descartar os sobrenadantes e ressuspender em 2 mL de completados mídia RPMI-1640.
    Nota: Um agregado de células pode formar a centrifugação que é difícil Ressuspender a seguir. Use uma pipeta sorológica 5ml e misture rapidamente para quebrá-lo antes de prosseguir.

2. separação de frações celulares imunológico e Tumor

Nota: O tempo necessário para esta etapa é de cerca de 1 h.

  1. Adicione 3 mL de meio de gradiente de densidade para o fundo de um tubo de centrífuga de 15 mL. Preparar e rotular suficiente tubos para cada tumor.
  2. A 2 mL de suspensão de células de tumor em cima do meio de gradiente de densidade da camada pipetando lentamente para baixo do lado do tubo para evitar a mistura das duas camadas.
  3. Cuidadosamente coloque os tubos em camadas no centrifugador e rotação por 20 min a 805 x g, 20 ° C, com o sem freio.
    Nota: É extremamente importante verificar o correcto balanceamento e certifique-se de que o freio não é usado durante a centrifugação. Qualquer interrupção deste processo resultará em camada de mistura e a recuperação completa de amostras será difícil.
  4. Transferi com cuidado o tumor infiltração leucocitária (TIL) camada e a camada superior de mídia para um novo tubo de 15 mL com uma pipeta de transferência. Descartar todos os restantes médio de gradiente de densidade e ressuspender o tumor na parte inferior do tubo em 2 mL de RPMI-1640 completados.
    Nota: Após a centrifugação haverá quatro camadas visíveis de cima para baixo, que correspondem respectivamente a: mídia, TILs, médio gradiente de densidade e aglomerados de células do tumor. Consulte a Figura 2A para a exemplo das várias camadas.
  5. Centrifugar os dois o TIL e amostras de tumor em separam os tubos (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartar o sobrenadante.
  6. Resuspenda amostra TIL em 200 µ l e a pelota de tumor em 2 mL de completados mídia RPMI-1640. Manter-se no gelo para preservar a viabilidade.

3. chapeamento e coloração

Nota: O tempo necessário para o chapeamento é 30 s/tumor; o tempo necessário para a coloração da superfície é de 1 h; o tempo necessário para coloracao intracelular é 40 min; o tempo necessário para análise de citometria de fluxo é 1 - 4 min/tumor.

  1. Prepare-se e conta com placa de rótulo um U-fundo de 96 poços para cada imunológico coloração painel e uma placa adicional para celular.
    Nota: Normalmente, três pratos são preparados no total: uma placa do painel de linfócitos com foco, uma placa de painel mieloide focada e uma placa de contagem de células.
  2. Alíquota as suspensões de célula única em cada um da coloração do painel placas e um volume definido na placa de contagem.
    Nota: A placa de contagem é usada para calcular o número total de células adicionado para cada painel de coloração, permitindo assim que a contagem de população de células precisos. Um citômetro de fluxo com capacidades de amostragem e de análise volumétrica de placa de 96 poços pode fornecer o número de células por µ l em cada amostra e portanto, calcular o número de células adicionado para cada painel de coloração. Placas de contagem podem ser adquiridas no dia seguinte após a fixação durante a noite a 4 ° C, enxágue com buffer de FACs (tampão fosfato salino (PBS), com 2% FBS) e resuspending em um volume definido de buffer de FACs.
  3. Lave as células duas vezes com 200 µ l de solução salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS) por amostra por centrifugação (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartar o sobrenadante entre cada enxágue para remover qualquer enciclopédia FBS.
  4. Adicionar 50 µ l do bloco Fc, misturar as amostras usando uma pipeta multicanal e incube por 20 min a 4 ° C.
  5. Adicionar 50 µ l de 2x concentrado anticorpo direcionamento extracelular e viabilidade fixável mancha mistura, misture com uma pipeta multicanal e incube por 30 min no escuro no RT ou 4 ° C.
    Nota: As condições exatas de coloração para o anticorpo dependem as instruções do fabricante. Todas as diluições de coloração devem ser em DPBS, com nenhum FBS adicionado para evitar a saturação do corante viabilidade fixável. Por favor, veja a Tabela de materiais e equipamentos para as diluições ideais do painel coloração usada neste manuscrito. Anticorpo e viabilidade fixável solução de coloração é preparado em uma concentração de 2 x para fornecer um final 1 x manchando a concentração de 100 µ l de volume total de coloração quando adicionado ao bloco de Fc.
  6. Lave as amostras duas vezes com tampão de FACs por centrifugação (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartando os sobrenadantes entre cada lavagem.
  7. Resuspenda em 200 µ l de solução de fixação/permeabilização de 1x e incubar durante uma noite a 4 ° C, protegido da luz.
    Nota: O experimento pode ser pausado a noite neste ponto: manter as amostras em 4 ° C, protegido da luz.
  8. No dia seguinte, Centrifugar as placas (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartar o sobrenadante.
  9. Lave uma vez com 200 µ l de tampão de permeabilização, centrifugador (5 min, 805 x g, 4 ° C), 1x e descartar o sobrenadante.
  10. Adicione 100 µ l de 1 x concentrado anticorpo intracelular coloração painel preparado em tampão de permeabilização de 1x e incube por 30 min no escuro no RT ou 4 ° C (isso depende de coloração as recomendações do fabricante).
  11. Lave uma vez com permeabilização 1x tampão (5 min, 805 x g, 4 ° C), desprezar o sobrenadante e lavar uma segunda vez com buffer de FACs (PBS com 2% FBS).
  12. Resuspenda as amostras em 300 µ l de tampão de FACs (PBS com 2% FBS), transferir as amostras para tubos de citometria de fluxo e executar análise de citometria de fluxo.

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Representative Results

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Nossos resultados demonstram o benefício significativo de TIL separação de componentes de tumor não imune, conforme explicado no protocolo. Além disso, usando o método descrito Demonstramos a heterogeneidade imunológica significativa de tumores sólidos estabelecidos.

Um problema significativo com muitas técnicas de dissociação de tumor é a perda da viabilidade da amostra, geralmente como resultado de condições de digestão dura (i.e., elevadas temperaturas, fornecimento inadequado de nutrientes, etc.). Usar o método de digestão descrito, com ou sem densidade gradiente enriquecimento médio, fornece aproximadamente 70-90% total viabilidade celular, avaliadas por citometria de fluxo (Figura 1A). Realidades semelhantes foram observadas no TIL enriquecido e tumor enriquecido fracções, sugerindo que esse método causa toxicidade global mínima (Figura 1, Figura 2C). Além disso, o enriquecimento médio gradiente de densidade promoveu um maior do que o aumento de 2 vezes na CD45 positivo TIL fração entre células viáveis totais analisados digestões do tumor em relação ao não-enriquecido (Figura 1B, C). Além disso, o enriquecimento foi encontrado para melhorar vários subconjuntos de células imunes comumente avaliados em estudos de microambiente imune, incluindo células mieloides-derivado supressor (MDSCs), as células dendríticas (DCs), macrófagos, células T CD8 e CD4 células-T ( Figura 1D, E). Isto sugere que o enriquecimento médio gradiente de densidade promove avanços immunocyte global e não isolar linfócitos específicos ou populações mieloides (consulte Supplemental figura 1A, B para a citometria de fluxo, retenção de método usado para identificar populações de célula específica). É interessante notar, no entanto, que muitas mídias de separação gradiente de densidade comercialmente disponíveis permitem uma fração significativa de hemácias e granulócitos para passar pela fase de separação. Assim, se essas populações são de interesse, mais otimização de protocolo pode ser necessária.

Figure 1
Figura 1 : Suave e eficaz o enriquecimento de infiltrado imune tumor. Tumores de MEER estabelecidas foram extirpados e digerido usando o método descrito. Após digestão, suspensões de célula única dividiram-se tal que metade passou por enriquecimento médio gradiente de densidade e a outra que metade foram corados diretamente. (A) avaliação de citometria de fluxo cumulativo da viabilidade celular por digestões de tumor com ou sem enriquecimento médio gradiente de densidade. Citometria de fluxo representativo do (B) retenção de parcelas mostrando CD45 enriquecimento de células imunes positivos de uma digestão de tumor único com e sem enriquecimento médio gradiente de densidade. (C) citometria de fluxo cumulativo CD45 positivo percentagens entre células viáveis totais de digestões de tumor com ou sem enriquecimento médio gradiente de densidade de células. (D) rácios de enriquecimento de vários mieloide e populações imune dos linfócitos. Tumores eram digeridos em célula única suspensão antes de ser manchado diretamente ou passando por enriquecimento gradiente de densidade antes da análise de coloração e fluxo cytometry. Cada razão de enriquecimento do tipo de célula foi calculado dividindo-se uma percentagem determinada célula-população (entre células viáveis totais avaliado) da digestão de tumor enriquecido gradiente de densidade pela sua contraparte não-enriquecido. Bar linhas representam a mediana e as bordas da barra representam os rácios mínimos e máximos. (E) tabela de expressão marcador celular imune usado para identificar cada população de células imunes analisada. Significância estatística foi determinada com um teste-t não pareado ou teste de Mann-Whitney. p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001, * * *p < 0,0001, (n = 20 tumores, N = 2 para todos os gráficos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma das mais significativas vantagens que este método fornece é a capacidade de perfil independentemente da fração não-imune tumor. Após o isolamento da fração peletizadas não imune tumor que passa pela fase médio gradiente de densidade, tumor complexo painéis de criação de perfil pode ser executada que anteriormente pode ter sido limitada pelo número de fluoróforo e limitações de quantidade de amostra. Figura 2 A mostra um exemplo da caracterização de citometria de fluxo tumor com mais de 70% de viabilidade e enriquecimento da célula negativo de 99% CD45. A fração negativa CD45 pode então ser perfilada para inúmeras funcionalidades de tumor como viabilidade global do tumor ou apoptose (i.e., caspase 3, anexina V, etc.), capacidade de proliferação (ou seja, Ki67) e a expressão de vários marcadores de imunossupressores (i.e., programou a morte-ligante 1 (PD-L1) ou PD-L2). Note no entanto, que a fração negativa CD45 inclui tanto as células do tumor, bem como outros elementos estromais e vasculares do microambiente do tumor. Assim, se a caracterização de células de tumor direta é necessária, um marcador específico de células de tumor precisaria ser usado (ou seja, a citoqueratina, antígeno específico do tumor-associado, etc.). Da mesma forma, outros elementos do estroma do tumor poderiam ser facilmente identificados e caracterizados após a rotulagem com um marcador específico do tipo de célula como tumor vascular em células endoteliais (CD31) e cancro associados fibroblastos (actina de músculo liso-α). No entanto, o nível de viabilidade e enriquecimento de célula negativo CD45 é altamente consistente em amostras repetidas, indicando a robustez da técnica de separação de gradiente de densidade para enriquecimento de componente não imune tumor (Figura 2B, C ).

Figure 2
Figura 2 : Enriquecimento e perfilagem das características do componente não imune tumor. (A) imagem representativa de uma amostra após enriquecimento médio gradiente de densidade com camada visível de mídia (rosa), TIL camada (fina branca turva), densidade gradiente camada Médio (clara) e da pelota de tumor na parte inferior do tubo. Citometria de fluxo representativo do (B) retenção de estratégia usada para perfilação o componente de tumor não imune, com dispersão de viabilidade celular (topo), CD45 célula negativo enriquecimento gráfico de dispersão (inferior esquerdo) e três marcadores independentes de interesse expressão através de parcelas de histograma (PD-L1 top, PD-L2 médio e inferior Ki67). Histograma FMO representa uma amostra manchado com todas as outras cores do painel, mas falta o marcador de interesse. Avaliação de citometria de fluxo cumulativo de viabilidade celular (C) e CD45 (D) as porcentagens de células negativas entre células viáveis totais da fração da pelota tumor após enriquecimento médio gradiente de densidade (n = 7-8 tumores). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Apesar dos esforços significativos para caracterizar a heterogeneidade genética de tumores sólidos, pouco trabalho detalhou a heterogeneidade espacial dos subconjuntos imunológicas em tumores sólidos. Estamos, portanto, teve como objetivo determinar como mieloide e subconjuntos de linfócitos imunológica variados drasticamente ao longo de um único tumor sólido. Assim, um tumor MEER estabelecido foi dividido em quatro partes iguais, com especial cuidado para garantir que cada seção continha aproximadamente iguais regiões intra-tumoral, bem como porções igual dérmica e peritoneal-voltado para a(Figura 3). Cada pedaço de tumor foi digerido separadamente, enriquecido por meio do gradiente de densidade e dividido entre um painel mieloide e linfócitos. Isto permitiu a quantificação de vários recursos, incluindo um número de populações de immunocyte comumente avaliada: células T, macrófagos, células T CD4 +, células CD8 + T DCs, MDSCs (consulte complementar figura 1A, B para a citometria de fluxo, retenção de estratégia). Dentro de um único tumor, variabilidade celular significativo entre as partições diferentes tumor foi observado (Figura 3b). Por exemplo, contagem de células totais tanto DC e células T foram encontradas para variar por tanto quanto 4 para 5-fold entre as partes adjacentes do tumor. Estas mudanças drásticas também se observaram quando analisando células populações como uma porcentagem do totais células viáveis (complementar Figura 2A) e foram observadas em níveis semelhantes nos dois outros tumores independentes (complementar a figura 2B, C). Estes dados demonstram a importância de isolar e analisar o tumor todo ao realizar análises de microambiente imune, que podem parecer contra-intuitivo se protocolos atuais incluem dividindo o tumor para permitir análise complementar por independente métodos (i.e., histologia, quantificação de RNA, etc.). Além disso, esses dados podem explicar discrepâncias nas análises imunológicas de biópsias de tumor, como imunológicas heterogeneidade regional intratumoral drasticamente pode distorcer resultados de biópsia.

Figure 3
Figura 3 : Avaliação da heterogeneidade imune tumor estabelecida. (A) imagem representativa de um tumor de MEER estabelecido após ressecção cirúrgica (à esquerda) e após a divisão igual em adjacentes 4 peças (à direita). Barra de escala é de 1 cm, mostrado em preto sobre cada imagem. (B) dobra muda de vário mieloide e célula linfócito conta entre cada uma das 4 partes adjacentes de tumor; cada seção de tumor submeteu-se a mesma digestão, procedimento de enriquecimento médio gradiente de densidade, coloração e análise. Cada parte do tumor é mostrado como uma mudança de dobra de contagem celular, conforme determinado dividindo sua contagem de células por parte do tumor com a contagem de menor célula analisados para uma população de determinada célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplemental Figure 1
Suplementar a Figura 1: citometria de fluxo representativo gating estratégia usada para perfilação de componente imune tumor. (A) Gating estratégia com respectiva dispersão usado para criação de perfil imune dos linfócitos. (B) Gating estratégia com respectiva dispersão usado para tumor mieloide imune perfilação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplemental Figure 2
Suplementar a Figura 2: avaliação complementar da heterogeneidade de tumor estabelecida. (A) percentagem celular entre células viáveis total prega mudança de tumor igual 4 peças mostrada na Figura 3. (B) e (C) são dois adicionais estabelecidos MEER tumores divididos em 4 partes adjacentes e analisados para heterogeneidade imune tumor. Alterações de dobra de contagem celular (à esquerda) e célula percentuais entre células viáveis totais dobram as alterações (à direita) para cada mieloide e população celular de linfócitos analisados mostrando a variabilidade de cada uma das 4 partes adjacentes do tumor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O tempo é composto de moléculas e componentes celulares diversos e complexos. Recentes sugerem que a caracterização exata deste ambiente pode fornecer um melhor entendimento do tratamento de sucesso ou fracasso e pode até mesmo ajudar a identificar os mecanismos de resistência terapêutica. Por exemplo, aumentando os níveis de intratumoral de várias células imunossupressoras (i.e., MDSCs, pilhas de T reguladoras, etc.) pode atenuar efetoras imune respostas e abrogar efeitos imunoterapia. Por outro lado, a crescente presença de intratumoral das populações efetoras imune (por exemplo, tumor-específico T CD8 + células, células assassinas naturais, T helper células) pode ser poderosos preditores de sucesso do tratamento. Outra caraterização que continua a representar fielmente o status imunológico de tumor é as características fenotípicas das células do tumor se. Isso inclui a expressão de vários ligantes imunossupressoras, enzimas ou moléculas destinadas a ácido efetoras imune respostas (i.e., PD-L1, L2-PD, indolamine 2,3 dioxigenase, óxido nítrico, etc.). Tomados em conjunto, isto demonstra a necessidade de caracterização precisa e ampla de características celulares o imune e o tumor de tumores sólidos.

A técnica que descrevemos aqui permite separação e enriquecimento do tumor e imunológico componentes de células de tumores subcutâneos murino sólidos. Então, independente fluxo cytometric de criação de perfil pode ser executada para que o tempo inteiro e a interação de células tumorais, com o tempo podem ser apreciados. Após o enriquecimento, painéis de citometria de fluxo imune extensa podem ser otimizados para permitir a caracterização dos principais componentes celulares mieloides e linfoides, bem como uma variedade de características, descrevendo seu status fenotípica. Da mesma forma, tumor extenso painel de célula concentrada pode ser usado independentemente para fornecer ampla caracterização das características de células do tumor também. A relativa simplicidade da técnica permite a análise simultânea de um grande número de tumores murino, que é crítico para observar as tendências apesar da variabilidade biológica dos modelos de tumor murino. Além disso, o enriquecimento imune tumor fornece melhor identificação dos subconjuntos imunológicas raras (i.e., tumor-específicos citotóxicas células T), que são frequentemente significativamente sub-representados dentro do tumor, em comparação com outros componentes não imune celular . Otimização desta técnica pode permitir análises adicionais de jusante nestes subconjuntos isolados que necessitam de enriquecimento, como coculture ex vivo ensaios, mRNA profiling, ou estudos de transferência adotiva de célula.

Usando esta técnica em um modelo de tumor murino subcutâneo, demonstramos o enriquecimento significativo dos subconjuntos imunes globais e independentes. Também demonstramos que o tumor não imune de perfil que pode ser alcançado a partir das mesmas amostras de tumor. Finalmente, mostramos a importância de todo tumor perfis imunológicos, como observamos significativa heterogeneidade imunológica nas seções adjacentes de um tumor. Idealmente, esta técnica de colagenase e digestão DNase-baseado e baseados em gradiente de separação das frações imune e não imune tumor poderiam ser aplicados à maioria dos modelos de tumor murino, ambos ortotópico e subcutâneo. Também observamos que pequenos tumores não estabelecido e menos modelos de colágeno denso tumor (ou seja, B16 melanoma) muitas vezes não necessitam de uma etapa de digestão enzimática para gerar monocelulares suspensões15; no entanto, baseados em gradiente imune enriquecimento realiza igualmente também nesses modelos de tumor, Validando ainda mais sua versatilidade. Apesar das preocupações anteriores sobre digestão de antígeno de colagenase em subconjuntos específicos de celular11, ainda temos de observar uma perda notável de qualidade para qualquer um dos marcadores que já concluímos a coloração. Não obstante, sensibilidade de antígeno para estas condições de digestão deve ser avaliada utilizando amostras de controle adequado não digerido antes ampla adoção desta técnica.

Em conclusão, nossa técnica permite a caracterização exata, larga e alto rendimento dos componentes imune e não imune tumor murino tumores sólidos. Através da realização de perfil independente destes subconjuntos, pesquisadores amplamente podem caracterizar o tempo e obter melhor visão mecanicista terapias pré-clínicos de tumor sólido. Esse método pode ser aplicado facilmente para a grande maioria dos modelos de tumor murino para análise de alta taxa de transferência de linfócitos e contagens de população mieloide immunocyte e fenótipos através de citometria de fluxo, ou outros ensaios a jusante que requerem enriquecimento de subconjunto.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

JMN reconhece o apoio financeiro do Instituto Nacional de General Medical Ciências (T32GM088129) e do Instituto Nacional de Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) ambos os institutos nacionais de saúde. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde. Este projeto também foi apoiado pela citometria e núcleo de classificação de célula no Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 e S10 RR024574) e a assistência especializada de Joel M. Sederstrom.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice Jackson Laboratory  N/A Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line Acquired from collaborator  N/A E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line 
70% isopropyl alcohol  EMD Milipore  PX1840
Murine surgical tool kit World Precision Instruments MOUSEKIT Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. 
24-well plate  Denville Scientific Inc. T1024 Or any 24-well flat bottom plate. 
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R0883
Collagenase I  EMD Milipore 234153
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation LS004189
DNase I  Sigma-Aldrich 11284932001
Low Speed Orbital Shaker BioExpress (supplier: Genemate)  S-3200-LS Or any orbital shaker. 
Thermoregulating incubator Fisher Scientific 13-255-27 Or any other thermo-regulated incubator
FBS Sigma-Aldrich F8192
EDTA AMRESCO E177
1 mL Pipette and tips Eppendorf 13-690-032 Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers Fisher Scientific 22363547
50 mL Centrifuge Tubes Denville Scientific Inc. C1062-P
15 mL Conical Tubes Denville Scientific Inc. C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles BD 309604
Lymphoprep Density Gradient Medium STEMCELL Technologies 7811
Transfer Pipettes Denville Scientific Inc. P7212
96-well U-bottom plates Denville Scientific Inc.
DPBS Sigma Aldrich  D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set  ThermoFisher Scientific 00-5523-00 Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge Eppendorf  5810 R
Attune NxT Flow Cytometer ThermoFisher Scientific N/A For 96-well cell volumetric counting 
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2  ThermoFisher Scientific 553141 Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation ThermoFisher Scientific L34962 Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 ThermoFisher Scientific 47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC ThermoFisher Scientific 17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE Santa Cruz Biotechnology sc-53473 
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 ThermoFisher Scientific 56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 ThermoFisher Scientific 48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC ThermoFisher Scientific 17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE ThermoFisher Scientific 12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 ThermoFisher Scientific 25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 ThermoFisher Scientific 46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 BD Biosciences 563755

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References

  1. Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7, (5), 1016-1036 (2017).
  2. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14, (10), 1014-1022 (2013).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27, (45), 5904-5912 (2008).
  4. Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33, (31), 3541-3543 (2015).
  5. Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8, (12), 106 (2016).
  6. Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28, (1), 105-113 (2010).
  7. Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114, (3), 589-595 (2009).
  8. Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
  9. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37, (2), 364-376 (2012).
  10. Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013, (10), (2013).
  11. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  12. Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7, (6), 01902-01916 (2016).
  13. Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
  14. Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
  15. Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas
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Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).More

Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).

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