Summary

الجيل الأول قلب مثل حقل المتكفل القلب و Cardiomyocytes البطين مثل من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

Published: June 19, 2018
doi:

Summary

هنا يمكننا وصف أسلوب لتحجيم، استخدام تركيبة بسيطة أضافت أ ووساطة lentivirus Id1-أوفيريكسبريشن، لتوليد أول قلب مثل حقل المتكفل القلب و cardiomyocytes البطين مثل من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية.

Abstract

توليد كميات كبيرة من فروعه القلب المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية الفنية وكارديوميوسيتيس من قلب محدد الحقل الأصل هو شرط مسبق لعلاجات أمراض القلب يستند إلى الخلية والنمذجة المرض. وقد أظهرنا مؤخرا أن الجينات معرف ضرورية وكافية لتحديد أول فروعه الميدانية القلب أثناء تطوير الفقاريات. هذا البروتوكول التمايز روافع هذه النتائج ويستخدم Id1 overexpression في تركيبة مع أضافت كرموز تحديد قوية لإنتاج أول قلب مثل حقل (فهف-L) موروث. الأهم من ذلك، تفرق المتكفل الناتجة عن كفاءة (~ 70 – 90%) في cardiomyocytes البطين الشبيهة. هنا يصف لنا طريقة مفصلة 1) توليد هبسكس Id1 overexpressing و 2) التفريق بين كميات قابلة للتطوير كريوبريسيرفابل فهف-L المتكفل و cardiomyocytes البطين مثل.

Introduction

الإنتاج على نطاق كبير من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس)-المتكفل القلب المشتقة و cardiomyocytes هو شرط مسبق للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية1، النمذجة2،3 ، وتوصيف السريع للمرض مسارات جديدة تنظم5،،من4التمايز القلب6 وفسيولوجيا7،8. على الرغم من أن عددا من الدراسات9،،من1011،،من1213،14،15 قد سبق وصف ذات كفاءة عالية بروتوكولات التمايز القلب من هبسكس، أي عالجت أصل الحقل القلب كارديوميوسيتيس الناجمة عن ذلك، وعلى الرغم من تحديد هوية اختلافات الجزيئية بين اليسار (قلب الحقل الأول) والحق (قلب الحقل الثاني) cardiomyocytes البطين16 ووجود القلب الخاصة بمجال أمراض القلب الخلقية؛ أي قلب اليسار التصنع متلازمة17 أو أرهيثموجينيك خلل التنسج البطين الأيمن18. وهكذا، أصبح توليد المتكفل القلب وكارديوميوسيتيس من قلب محدد الحقل الأصل من هبسكس ضروري من أجل زيادة أهميتها باعتبارها العلاجية والمرض أدوات النمذجة.

يعتمد هذا البروتوكول على أوفيريكسبريشن التأسيسي ل Id1، التي تم تحديدها مؤخرا5 أول قلب تحديد حقل جديلة التي في تركيبة مع أضافت، ضروري وكاف لبدء كارديوجينيسيس في هبسكس. جدير بالذكر أن كانينغهام et al. (2017) 5 إظهار أن المتكفل المستحثة Id1 الإعراب على وجه التحديد أول حقل القلب (HCN4، TBX5) لكن الثانية لا قلب الحقل علامات (SIX2، ISL1) فإنها تمر بالتمايز القلب. وباﻹضافة إلى ذلك، الكتاب تظهر أيضا أن وضع الأجنة الماوس المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى أسرة معرف من الجينات (Id14)، دون تشكيل أول قلب ميدان القلب موروث، بينما أكثر فروعه القلب الآنسي والخلفي ( يمكن أن لا تزال تشكل قلب الحقل الثاني)، مما يوحي أن معرف البروتينات ضرورية لبدء أول قلب ميدان كارديوجينيسيس في فيفو. مريح، يمكن cryopreserved المستحثة Id1 المتكفل وتفرق عفويا في cardiomyocytes عرض الخصائص الشبيهة بالبطين، بما في ذلك التعبير علامات خاصة بالبطين (IRX4, MYL2) و البطين مثل إمكانات العمل.

هنا يصف لنا طريقة بسيطة وقابلة للتطوير لإنشاء أول قلب مثل حقل (فهف-L) القلب المتكفل و cardiomyocytes البطين مثل من هبسكس overexpressing Id1. من السمات هامة لهذا البروتوكول هو إمكانية فصل الجيل القلب السلف من الإنتاج كارديوميوسيتي اللاحقة باستخدام خطوة تجميد مريحة. باختصار، هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات اللازمة (1) توليد هبسكس Id1 overexpressing، (2) إنشاء فهف-L القلب موروث من هبسكس، (3) كريوبريسيرفي المتكفل الناتجة، و (4) استئناف فهف-L السلف القلب التمايز وتوليد عالي التخصيب (> 70 – 90%) ضرب cardiomyocytes البطين الشبيهة.

Protocol

1-Id1 إعداد الفيروس والإصابة توليد Id1 lentivirus overexpressing pCMVDR8.74 المشترك ترانسفيكتينج و pMD2.G وبكده-EF1-Id1-PGK-برور (أدجيني: بلازميد #107735) في الخلايا HEK293T. جمع الجزيئات الفيروسية وفيلتراتي، وتنقية من المادة طافية وتخزينها في-80 درجة مئوية كما هو الحال في كيتامورا et al. (2003) 19-وبدلاً من ?…

Representative Results

جيل هبسكس Id1 خطوطهبسكس المصابين لينتيفيروس وساطة Id1 overexpression (الشكل 1أ). حالما يتم إنشاء هبسكId1 ، هو كمياً التعبير التحوير ب qRT-بكر (الشكل 1ب). ينبغي أن تستخدم فقط هبسكId1 خطوط ال?…

Discussion

للاختلاف ناجحة، تأكد من اتباع التعليمات المذكورة أعلاه عن كثب. وباﻹضافة إلى ذلك، هنا نسلط الضوء على المعالم الرئيسية التي تؤثر بشدة على نتائج المفاضلة. قبل البدء بتفريق، وينبغي مراعاة المحددات المورفولوجية الثلاثة التالية: مورفولوجيا جذعية من هبسكسId1، ارتفاع ضغط خلوية والتقاء عال…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر أعضاء المختبر الكولا لإجراء مناقشات مفيدة وملاحظات حرجة من المخطوطة. وأيد هذه الدراسة بالمعاهد الوطنية للصحة/نيس R44ES023521-02 ومنح سيرم DISC2-10110 للدكتور الكولا.

Materials

ACTC1 antibody Sigma A7811
Activin A Stem Cell Technologies Hu Recom Activin A
Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) Thermo Fisher Scientific 15240062
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement w/o – insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
B27 supplement w/o – vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587001
CDH5 antibody R&D Systems AF938
CryoStor CS10 Stem Cell Technologies 7930 Cryopreservation reagent
DMEM high Glucose Mediatech 10-013-CV 
DPBS w/ Ca & Mg Corning 21-030-CV
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-038
FBS VWR 89510-186
FluoVolt membrane potential kit   Thermo Fisher Scientific F10488 For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Matrigel, Growth Factor Reduced Corning 356231 Coating reagent
mTeSR1 media kit Stem Cell Technologies 5850
PBS w/o Ca & Mg Corning 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Gibco
Puromycin  Acros 227422500
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Enzyme-free dissociation reagent
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
TAGLN antibody Abcam ab14106
Thiazovivin Stem Cell Technologies 72254 RHO/ROCK pathway inhibitor
TrypLE Express Thermo Fisher Scientific 12605 -010 1X enzyme-containing dissociation reagent
Tyrodes solution mix packets   Sigma T2145-10X1L (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017)

References

  1. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  2. Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
  3. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  4. Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
  5. Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
  6. McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).
  7. McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
  8. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
  9. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
  10. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
  13. Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
  14. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  15. Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
  16. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
  17. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
  18. Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
  19. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).

Play Video

Cite This Article
Yu, M. S., Spiering, S., Colas, A. R. Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57688, doi:10.3791/57688 (2018).

View Video