Summary

הדור של אבות לב שדה דמויי הלב הראשון, דמוי-חדרית Cardiomyocytes מתאי גזע Pluripotent אנושי

Published: June 19, 2018
doi:

Summary

כאן נתאר שיטת מדרגיים, באמצעות שילוב פשוט של Activin A ו- Id1 בתיווך lentivirus-ביטוי, כדי ליצור אבות לב שדה דמויי הלב הראשון וחדרית דמוי cardiomyocytes מתאי גזע pluripotent אנושי.

Abstract

הדור של כמויות גדולות של pluripotent האנושי פונקציונלי תאי גזע-derived לב אבות, cardiomyocytes הלב מוגדרים שדה המקור הוא מהווה דרישה מוקדמת עבור טיפולים לב מבוססת תא ומודלים המחלה. אנחנו לאחרונה הראו כי מזהה גנים הדרושים והן מספיקות לציין אבות הראשון של שדה לב במהלך הפיתוח חוליות. פרוטוקול בידול זה ממנף את הממצאים הללו ומשתמש Id1 ביטוי בשילוב עם Activin כמו רמזים ציון חזק כדי לייצר הראשון הלב כמו שדה (FHF-L) אבות. חשוב, וכתוצאה מכך אבות להבדיל ביעילות (~ 70-90%) לתוך cardiomyocytes דמוי חדרית. כאן אנו מתארים שיטה מפורטת ליצירה 1) hPSCs Id1 overexpressing 2) להבדיל כמויות מדרגי של אבות FHF-L cryopreservable חדרית דמוי cardiomyocytes.

Introduction

ייצור בקנה מידה גדול של תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs)-נגזר לב אבות, cardiomyocytes זה מהווה דרישה מוקדמת עבור טיפולים מבוססי תאי גזע1, מחלת מידול2,3 ואפיון מהירה הרומן משעולים ויסות בידול לב4,5,6 , פיזיולוגיה7,8. למרות מספר מחקרים9,10,11,12,13,14,15 יש שתואר קודם לכן יעיל ביותר פרוטוקולים בידול לב hPSCs, אף אחד לא שלח המקור תחום הלב של cardiomyocytes וכתוצאה מכך, למרות הזיהוי של הבדלים משמעותיים מולקולרי בין שמאל (שדה הלב הראשון) ימינה (שדה הלב השני) cardiomyocytes חדרית16 וקיומו של הלב ספציפיים לשדה מחלות לב מולדים; קרי, שמאלי תסמונת17 או arrhythmogenic דיספלזיה חדרית18. לפיכך, הדור של לב אבות, cardiomyocytes ממוצא שדה מוגדר הלב של hPSCs הופך להיות הכרח כדי להגביר את הרלוונטיות שלהם כמו טיפולית ומחלות כלי מידול.

פרוטוקול זה מסתמך על ביטוי המכונן של Id1, שזוהה לאחרונה5 הראשון לב ציון שדה רמז אשר בשילוב עם Activin A, הן חיוני ומספיק ליזום cardiogenesis ב hPSCs. ראוי לציין, קנינגהם. et al. (2017) 5 מראים כי אבות Id1-induced במיוחד להביע בשדה הלב הראשון (HCN4, TBX5) אבל לא שני סמנים לב שדה (SIX2, ISL1) כפי הם עוברים התמיינות הלב. בנוסף, המחברים גם מראים כי עוברי העכבר הטרנסגניים חסר לכל המשפחה מזהה של גנים (Id14), לפתח ללא ויוצרים הראשון הלב שדה לב אבות, בזמן (אבות לב המדיאלי, אחורי נוסף לב השדה השני) יכולים ליצור עדיין, ובכך רומז כי מזהה חלבונים חיוניים ליזום הראשון הלב שדה cardiogenesis ויוו. בנוחות, אבות הנוצרות על-ידי Id1 יכול להיות cryopreserved, להבדיל באופן ספונטני לתוך cardiomyocytes הצגת מאפיינים כמו חדרית, כולל ביטוי סמנים ייחודיים חדרית (IRX4, MYL2), פוטנציאל פעולה כמו חדרית.

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה, וניתן להרחבה כדי ליצור הראשון הלב כמו שדה (FHF-L) אבות לב וחדרית דמוי cardiomyocytes מתוך Id1 overexpressing hPSCs. תכונה חשובה של פרוטוקול זה הוא האפשרות לנתק לב דור מייצור cardiomyocyte הבאים באמצעות צעד הקפאה קריוגנית נוח. לסיכום, פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הדרושים (1) ליצור hPSCs Id1 overexpressing (2) ליצור את אבות לב FHF-L מ- hPSCs, (3) cryopreserve אבות וכתוצאה מכך, (4) לחדש את הבידול לב FHF-L וצור מאוד מועשר (> 70-90%) להכות cardiomyocytes דמוי חדרית.

Protocol

1. Id1 וירוס והכנה זיהום צור Id1 lentivirus overexpressing על ידי שיתוף transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G, pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene: פלסמיד #107735) לתוך התאים HEK293T. לאסוף חלקיקי נגיפי, filtrate, לטהר מ תגובת שיקוע, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס כמו קיטאמורה. et al. (2003) 19. לחלופין, לייצר מסחרית Id1 lentivirus על-ידי שליחת pCDH-EF1-Id1-PGK-Puro…

Representative Results

דור של hPSCs Id1 קוויםhPSCs נגוע lentivirus תיווכה ביטוי Id1 (איור 1א’). ברגע hPSCId1 נוצרים, transgene ביטוי לכמת על ידי לרביעיית-PCR (איור 1B). רק hPSCId1 שורות לבטא Id1 mRNA ברמות גדול מ- 0.005 קיפול של <e…

Discussion

Differentiations מוצלח, ודא לעקוב מקרוב אחר ההוראות המפורטות לעיל. בנוסף, כאן אנחנו מדגישים פרמטרים מרכזיים אשר משפיעים מאוד על תוצאות בידול. לפני שמתחילים הבחנה, להתייחס הפרמטרים הבאים מורפולוגי שלושה: מורפולוגיה גזע של hPSCsId1, דחיסה גבוהה הסלולר ועל זרימה גבוהה (> 90%) של התרבות ביום 0. בהקשר הז…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים חברי המעבדה קולה לדיונים מועיל, ביקורות קריטי של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי NIH/NIEHS R44ES023521-02, CIRM DISC2-10110 מעניקה ד ר קולה.

Materials

ACTC1 antibody Sigma A7811
Activin A Stem Cell Technologies Hu Recom Activin A
Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) Thermo Fisher Scientific 15240062
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement w/o – insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
B27 supplement w/o – vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587001
CDH5 antibody R&D Systems AF938
CryoStor CS10 Stem Cell Technologies 7930 Cryopreservation reagent
DMEM high Glucose Mediatech 10-013-CV 
DPBS w/ Ca & Mg Corning 21-030-CV
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-038
FBS VWR 89510-186
FluoVolt membrane potential kit   Thermo Fisher Scientific F10488 For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Matrigel, Growth Factor Reduced Corning 356231 Coating reagent
mTeSR1 media kit Stem Cell Technologies 5850
PBS w/o Ca & Mg Corning 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Gibco
Puromycin  Acros 227422500
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Enzyme-free dissociation reagent
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
TAGLN antibody Abcam ab14106
Thiazovivin Stem Cell Technologies 72254 RHO/ROCK pathway inhibitor
TrypLE Express Thermo Fisher Scientific 12605 -010 1X enzyme-containing dissociation reagent
Tyrodes solution mix packets   Sigma T2145-10X1L (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017)

References

  1. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  2. Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
  3. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  4. Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
  5. Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
  6. McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).
  7. McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
  8. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
  9. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
  10. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
  13. Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
  14. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  15. Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
  16. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
  17. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
  18. Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
  19. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).

Play Video

Cite This Article
Yu, M. S., Spiering, S., Colas, A. R. Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57688, doi:10.3791/57688 (2018).

View Video