हृदय Progenitors और वेंट्रिकुलर की तरह पहले दिल क्षेत्र की पीढ़ी-मानव Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से Cardiomyocytes की तरह
Summary
यहाँ हम एक स्केलेबल विधि का वर्णन, Activin के एक सरल संयोजन का उपयोग कर एक और lentivirus-मध्यस्थता Id1-व्यक्त, पहले हृदय क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए-जैसे कार्डियक progenitors और वेंट्रिकुलर-cardiomyocytes की तरह मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से.
Abstract
कार्यात्मक मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं की बड़ी मात्रा की पीढ़ी-प्राप्त हृदय progenitors और परिभाषित दिल क्षेत्र मूल के cardiomyocytes एक पूर्व सेल के लिए अपेक्षित हृदय चिकित्सा और रोग मॉडलिंग आधारित है । हम हाल ही में पता चला है कि आईडी जीन दोनों आवश्यक है और हड्डीवाला विकास के दौरान पहली दिल क्षेत्र progenitors निर्दिष्ट पर्याप्त है । इस भेदभाव प्रोटोकॉल इन निष्कर्षों leverages और Activin के साथ संयोजन में Id1 का उपयोग करता है एक के रूप में शक्तिशाली cues निर्दिष्ट करने के लिए पहले दिल क्षेत्र की तरह उत्पादन (FHF-L) progenitors । महत्वपूर्ण बात, जिसके परिणामस्वरूप progenitors कुशलतापूर्वक अंतर (~ 70 – 90%) in वेंट्रिकुलर-like cardiomyocytes । यहाँ हम एक विस्तृत विधि का वर्णन करने के लिए 1) उत्पन्न Id1-एक्सप्रेस hPSCs और 2) cryopreservable FHF-L progenitors और वेंट्रिकुलर-जैसे cardiomyocytes की स्केलेबल मात्रा में अंतर.
Introduction
मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) के बड़े पैमाने पर उत्पादन-व्युत्पंन कार्डियक progenitors और cardiomyocytes एक पूर्व स्टेम कोशिका के लिए अपेक्षित चिकित्सा आधारित है1, रोग मॉडलिंग2,3 और तेजी के लक्षण वर्णन उपंयास हृदय विभेद को विनियमित रास्ते4,5,6 और फिजियोलॉजी7,8। हालांकि अध्ययन के एक नंबर9,10,11,12,13,14,15 पहले अत्यधिक कुशल बताया गया है hPSCs से हृदय भेदभाव प्रोटोकॉल, कोई नहीं जिसके परिणामस्वरूप cardiomyocytes के दिल क्षेत्र मूल को संबोधित किया है, के बीच महत्वपूर्ण आणविक मतभेदों की पहचान के बावजूद छोड़ दिया (पहले दिल क्षेत्र) और सही (दूसरा दिल क्षेत्र) वेंट्रिकुलर cardiomyocytes16 और हृदय क्षेत्र-विशिष्ट जन्मजात हृदय रोगों के अस्तित्व; यानी, hypoplastic लेफ्ट हार्ट सिंड्रोम17 या arrhythmogenic राइट वेंट्रिकुलर dysplasia18. इस प्रकार, हृदय progenitors और hPSCs से परिभाषित हृदय क्षेत्र मूल के cardiomyocytes की पीढ़ी के लिए चिकित्सीय और रोग मॉडलिंग उपकरण के रूप में उनकी प्रासंगिकता को बढ़ाने के लिए एक आवश्यकता होती जा रही है ।
इस प्रोटोकॉल Id1, एक हाल ही में पहचान की5 पहले दिल क्षेत्र के गठन पर निर्भर करता है-क्यू निर्दिष्ट है कि Activin के साथ संयोजन में, दोनों आवश्यक है और hPSCs में cardiogenesis आरंभ करने के लिए पर्याप्त है । विशेष रूप से, Cunningham एट अल । (२०१७) 5 दिखाएं कि Id1 प्रेरित progenitors विशेष रूप से व्यक्त पहले दिल क्षेत्र (HCN4, TBX5) लेकिन नहीं दूसरा दिल क्षेत्र मार्करों (SIX2, ISL1) के रूप में वे हृदय भेदभाव से गुजरना । इसके अलावा, लेखकों को भी पता चलता है कि ट्रांसजेनिक माउस के जीन की पूरी आईडी परिवार की कमी भ्रूण (Id1–4), पहले दिल क्षेत्र कार्डिएक progenitors बनाने के बिना विकसित, जबकि अधिक औसत दर्जे का और पीछे कार्डियक progenitors ( दूसरा दिल क्षेत्र) अभी भी फार्म कर सकते हैं, जिससे कि आईडी प्रोटीन vivo मेंपहली दिल क्षेत्र cardiogenesis आरंभ करने के लिए आवश्यक है सुझाव । आसानी से, Id1 प्रेरित progenitors cryopreserved जा सकता है और अनायास वेंट्रिकुलर-विशिष्ट मार्करों (वेंट्रिकुलर, IRX4) अभिव्यक्ति शामिल है और cardiomyocytes की तरह विशेषताओं को प्रदर्शित करने में अंतर, और वेंट्रिकुलर की तरह कार्रवाई क्षमता ।
यहां हम एक सरल और स्केलेबल विधि का वर्णन करने के लिए पहले दिल क्षेत्र की तरह उत्पंन (FHF-एल) कार्डिएक progenitors और वेंट्रिकुलर-Id1 से cardiomyocytes की तरह hPSCs व्यक्त । इस प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण विशेषता एक सुविधाजनक cryopreservation कदम का उपयोग कर बाद cardiomyocyte उत्पादन से कार्डियक जनक पीढ़ी को जोड़े करने की संभावना है । संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल विवरण के लिए आवश्यक कदम (1) उत्पंन Id1-एक्सप्रेस hPSCs, (2) उत्पंन FHF-L कार्डिएक progenitors से hPSCs, (3) cryopreserve परिणामस्वरूप progenitors, और (4) फिर से शुरू FHF-l कार्डिएक जनक विभेद और उत्पंन अत्यधिक समृद्ध (> 70-90%) वेंट्रिकुलर की तरह cardiomyocytes की धड़कन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सफल भेदभाव के लिए, बारीकी से ऊपर सूचीबद्ध निर्देशों का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें । इसके अलावा, यहां हम प्रमुख मापदंडों पर प्रकाश डाला है कि दृढ़ता से भेदभाव परिणाम प्रभाव । एक भेदभाव शुरू करने से ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उपयोगी चर्चा और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए कोला लैब के सदस्यों को धंयवाद । इस अध्ययन में NIH/NIEHS R44ES023521-02 और सीआईआरएम DISC2-10110 अनुदान के लिए डा. रखवाए द्वारा समर्थित था ।
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
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