Generasjon første hjertet felt-lignende Cardiac Progenitors og ventrikkel som Cardiomyocytes fra menneskelige Pluripotent stamceller
Summary
Her beskriver vi en skalerbar metode, bruke en enkel kombinasjon av Activin A og lentivirus-mediert Id1-overexpression, generere første hjertet felt-lignende cardiac progenitors og ventrikkel som cardiomyocytes fra menneskelige pluripotent stamceller.
Abstract
Generering av store mengder funksjonell menneskelige pluripotent stamceller-avledet cardiac progenitors og cardiomyocytes definert hjertet feltet Opprinnelsesland er en forutsetning for cellebasert cardiac terapier og sykdom modellering. Vi har nylig vist at Id gener er både nødvendig og tilstrekkelig til å angi første hjertet feltet progenitors under virveldyrenes utvikling. Denne differensieringen protokollen utnytter disse funnene og bruker Id1 overuttrykte i kombinasjon med Activin A som potent angir signaler for å produsere første hjertet felt-lignende (FHF-L) progenitors. Viktigere, skille resulterende progenitors effektivt (~ 70-90%) i ventrikkel-lignende cardiomyocytes. Her beskriver vi en detaljert metode 1) generere Id1-overexpressing hPSCs og 2) skille skalerbar mengder cryopreservable FHF-L progenitors og ventrikkel-lignende cardiomyocytes.
Introduction
Storskala produksjon av menneskelig pluripotent stamceller (hPSCs)-avledede cardiac progenitors og cardiomyocytes er en forutsetning for stilk cellen-basert behandling1, sykdom modellering2,3 og rask karakterisering av romanen trasé regulerer hjerte differensiering4,5,6 og fysiologi7,8. Selv om en rekke studier9,10,11,12,13,14har,15 tidligere beskrevet høyeffektive CARDIAC differensiering protokoller fra hPSCs, ingen har adressert hjertet feltet opprinnelsen til resulterende cardiomyocytes, til tross for identifikasjon av betydelige molekylær forskjeller mellom venstre (første hjertet feltet) og høyre (andre hjertet felt) ventrikkel cardiomyocytes16 og eksistensen av hjertet Feltspesifikke medfødte hjertesykdommer; dvs hypoplastic venstre hjertet syndrom17 eller arrhythmogenic høyre ventrikkel dysplasia18. Dermed generering av cardiac progenitors og cardiomyocytes definert hjertet feltet opprinnelse fra hPSCs er blitt en nødvendighet for å øke relevansen som terapeutiske og sykdom modellverktøy.
Denne protokollen er avhengig av den grunnleggende overuttrykte Id1, en nylig identifisert5 første hjertet feltet-angir bunke som i kombinasjon med Activin A, er både nødvendig og tilstrekkelig å starte cardiogenesis i hPSCs. Cunningham et al. spesielt (2017) 5 viser at Id1-indusert progenitors spesielt uttrykke første hjertet-feltet (HCN4, TBX5), men ikke andre hjertet feltet indikatorer (SIX2, ISL1) som de gjennomgå cardiac differensiering. I tillegg viser forfatterne at transgene mouse embryoer mangler hele Id familien av gener (Id1–4), utvikle uten forming første hjertet feltet cardiac progenitors, mens mer mediale og posterior cardiac progenitors ( andre hjertet feltet) kan fortsatt danne, og dermed antyder at Id proteiner er avgjørende å starte første hjertet feltet cardiogenesis i vivo. Praktisk, Id1-indusert progenitors kan være cryopreserved og differensiere spontant i cardiomyocytes vise ventrikkel-lignende egenskaper, inkludert ventrikkel-spesifikke indikatorer (IRX4, MYL2) uttrykk og ventrikkel-lignende handling potensialer.
Her beskriver vi en enkel og skalerbar metode for å generere første hjertet felt-lignende (FHF-L) cardiac progenitors og ventrikkel som cardiomyocytes fra Id1 overexpressing hPSCs. Et viktig trekk ved denne protokollen er muligheten til å uncouple hjerte stamfar generasjon fra påfølgende cardiomyocyte produksjonen ved hjelp av en praktisk kryonisk bevaring trinn. I sammendraget, denne protokollen detaljer de nødvendige skritt for å (1) generere Id1-overexpressing hPSCs, (2) generere FHF-L cardiac progenitors fra hPSCs, (3) cryopreserve resulterende progenitors og (4) fortsette FHF-L cardiac stamfar differensiering og generere høyanriket (> 70-90%) slo ventrikkel-lignende cardiomyocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
For vellykket atskillinger, må du nøye følge instruksjonene ovenfor. I tillegg markere her vi nøkkelparameterne som sterkt påvirker differensiering resultater. Før du starter en differensiering, følgende tre morfologiske parametere bør overholdes: en stilk morfologi av hPSCsId1, en høy mobilnettet komprimering og en høy samløpet (> 90%) av kultur på dag 0. I den forbindelse, optimal differensiering forhold er best laget av plating dissosiert hPSCsId1 som enkeltceller og tillate dem å da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av laboratoriet Colas nyttig diskusjoner og kritiske vurderinger av manuskriptet. Denne studien ble støttet av NIH/NIEHS R44ES023521-02 og CIRM DISC2-10110 gir Dr. Colas.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
References
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
- Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
- McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
- Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
- Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).
