إعداد وضع الأنسجة حاسة الشم الطرفية الجزيئية والتحليل المناعي في المورفولوجية
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للمرحلة وتشريح وضع الأنسجة حاسة الشم من الأنواع المورفولوجية . تشريح الأنسجة يمكن استخدامها في وقت لاحق للتحليلات الجزيئية، مثل كمية RT-PCR (عكس النسخ-البلمرة المتسلسل) أو الحمض النووي الريبي التسلسل (رناسيق)، فضلا عن التحليلات في فيفو مثل إيمونوهيستوتشيميستري أو في الموقع التهجين.
Abstract
نظام حاسة الشم المورفولوجية نظام يستخدم على نطاق واسع في بيولوجيا الأعصاب التنموي ونظم علم الأعصاب، وكذلك العصبية والسلوك وتطور السلوكية. بيت المورفولوجية حاسة الشم أنسجة الخلايا العصبية مستقبلات الشم (أورنس) التي كشف الإشارات الكيميائية المتطايرة بالإضافة إلى الخلايا العصبية الحسية الطاقة المائية والحرارية. في هذا البروتوكول، يصف لنا التشريح لتطوير النسيج حاسة الشم الطرفية من الأنواع المورفولوجية الكبار. أولاً نحن تصف كيفية المرحلة واليرقات المورفولوجية ، متبوعاً بتشريح القرص باللوامس من المراحل المبكرة الخوادر، متبوعاً بالتشريح للهوائيات من مراحل منتصف الخوادر والكبار في السن. نعرض أيضا الأساليب التي يمكن أن تستخدم في الأعمال التحضيرية في التقنيات الجزيئية، مثل استخراج الحمض النووي الريبي لبكر قرة أو رناسيق أو إيمونوهيستوتشيميستري. يمكن أيضا تطبيق هذه الأساليب للأنواع المورفولوجية الأخرى بعد يتم تحديد أوقات التنمية الخوادر إبلاغها، وتحسب كل المراحل للشيخوخة المناسبة.
Introduction
نظام حاسة الشم المورفولوجية نظام يستخدم على نطاق واسع في بيولوجيا الأعصاب التنموي ونظم علم الأعصاب، وكذلك العصبية ودراسات السلوك وتطور السلوكية1،2،3، 4. البيت المورفولوجية حاسة الشم أنسجة الخلايا العصبية مستقبلات الشم (أورنس) التي كشف الإشارات الكيميائية المتقلبة بالإضافة إلى5،1،الخلايا العصبية الحسية الطاقة المائية والحرارية6. والهدف العام من هذه المخطوطة شرح كيفية المرحلة وتشريح وضع الأنسجة حاسة الشم الخوادر والكبار في الأنواع المورفولوجية . والأساس المنطقي لهذا الأسلوب لتوليد عينات من مختلف مراحل الخوادر للتحليلات الجزيئية والإنمائية نظام حاسة الشم الطرفية، مثل رناسيق والكمية الرايت-بكر، بالإضافة إلى ذلك في فيفو الأنسجة وسم تقنيات . يمكن أن يكون هذا الأسلوب مفيداً بشكل خاص لتحديد القوى المحركة للملامح النسخي في تطوير نظام حاسة الشم الكبار من الأنواع غيرmelanogaster المورفولوجية ، والتي لا تملك جميع الكواشف المحورة وراثيا لنوع معين من الخلايا التالي والتحليلات. في هذه المخطوطة، نظهر كيفية تشريح أقراص باللوامس وهوائيات من الأنواع المورفولوجية الخوادر والكبار. أولاً، نحن إظهار كيفية تحديد المورفولوجية ح 0 لتشكيل بوباريوم (الإدارة العامة الاتحادية، الخوادر بيضاء أو بريبوباي) لانطلاق التنمية والشيخوخة إبلاغها. وبعد ذلك، نعرض كيفية تشريح أقراص باللوامس والجزء الثالث باللوامس؛ على وجه التحديد، كيف أن ننأى بها عن القرص العين والجزء الثاني باللوامس لنقاء الأنسجة المطلوبة من أجل رناسيق أو RT-تقارير إتمام المشروعات. مراحل melanogaster دال- المبينة في هذا البروتوكول على نحو يتوافق مع القرص باللوامس منقوشة مسبقاً (بريبوباي)، اختيار السلائف من باللوامس القرص (ح 8 APF)، بداية التفريق بين الطرفي أورنس (ح 40 الاتحادية)، و هوائي الكبار. وأخيراً، نعطي أمثلة عن RT-PCR كمي من هوائيات الكبار معزولة باستخدام الأسلوب، و في فيفو إيمونوهيستوتشيميستري. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتوليد عينات لتحليل الحمض النووي الريبي/الحمض النووي و immunohistochemistry على تطوير أنسجة حاسة الشم الطرفية من الأنواع المورفولوجية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول مورد مفيد لمختبرات المهتمة في تحديد البرامج الوراثية والنسخي العاملة في تطوير أنسجة حاسة الشم المورفولوجية ، فضلا عن إجراء تحليل مقارن لهذه البرامج عبر المورفولوجية الأنواع. أنها مفيدة بشكل خاص إذا كانت هناك حاجة ملامح نظم المستوى النسخي من مراحل إنمائية مختلفة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بمنحه من “مؤسسة العلوم الوطنية” إلى Pelin جيم فولكان (ديب-1457690).
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
References
- Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
- Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).
- Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
- Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
- Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
- Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).
- Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
- Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).
- Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).
- Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
- Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).
