Summary

Vorbereitung, Entwicklung von peripheren olfaktorische Gewebe für Molekulare und immunhistochemische Analysen in Drosophila

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bühne und sezieren, olfaktorische Gewebe von Drosophila -Arten zu entwickeln. Das sezierte Gewebe kann später für Molekulare Analysen, wie quantitative RT-PCR (Reverse Transkription-Polymerase Chain Reaction) oder RNA Sequenzierung (RNAseq), sowie in-Vivo -Analysen wie Immunohistochemistry oder in Situ verwendet werden Hybridisierung.

Abstract

Das olfaktorische System von Drosophila ist ein weit verbreitetes System in Entwicklungsneurobiologie, Systeme Neurowissenschaften sowie Neurophysiologie, Verhalten und Verhaltensstörungen Evolution. Drosophila olfaktorische Gewebe beherbergen die olfaktorischen Rezeptor Neuronen (ORNs), die flüchtigen chemischen Signale neben Hydro und Thermo-sensorischen Neuronen zu erkennen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Zerlegung des peripheren olfaktorische Gewebe von Erwachsenen Drosophila -Arten zu entwickeln. Wir beschreiben zuerst zu inszenieren und Drosophila Larven, gefolgt von der Dissektion der riechzentrum Scheibe aus frühen pupal Stadien, gefolgt von der Dissektion der Antennen ab Mitte pupal Stadien und Erwachsene Alter. Wir zeigen auch Methoden wo Vorbereitungen können Molekulare Techniken, wie die RNA-Extraktion für qRT-PCR, RNAseq oder Immunhistochemie eingesetzt werden. Diese Methoden können auch auf andere Drosophila -Arten angewendet werden, nachdem artspezifische pupal Entwicklungszeiten bestimmt sind und jeweiligen Etappen sind für entsprechende Aging berechnet.

Introduction

Das olfaktorische System der Drosophila ist verbreitetes System in Entwicklungsneurobiologie, Systeme Neurowissenschaften sowie Neurophysiologie Verhalten Studien und Verhaltensstörungen Evolution1,2,3, 4. Drosophila olfaktorische Gewebe beherbergen die olfaktorischen Rezeptor Neuronen (ORNs), die flüchtigen chemischen Signale neben Hydro und Thermo-sensorischen Neuronen1,5,6zu erkennen. Das übergeordnete Ziel dieser Handschrift soll veranschaulichen, wie Bühne und sezieren pupal und Erwachsenen olfaktorische Gewebe in Drosophila -Arten zu entwickeln. Die Gründe für diese Technik ist es, Proben von verschiedenen pupal Stadien für Entwicklungsbiologie und Molekulare Analysen des peripheren olfaktorischen Systems, wie RNAseq und quantitative RT-PCR, zusätzlich zu in Vivo Gewebe Kennzeichnung Techniken erzeugt . Diese Technik ist besonders hilfreich zur Dynamik der transcriptional Profile im entwickelnden Erwachsenen olfaktorischen System von nicht-Drosophila Melanogaster Spezies zu identifizieren, die nicht über die transgenen Reagenzien für Zelltyp spezifische verfügen Kennzeichnung und Analysen. In diesem Manuskript demonstrieren wir riechzentrum Scheiben und Antennen von pupal und Erwachsenen Drosophila -Arten zu sezieren. Zunächst zeigen wir wie Drosophila 0 h der puppenkammer Formation (APF, weißen Puppen oder Prepupae) für Entwicklungsstörungen Inszenierung und artspezifische Alterung zu identifizieren. Als Nächstes zeigen wir wie Sie riechzentrum Scheiben und das dritte riechzentrum Segment zergliedern; speziell, wie man sie von Auge Scheibe und zweite riechzentrum Segment für die Gewebe-Reinheit erforderlich für RNAseq oder RT-PCR zu distanzieren. Die Stadien in D. Melanogaster beschrieben in diesem Protokoll etwa entsprechen die Pre-gemusterten riechzentrum Scheibe (Prepupae), die Auswahl von Vorläufern aus dem riechzentrum disc (8 h APF), Beginn der terminal Differenzierung für ORNs (40 h APF), und Erwachsenen-Antenne. Zu guter Letzt geben wir Beispiele für eine quantitative RT-PCR von Erwachsenen Antennen isoliert mit der Methode und für in Vivo Immunohistochemistry. Diese Methode kann verwendet werden, um Proben für eine RNA/DNA-Analyse und Immunohistochemistry auf die Entwicklung von peripherer olfaktorischer Gewebes von Drosophila -Arten zu generieren.

Protocol

Das folgende Protokoll steht im Einklang mit der Ethikrichtlinien von der Duke University Research Ethikkommission. (1) Gewebe Vorbereitung und Entwicklungsstörungen Inszenierung von Drosophila Melanogaster Puppe Zunächst ermitteln Sie, wie viele fliegen die Dissektion erforderlich ist. Für RT-PCR und RNAseq sammeln Sie 100-200 riechzentrum Scheiben und Antennen von Einzelpersonen, die auf prepupal, 8 h APF, 40 h APF, und Erwachsenen Phasen notwendig sind. Immunohistochem…

Representative Results

Die sezierte entwickelnde olfaktorische Gewebe kann für die RNA-Extraktion, gefolgt von RT-PCR verwendet werden, um die Genexpression zu beurteilen oder kann durch Immunohistochemistry Protokolle zu bestimmen, die Muster des Ausdrucks und der subzellulären Lokalisierung der Gene eingenommen werden Interesse. In diesem Abschnitt präsentieren wir Ihnen repräsentative Ergebnisse aus beiden Protokoll. Abbildung 1 ist der Vertreter quantitative RT-PCR die Tran…

Discussion

Dieses Protokoll ist eine nützliche Ressource für Labs interessiert bei der Identifizierung der genetischen und transkriptionelle Programme bei der Entwicklung von Drosophila olfaktorische Gewebe sowie eine vergleichende Analyse dieser Programme in Drosophila Spezies. Es ist besonders nützlich, wenn Systemebene transcriptional Profile aus verschiedenen Entwicklungsstadien als Grundierung für zukünftige Studien erforderlich sind. Das hier beschriebene Protokoll veranschaulicht zu inszenieren und zu …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch ein Stipendium der National Science Foundation, Pelin C. Volkan (DEB-1457690).

Materials

10X Phosphate-buffered Saline Gibco 70011-044 Dilute to 1X in RNase free water
CO2 tank Air Gas CD R200
Two sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA isolation solutions
Dissecting Microscope
Small bucket with ice
P20 and P200 micropipettes and tips
1.7 mL Microfuge tubes Purchase nuclease free for best results
0.2 mL PCR tubes
Paraformaldehyde powder Polysciences 380
10% Triton X-100 Teknova T1105 Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS
2" petri dishes
55mm filter paper Whatman 1001-055 Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist
25 C incubator
deionized H2O Purchase nuclease free or treat with DEPC
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.
MicroWell Mini Trays with lids Nunc 438733 Lids can be used to make silicone dissection pads
Rabbit anti-GFP antibody MBL international corpor PM005 primary antibody
Mouse anti RAT CD2 AbD seroTec MCA154RHDL primary antibody
ADL195 (anti lamin, mouse) Dev studies hydoma ban ADL195-s primary antibody
Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) invitrogen A11008 Secondary antibody
Cy3 Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-166-003 Secondary antibody
Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered CALBIOCHEM 648463 detergent
Lab Rotator Thermo scientific Rotator
Nuclease Free Water Growcells.com NUPW-0125 Water
Light-Duty Tissue Wipers VWR 82003-822 For cleaning dissection supplies
Superscript II invitrogen 18064014 Reverse Transcriptase 
QIAshredder (50) RNA extraction QIAGEN 79654
Oligo(dT)12-18 Primer RT life technologies 18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) RNA extraction QIAGEN 74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) qPCR Roche 04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER  qPCR Roche 06402712001
LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 qPCR Roche 04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix qPCR NEB M0541S

References

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Cite This Article
Barish, S., Volkan, P. C. Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila. J. Vis. Exp. (136), e57716, doi:10.3791/57716 (2018).

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