Подготовка, развитие периферийных обонятельных ткани для молекулярной и Иммуногистохимический анализ у дрозофилы
Summary
Здесь мы представляем протокол к сцене и проанализируем развитие обоняния ткани от дрозофилы видов. Иссеченную ткань могут затем использоваться для молекулярного анализа, например количественного RT-PCR (обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции) или РНК последовательности (RNAseq), а также в естественных условиях анализ таких иммуногистохимия или на месте гибридизации.
Abstract
Обонятельная сенсорная система дрозофилы является широко используемой системой развития нейробиологии, систем неврологии, а также нейрофизиологии, поведения и поведенческих эволюции. Дрозофилы обонятельных тканей дом обонятельных рецепторов нейронов (ORNs), которые обнаруживают летучие химические сигналы наряду с гидро – и термо сенсорных нейронов. В этом протоколе мы описываем рассечение развития периферической обонятельных ткани взрослых видов дрозофилы . Мы сначала описывается этап и возраста личинок дрозофилы , следуют рассечение усиков диска от ранней стадии куколки, следуют рассечение антенн от середины куколки этапов и взрослых. Мы также показать методы, где препараты могут быть использованы в молекулярные методы, такие как извлечение RNA qRT-PCR, RNAseq или иммуногистохимия. Эти методы могут также применяться другие Drosophila видов после раз вегетационных куколки развития определяются, и соответствующих этапов рассчитывается для соответствующего старения.
Introduction
Обонятельная сенсорная система дрозофилы является широко используемой системой развития нейробиологии, неврологии систем, а также нейрофизиологии, исследования поведения и поведенческих эволюция1,2,3, 4. Дрозофилы обонятельных тканей дом обонятельных рецепторов нейронов (ORNs), которые обнаруживают летучие химические сигналы наряду с гидро – и термо Сенсорные нейроны1,5,6. Общая цель этой рукописи должна продемонстрировать как этап и вскрыть развивающихся куколки и взрослых обонятельных ткани у дрозофилы видов. Обоснование этой техники заключается в создании образцов из различных куколки этапов для молекулярной и развития анализ периферической обонятельной системы, такие как RNAseq и количественного RT-PCR, кроме в vivo ткани маркировки методы . Этот метод может быть особенно полезно для выявления динамики транскрипционный анализ профиля в системе развивающихся взрослых обонятельных от не –melanogaster Drosophila видов, которые не имеют всех трансгенных реагенты для определенного типа клеток маркировка и анализы. В этой рукописи мы продемонстрируем вскрыть усиков дисков и антенн от видов дрозофилы куколки и взрослых. Во-первых мы покажем, как определить 0 h формирования puparium (АТФ, белые куколки или prepupae) для развития промежуточной и поставляемому старения дрозофилы . Далее мы покажем, как вскрыть усиков диски и третий усиков сегмент; в частности как отделить их от глаз диска и второй усиков сегмент для чистоты ткани, необходимые для RNAseq или RT-PCR. Этапы в D. melanogaster , указанных в настоящем Протоколе примерно соответствуют предварительно узорной усиков диск (prepupae), выбор прекурсоров из усиков диск (8 h НФА), начало дифференцировки терминала для ORNs (40 h НФА), и Взрослый антенна. Наконец мы даем примеры для количественного RT-PCR от взрослых антенн, изоляции с помощью метода, а для иммуногистохимии в естественных условиях . Этот метод может использоваться для создания образцов для анализа РНК/ДНК и иммуногистохимии на развитие периферийных обонятельных тканей из различных видов дрозофилы .
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол является полезным ресурсом для лабораторий, заинтересованных в поиске генетические и транскрипционный анализ программ, действующих в развивающихся дрозофилы обонятельных ткани, а также сравнительный анализ этих программ через дрозофилы видов. Это особенно по…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грант от национального научного фонда для Pelin C. Volkan (DEB-1457690).
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
References
- Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
- Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).
- Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
- Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
- Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
- Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).
- Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
- Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).
- Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).
- Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
- Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).
