जल्दी जन्मोत्तर माउस दिमाग में न्यूरॉन अग्रदूतों के Homochronic ट्रांसप्लांटेशन
Summary
नए मस्तिष्क क्षेत्रों में युवा ंयूरॉंस को चुनौती देने में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रकट कर सकते है कैसे वातावरण ंयूरॉन भाग्य और परिपक्वता । इस प्रोटोकॉल एक प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों से ंयूरॉन अग्रदूतों फसल और उंहें या तो homotopically या heterotopically जन्मोत्तर पिल्ले के मस्तिष्क में प्रत्यारोपण ।
Abstract
ंयूरॉन भाग्य दृढ़ संकल्प और परिपक्वता आनुवंशिक कार्यक्रमों और पर्यावरण संकेतों के बीच एक जटिल पुनरावृत्ति की आवश्यकता है । हालांकि, आंतरिक बनाम बाह्य तंत्र है कि इस भेदभाव की प्रक्रिया को विनियमित की भूमिकाएं विरूद्ध सभी विकासात्मक neurobiologists के लिए एक पहेली है । इस मुद्दे GABAergic ंयूरॉंस के लिए बढ़ाया है, एक अविश्वसनीय रूप से विषम कोशिका आबादी है कि क्षणिक भ्रूण संरचनाओं से पैदा होता है और एक लंबी प्रवासी दौर से गुजरना telencephalon भर में फैलाने के लिए । कैसे अलग मस्तिष्क वातावरण न्यूरॉन भाग्य और परिपक्वता को प्रभावित करने का पता लगाने के लिए, हम फ्लोरोसेंट में नवजात चूहों (P0-P2) विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों से अपरिपक्व ंयूरॉन के अग्रदूतों लेबल कटाई के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है । इस उम्र में, न्यूरॉन प्रवास लगभग पूरा हो गया है और इन कोशिकाओं को अपेक्षाकृत कम synaptic एकीकरण के साथ अपने अंतिम विश्राम के वातावरण में रह रहे हैं. फ्लो cytometry के माध्यम से एकल कोशिका समाधान के बाद संग्रह, इन न्यूरॉन पुरोगामी P0-P2 wildtype जन्मोत्तर पिल्ले में प्रत्यारोपित कर रहे हैं. दोनों homotopic प्रदर्शन करके (जैसे, प्रांतस्था-to-प्रांतस्था) या heterotopic (जैसे, प्रांतस्था-to-हिप्पोकैम्पस) प्रत्यारोपण, एक का आकलन कर सकते हैं कैसे चुनौतीपूर्ण नए मस्तिष्क वातावरण में अपरिपक्व न्यूरॉन्स उनके भाग्य को प्रभावित करता है, परिपक्वता, और सर्किट एकीकरण. दिमाग वयस्क चूहों में काटा जा सकता है और immunohistochemical, electrophysiological और transcriptional profiling सहित, भ्रष्टाचारी कोशिकाओं पर posthoc विश्लेषण की एक विस्तृत विविधता के साथ परख की । यह सामांय दृष्टिकोण परख कैसे अलग मस्तिष्क वातावरण ंयूरॉन विकास के कई पहलुओं को प्रभावित कर सकते है और अगर विशिष्ट ंयूरॉंस विशेषताओं मुख्य रूप से hardwired आनुवंशिक कार्यक्रमों द्वारा संचालित कर रहे है की पहचान के लिए एक रणनीति के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है या पर्यावरणीय cues ।
Introduction
उचित cortical समारोह उत्तेजक प्रक्षेपण ंयूरॉंस और निरोधात्मक GABAergic न्यूरॉन्स, विशिष्ट morphologies, electrophysiological गुण, संपर्क और neurochemical के साथ एक अत्यंत विषम जनसंख्या के बीच एक संतुलन की आवश्यकता है मार्करों. असामान्य विकास और न्यूरॉन्स के समारोह (और विशिष्ट न्यूरॉन उपसमूहों) इस तरह के एक प्रकार का पागलपन के रूप में मनोरोग विकारों के pathobiology से जोड़ा गया है, आत्मकेंद्रित और मिर्गी1,2,3. इसके अलावा, इन मस्तिष्क विकारों में फंसा कई जीन दृढ़ता से युवा ंयूरॉंस में समृद्ध कर रहे है4। इस प्रकार, तंत्र की एक बड़ी समझ है कि ंयूरॉन भाग्य निर्धारण और परिपक्वता को विनियमित करने के लिए सामांय विकास और कई मस्तिष्क रोगों के संभावित etiologies समझ की जरूरत है ।
Forebrain न्यूरॉन्स मुख्य रूप से दो क्षणिक भ्रूण संरचनाओं से पैदा होते हैं, औसत दर्जे का और caudal ganglionic eminences (MGE और CGE, क्रमशः). इन postmitotic कोशिकाओं (न्यूरॉन पुरोगामी) तो एक लंबी telencephalon भर में फैलाने के लिए जहां वे सर्किट की एक विस्तृत विविधता में एकीकृत से गुजरना स्पर्श प्रवास के चरण से गुज़रना । MGE-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स तीन बड़े पैमाने पर गैर अतिव्यापी, neurochemically परिभाषित उपसमूह से मिलकर बनता है: फास्ट spiking parvalbumin (पीवी+) न्यूरॉन्स, गैर तेजी से spiking सोमेटोस्टैटिन (एसएसटी+) न्यूरॉन्स, और देर से spiking न्यूरॉन्स नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (nNOS+) न्यूरॉन्स कि हिप्पोकैम्पस neurogliaform और आइवी कोशिकाओं का गठन. कई प्रयोगशालाओं MGE के भीतर कई तंत्र की पहचान की है कि PV+ या एसएसटी में प्रारंभिक भाग्य फैसलों को विनियमित + न्यूरॉन्स, morphogens के स्थानिक ढाल सहित, न्यूरॉन पुरोगामी की जन्मतिथि, और तंत्रिकाजन्य विभाजन के मोड 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. यह प्रस्तावित किया गया है कि न्यूरॉन्स शुरू में ‘ कार्डिनल वर्गों ‘ में अंतर और फिर उत्तरोत्तर ‘ निश्चित वर्गों ‘ में परिपक्व के रूप में वे अपने11पर्यावरण के साथ बातचीत. हाल ही में सबूत इंगित करता है कि कुछ परिपक्व न्यूरॉन उपप्रकार आनुवंशिक रूप से hardwired के रूप में इन कोशिकाओं ganglionic eminences में postmitotic हो सकता है, यह दर्शाता है कि जल्दी परिभाषित आंतरिक आनुवंशिक कार्यक्रमों से पहले एक बड़ी भूमिका निभा सकता है 12,13की सराहना की । हालांकि, कैसे आंतरिक आनुवंशिक कार्यक्रमों पर्यावरण cues के साथ बातचीत करने के लिए अलग न्यूरॉन उपप्रकार में भेदभाव ड्राइव के प्रमुख सवाल काफी हद तक बेरोज़गार रहता है ।
कई अध्ययनों से भ्रूण MGE कोशिकाओं प्रत्यारोपण किया है सीधे मस्तिष्क क्षेत्रों की एक किस्म में, आम सहमति परिणामों के साथ कि भ्रष्टाचारी कोशिकाओं परिपक्व और रिलीज गाबा आम तौर पर स्थानीय अंतर्जात सर्किट को बाधित करने के लिए14,15, 16,17,18,19. इन आशाजनक टिप्पणियों ने मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hIPSC) का उपयोग करने में महत्वपूर्ण रुचि उत्पन्न की है-मस्तिष्क रोगों की एक किस्म का इलाज करने के लिए न्यूरॉन्स व्युत्पंन. हालांकि, इन अध्ययनों से बहुत कुछ अगर इन भ्रष्टाचारी कोशिकाओं परिपक्व न्यूरॉन्स, एक महत्वपूर्ण घटक है जब एक शोधों के दृष्टिकोण के बारे में सोचता है की उंमीद प्रकार में परिपक्व का आकलन ।
पता करने के लिए कैसे पर्यावरण ंयूरॉन भेदभाव और परिपक्वता को प्रभावित करता है, एक रणनीति को नए दिमाग के वातावरण में अपरिपक्व ंयूरॉन अग्रदूतों प्रत्यारोपण के लिए तैयार किया गया था ताकि जांच के लिए कि भ्रष्टाचारी न्यूरॉन्स मेजबान की सुविधाओं को अपनाने पर्यावरण या दाता पर्यावरण20से सुविधाओं को बनाए रखने । MGE प्रत्यारोपण उपयुक्त इस सवाल का पता नहीं है क्योंकि MGE ंयूरॉन और GABAergic प्रक्षेपण कोशिकाओं है कि कई मस्तिष्क क्षेत्रों21भर में फैलाने की एक मिश्रित जनसंख्या शामिल हैं । जाने बिना जहां इन MGE कोशिकाओं चले गए होंगे, एक पूरी तरह से आकलन नहीं कर सकते है कि कैसे इन प्रत्यारोपण मस्तिष्क पर्यावरण से प्रभावित हैं । जल्दी जन्मोत्तर timepoints में न्यूरॉन पुरोगामी की कटाई करके, इस समस्या को अपरिपक्व कोशिकाओं है कि उनके प्रवास को पूरा कर लिया है और उनके लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र पर पहुंच गया है, लेकिन पर्यावरण के साथ ंयूनतम बातचीत प्राप्त करने से दरकिनार कर दिया है । अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच अंतर व्यक्त कर रहे हैं कि न्यूरॉन्स की विशिष्ट सुविधाओं पर ध्यान केंद्रित करके, एक तो यह निर्धारित कर सकते हैं कि कैसे मेजबान वातावरण न्यूरॉन गुण बदलता है. सामांय दृष्टिकोण इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित किसी भी अंवेषक है कि कैसे युवा ंयूरॉंस व्यवहार जब एक नए वातावरण में चुनौती दी जांच करना चाहता है के लिए लागू होना चाहिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू कोशिकाओं के जीवित रहने को अधिकतम है । यह सुनिश्चित करना है कि ऊतक और कोशिकाओं बर्फ ठंड carboxygenated sACSF में हमेशा के लिए सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक है । इस समय की…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (K99MH104595) और niched अंदर अनुसंधान T.J.P. को कार्यक्रम द्वारा समर्थित था हम Gord Fishell, जिनकी प्रयोगशाला में इस दृष्टिकोण मूल रूप से स्थापित किया गया था धंयवाद ।
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
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