Summary
Uitdagende jonge neuronen in nieuwe hersengebieden kan het onthullen van belangrijke inzichten in hoe het milieu neuronale lot en rijping beeldhouwt. Dit protocol beschrijft een procedure om de oogst interneuron precursoren van specifieke hersengebieden en verplant ze ofwel homotopically of heterotopically in de hersenen van postnatale pups.
Abstract
Vereist een ingewikkelde interactie tussen genetische programma's en Milieusignalen neuronale lot vastberadenheid en rijping. Ontwarren van de rollen van intrinsieke vs. extrinsieke mechanismen die deze differentiatie proces regelen is echter een raadsel voor alle ontwikkelingsstoornissen neurobiologists. Dit probleem is vergroot voor GABAergic interneuronen, een ongelooflijk heterogene celpopulatie dat is geboren uit voorbijgaande embryonale structuren en ondergaan een langdurige trekkende fase te verspreiden in de telencephalon. Om te ontdekken hoe verschillende hersenen omgevingen beïnvloeden interneuron lot en rijping, ontwikkelden we een protocol voor het oogsten van fluorescently geëtiketteerde onvolwassen interneuron precursoren van specifieke hersengebieden bij pasgeboren muizen (P0-P2). Op deze leeftijd, interneuron migratie is bijna voltooid en deze cellen zijn die woonachtig zijn in hun laatste rustplaats omgevingen met relatief weinig synaptic integratie. Na inzameling van eencellige oplossingen via stroom cytometry, deze interneuron precursoren in P0-P2 wildtype postnatale pups worden getransplanteerd. Door het uitvoeren van beide homotoop (bijvoorbeeld cortex-naar-cortex) of heterotopic (bijvoorbeeld cortex-naar-hippocampus) transplantaties, men kan beoordelen hoe het uitdagende onvolwassen interneuronen in nieuwe omgevingen van de hersenen van invloed is op het hun lot, rijping en integratie van het circuit. Hersenen kunnen worden geoogst in volwassen muizen en vehiculumcontrolegroep met een breed scala aan posthoc analyse op geënte cellen, met inbegrip van immunohistochemical, elektrofysiologische en transcriptionele profilering. Deze algemene aanpak biedt onderzoekers met een strategie voor de gehaltebepaling van hoe verschillende omgevingen: hersenen kunnen invloed hebben op tal van aspecten van neuron ontwikkeling en identificeren als neuronale specificiteit voornamelijk door hardwired genetische programma's gedreven worden of de signalen van het milieu.
Introduction
Corticale werking vereist een evenwicht tussen excitatory projectie neuronen en remmende GABAergic interneuronen, een uiterst heterogene populatie met verschillende morphologies, elektrofysiologische eigenschappen, connectiviteit en neurochemical markeringen. Abnormale ontwikkeling en functie van interneuronen (en specifieke interneuron subgroepen) is gekoppeld aan de pathobiology van psychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie, autisme en epilepsie1,2,3. Bovendien zijn vele genen betrokken bij deze hersenafwijkingen sterk verrijkt met jonge interneuronen4. Dus is een groter inzicht in de mechanismen die interneuron lot vastberadenheid en rijping regelen nodig om te begrijpen van de normale ontwikkeling en potentiële etiologie van talrijke hersenziekten.
Reukkolf interneuronen zijn geboren voornamelijk uit twee voorbijgaande embryonale structuren, de mediale en caudal ganglionaire eminenties (MGE en CGE, respectievelijk). Deze postmitotic cellen (interneuron precursoren) dan het ondergaan van een migratiefase van de langdurige tangentiële te verspreiden in de telencephalon waar ze integreren in een breed scala aan circuits. MGE afkomstige interneuronen bestaan uit drie grotendeels niet-overlappende, neurochemically gedefinieerde subgroepen: snel stekelige parvalbumin (PV+) interneuronen, niet-fast stekelige interneuronen Somatostatine (SST+), en laat stekelige neuronale nitraatstikstof oxide synthase (nNOS+) interneuronen die hippocampal neurogliaform en ivy cellen vormen. Talrijke labs hebben verschillende mechanismen binnen de MGE die eerste lot besluiten in PV+ of SST + interneuronen, met inbegrip van ruimtelijke gradiënten van morphogens, geboortedatum van interneuron precursoren, en de wijze van neurogene divisie regelen vastgesteld 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. er is voorgesteld dat interneuronen aanvankelijk in 'kardinaal klassen onderscheiden' en vervolgens geleidelijk in 'definitieve klassen' rijpen als ze met hun omgeving-11 interageren. Recente gegevens blijkt dat sommige volwassen interneuron subtypen genetisch hardwired wellicht deze cellen naarmate postmitotic in de ganglionaire eminenties, die aangeeft dat de vroege gedefinieerde intrinsieke genetische programma's een grotere rol dan voorheen kunnen spelen gewaardeerd12,13. De belangrijke vraag hoe de intrinsieke genetische programma's met milieu aanwijzingen naar station differentiatie in verschillende interneuron subtypen communiceren blijft echter grotendeels onontgonnen.
Talrijke studies hebben getransplanteerde embryonale MGE cellen rechtstreeks in een verscheidenheid van hersengebieden, met de resultaten van de consensus die geënt van cellen volwassen en vrijgeven van GABA te remmen in het algemeen de lokale endogene circuit14,15, 16,17,18,19. Deze waarnemingen veelbelovend hebben gegenereerd significant belang in het gebruik van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hIPSC)-afgeleid van interneuronen voor de behandeling van een verscheidenheid van hersenziekten. Nochtans, zeer weinigen van deze studies beoordelen als deze geënte cellen in de verwachte soorten rijpe interneuronen rijpen, een kritische component wanneer men denkt over translationeel benaderingen.
Om aan te pakken hoe milieu invloeden interneuron differentiatie en rijping, werd een strategie ontworpen om de transplantatie van onrijpe interneuron precursoren in nieuwe omgevingen van de hersenen om te onderzoeken of geënte interneuronen kenmerken van de host nemen milieu of functies van de donor milieu20behouden. MGE transplantaties zijn niet geschikt om aan te pakken van deze vraag, omdat de MGE bevat een gemengde bevolking van interneuron en GABAergic projectie cellen dat in talrijke regio's van de hersenen21 dispergeren. Zonder te weten waar deze MGE cellen zou zijn gemigreerd, kan men niet volledig beoordelen hoe deze transplantaties worden beïnvloed door het milieu van de hersenen. Door interneuron precursoren op vroege postnatale timepoints te oogsten, wordt dit probleem omzeild door het verkrijgen van onrijpe cellen die hebben hun migratie voltooid en hun doel bereikt brain regio maar hebben minimale interactie met de omgeving. Door te focussen op specifieke kenmerken van interneuronen die differentieel tussen verschillende hersengebieden worden uitgedrukt, kan men vervolgens bepalen hoe de hostomgeving interneuron eigenschappen verandert. De algemene aanpak in dit protocol dient te gelden tot een onderzoeker dat wil onderzoeken hoe jonge neuronen zich wanneer gedragen uitgedaagd in een nieuwe omgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de National Institutes of Health en door de NICHD Animal Care en gebruik Comité (ACUC) zijn goedgekeurd. Het hieronder beschreven protocol maakt gebruik van Nkx2.1-CreC / +; Ai9+/- pups om te oogsten MGE afkomstige interneuron precursoren, maar kan op elke gewenste fluorescerende verslaggever muis lijn worden uitgevoerd. Zowel mannelijke als vrouwelijke vroege postnatale muizen (P0-P2) werden lukraak gebruikt voor donor en gastheer weefsel.
1. oplossing voorbereiding
- Bereiden van sacharose kunstmatige cerebrospinale vloeistof (sACSF) volgens het volgende recept (eenheid in mM): 87 NaCl, 26 NaHCO3, 2.5 KCl 1,25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 glucose, 75 sacharose verzadigd met 95% O 2, 5% CO2 bij pH = 7.4.
- Opvulling in een bekerglas met 350 mL pure ddH2O op basis van de gewenste eindvolume (500 mL sACSF zou voldoende moeten zijn voor 1-2 nesten), voeg een magnetische roer bar en plaats het bekerglas op de plaat van de roer.
- Alle de zouten (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4, glucose, sacharose), een op het moment van het gewicht en voeg toe aan het water volgens de onderstaande tabel. Bedragen kunnen worden aangepast afhankelijk van de gewenste eindvolume.
Reagens Moleculair gewicht Concentratie (mM) Gram/500 mL Natriumchloride 58.44 87 2,54 Natriumbicarbonaat 84.01 26 1.09 Kaliumchloride 74.55 2.5 0.09 Natriumfosfaat monobasisch 119.98 1,25 0.08 Glucose 180.16 10 0.9 Sacharose 342.3 75 12,84 - Bubble de oplossing met 95% O2, 5% CO2 (carboxygen) voor ten minste 20-30 minuten voordat u toevoegt de juiste hoeveelheid CaCl2 (0,25 mL van een oplossing van 1 M voor 500 mL sACSF) en MgCl2 (3,5 mL van een oplossing van 1 M voor 500 mL sACSF) .
- Controleer de pH met behulp van een standaard pH-meter. Als correct heb voorbereid, de oplossing moet pH = 7.4.
- Breng de oplossing aan eindvolume van 500 mL met zuivere ddH2O in een gegradueerde cilinder.
- sACSF kan worden bereid tot 1-2 dagen vooruit. Vóór gebruik, plaats op ijs bubble met carboxygen voor ten minste 15 minuten voor aanvang van de dissectie en de fles sACSF borrelen in de dissectie houden.
2. dissectie voorbereiding
- De volgende hulpprogramma's moet gesteriliseerd/gesteriliseerde met autoclaaf: ten minste één kleine fijne scherpe schaar, 2 fijne pincet (stijl #5), gebogen fijne pincet, hersenen afdelen matrice schimmel en verschillende Scheermesjes. Een kleine spatel om de hersenen van de schedel is optioneel.
- Opzetten van de werkplek in de buurt van dissectie microscopen met petrischalen (9 cm en 4 cm diameter), 50 mL conische plastic buizen voor het verzamelen van de geïsoleerde hersengebieden en grote boring kunststof overdracht pipetten, alle gehouden op ijs. Meerdere 50 mL buizen vol carboxygenated sACSF op ijs bereiden. Als meer dan één regio van de hersenen te ontleden, zorg ervoor dat u goed en duidelijk etiket zowel de collectie buizen en de overdracht pipetten om verontreiniging te voorkomen.
- Hebben een extra ijsemmer voor ijs anesthesie van pups via hypothermie, en een juiste gevaarlijk afval zak te ontdoen van karkassen.
- Brand-gepolijst glas die Pasteur pipettes voorbereiden door verpulvering van het weefsel. Gebruik een bunsenbrander te steriliseren en vorm van het uiteinde van de pipet. Bereiden van verschillende pipetten met verschillende boring openingen: grote (~ 600 µm), medium (~ 300 µm) en kleine (~ 100 µm). Testen van stroom door middel van tips met behulp van water om verschillende verpulvering snelheden. Ten minste één Pipet van elke soort is nodig voor elke regio geïsoleerde hersenen, maar hebben verschillende extra voor elke grootte wordt aanbevolen in geval van verstopping of door het breken van de tips.
3. transplantatie voorbereiding
- De trekker van een elektrode te bereiden boete-tipped glas micropipetten gebruiken Breken of schuine rand de tip om een scherpe schuine punt, te maken met de tip met een diameter van ~ 20-40 µm. Inspecteer visueel of de uiteinden met een microscoop om ervoor te zorgen dat geen stof of residuele glas deeltjes zijn het belemmeren van het diafragma.
- De glazen micropipet met een fijne naald-spuit, volledig wordt gevuld met minerale olie. Plaats de micropipet in het Nanoject-apparaat (of ander verbindingsapparaat microinjection). Voor de Nanoject III, stelt het volgende programma: Volume = 60 nL, tarief = 30, cycli = 25, vertraging = 1 s.
- Beveilig de Nanoject aan de manipulator die is gekoppeld aan een magnetische base en de manipulator zodanig aanpassen dat de Nanoject recht naar beneden wijst, niet bewogen langs de x- of y as.
- Koppelen sommige zelfklevende putty (~ 1-2 cm voor P0-P2 pups) tot de bovenkant van de cover van een petrischaal creëren van een verhoogde oppervlak om uit te rusten van de pup hoofd op.
- Knippen ~ 6-8 cm lange strepen van lab tape en maak een diamant-vormige gat in het midden. De tape worden gebruikt voor het stabiliseren van het hoofd van de pup tijdens de procedure, terwijl ook het uitrekken van de huid en het toestaand gemakkelijke visualisatie van de monumenten en de gerichte regio.
- Bereiden van een verwarming pad naast het station van injectie, en met de instelling van de 'lage' voordat u begint injecties inschakelen. Dekking van de pad met sommige papieren handdoeken of een luier pad.
- Als het uitvoeren van meerdere transplantatie voorwaarden, hebben een kleine schaar klaar om uit te voeren pups teen/staart knippen naar label ontvangende verschillende injecties.
4. verwijderen van P0-P2 muis hersenen
- Vul rechts voordat u de procedure, verschillende petrischalen met gekoeld, carboxygenated sACSF. Vul ook de collectie sproeibuis(-buizen) met ~ 25 mL sACSF.
- Wikkel een pup P0-P2 in sommige parafilm of een handschoen en plaats die het goed bedekt onder het ijs. Stel de timer in voor 5 minuten en start het. Na die tijd, verwijderen van de pup en controleer dat het reageert niet op het knijpen van de hindpaw.
- Decapitate de pup en het verzamelen van het hoofd in een petrischaal gevuld met sACSF. Snijd de huid langs de middellijn aan het blootstellen van de schedel.
- Zoek de opening in de schedel aan het hindbrain/ruggenmerg en steek het ene uiteinde van de verlostang langs het dorsale gedeelte van de schedel. Zachtjes pak de schedel op de middellijn en 'schil' weg stukken lateraal om het blootstellen van de hersenen, dat evenwel niet tot de hersenen beschadigen.
- Na verwijdering van de dorsale en een laterale gedeelten van de schedel, de verlostang of de spatel voorzichtig verwijderen de hersenen van de schedel door scooping onder het ventrale oppervlak van de hersenen, proberen niet te beschadigen van elk gebied te gebruiken. Plaats de hersenen in een petrischaal gevuld met carboxygenated sACSF.
Opmerking: Presenteren We twee verschillende strategieën voor het ontleden van de hippocampus, het striatum en de cortex. De eerste strategie (stappen 5.1-5.10) is nuttig voor alle regels van de muis terwijl de tweede strategie (stappen 6.1-6,7) zou moeten een fluorescerende verslaggever muis netjes scheiden het striatum van de globus pallidus en andere breinstructuur. Als het striatum is niet gewenst, vervolgens negeren het striatum-specifieke gedeelten van de twee technieken
Figuur 1 : Schema en beelden voor hersendissectie, techniek #1
Dissectie techniek beschreven in stap 5.1-5.10. Als striatale weefsel gewenst is, plaatst u P1 hersenen in hersenen matrices ventrale zijde omhoog. Plaats Scheermesjes in matrice "slots" door anterior hersenen te verkrijgen van coronale secties via het striatum. Striatale stukken uit beide halfronden verwijderen, herhaalt u voor alle secties met striatum die anterior to hippocampus. Desgewenst striatale weefsel is niet gewoon de hersenen, hemisect plaats van de hemisferen mediale zijde omhoog in de schotel en verwijder de ventrale-mediale breinstructuur (thalamus, basale ganglia, enz.) om de hippocampus bloot te stellen. Gebruik pincet om knijpen van hippocampus, dan halfrond flipover en pincet te ontleden uit een stuk van de corticale weefsel. De verticale zwarte lijnen door de schematische hemisferen die waar de bezuinigingen zou de striatale secties verwijderen. Schaal bar = 500μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
5. de oogst van Striatum, Hippocampus en Cortex, techniek #1
- Plaats hele hersenen op afdelen matrice schimmel, ventrale zijde omhoog. Plaats 1 scheermesje via de meest voorste gedeelte van de hersenen (via anterieure olfactorische darmkanaal).
- Invoegen van een ander scheermesje gewoon posterieure naar de eerste voor het genereren van een segment van 0.5 mm en een extra scheermesje posterior op deze plaats.
- Deze segmenten overbrengen in een petrischaal met carboxygenated sACSF en plaats van de rest van de hersenen naar een aparte schotel met sACSF. De segmenten van de striatale overbrengen in een ontleden scope te visualiseren striatum. Deze segmenten moeten bevatten van grote delen van de voorste striatum en hippocampus ontbreken. Gebruik een TL ontrafeling van de werkingssfeer met Nkx2.1-Cre+/-; Ai9+/- segmenten te onderscheiden van de zwakke striatale tdTomato signaal van het signaal van de sterke tdTomato van de basale ganglia.
- Met of zonder fluorescentie, knijpen uit het striatum van beide halfronden op alle secties en overdracht striatale brokken voor goed gelabelde 50 mL tube met sACSF, op te slaan op het ijs.
- Hemisect de hersenen langs de middellijn met pincet of een scheermesje, en leg het halfrond, zodat het mediale oppervlak boven ligt.
- Verwijder de ventrale hersenweefsel (thalamus, basale ganglia, enz.) door knijpen uit dit weefsel met een tang. Wanneer voltooid, de hippocampus (een worst vormige structuur verspreid over de as van de anteroposterior langs de dorsale cortex) en ventriculaire kant van de cortex moet duidelijk zichtbaar.
- Verwijderen van de hippocampus, de tips van de verlostang tegenover de anterior hippocampus invoegen en zachtjes de hippocampus te scheiden van de cortex door het bewegen van de verlostang posteriorly en knijpen langs de hippocampal-corticale grens. De geïsoleerde hippocampus overbrengen in goed geëtiketteerde 50 mL tube met sACSF, op te slaan op het ijs.
- Plaats om te ontleden de cortex, de hemisected cortex mediale kant naar beneden. Gebruik vervolgens de verlostang om te knijpen het meest dorsale, ventrale, anterior en posterior gedeelten van de cortex te verlaten een vierkant stuk van mediale Somatosensorische cortex, ~ 2 mm x 2 mm. Flip de cortex dus mediale kant omhoog en schoon zijn van enige overtollige niet-corticale weefsel (thalamus basale ganglia, enz.) op het mediale oppervlak indien nodig. De cortex Brok overbrengen in goed geëtiketteerde 50 mL tube met sACSF, op te slaan op het ijs.
- Herhaal de procedure met het andere halfrond te verzamelen van zowel hippocampi en cortex regio's.
- Herhaal deze procedure voor alle pups, om ervoor te zorgen ter vervanging van de sACSF in de petrischaaltjes tussen pups om ervoor te zorgen dat de sACSF koude en vers blijft.
Figuur 2 : Schema en beelden voor hersendissectie, techniek #2
Dissectie techniek beschreven in stap 6.1-6,7. PIN hersenen op een ontleden schotel dorsale zijde naar boven. Na het schillen van de schors naar voren, de hippocampus en de striatum zijn zichtbaar en kunnen worden verwijderd, en vervolgens een deel van de cortex kan worden verwijderd, zoals beschreven in de vorige techniek. Afhankelijk van transgene muis lijn, kan worden opgeruimd in striatum globus pallidus en ander weefsel te verwijderen. In de Nkx2.1Cre; Ai9 muis lijn, de globus pallidus heeft een aanzienlijk hogere dichtheid van tomaat + cellen ten opzichte van het striatum. Schaal bar = 500 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
6. de oogst van Striatum, Hippocampus en Cortex, techniek #2
- Plaats de hersenen ventrale zijde naar beneden in een petrischaal sylgard bekleed met sACSF en het pin omlaag via het cerebellum en de voorste cortex of de bulbus bollen.
- Beginnend met een halfrond, kunt gebogen pincet voorzichtig het scheiden van de posterieure cortex van onderliggende hippocampus en ander weefsel. Leg voorzichtig de gepelde cortex plat op petrischaal. Herhaal voor de andere hemisfeer. Hippocampi en striatum moeten duidelijk zichtbaar zijn in blootgestelde hersenen.
- Pincet kunt op één hippocampus knijpen op de middellijn en schil van hippocampus lateraal te verwijderen. Plaats in collectie flesje op ijs en herhaal met de andere hippocampus.
- Voor striatum, voorzichtig schrapen rond de randen van het striatum het van het omliggende weefsel los te maken. Verwijder het striatum door te knijpen het af uit onder vervolgens en toevoegen aan de collectie buis op ijs. Herhaal voor de andere striatum.
- Corticale secties kunnen worden geoogst, zoals beschreven in stap 5,8.
- Als via een transgene verslaggever muis-lijn (bijvoorbeeld, Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, etc.), striatum overbrengen in een petrischaal met sACSF en kijk onder tl ontrafeling van de werkingssfeer. Pincet kunt verwijderen van een niet-striatale weefsel uit striatum (in Nkx2.1-Cre; Ai9 muizen, verwijder alle 'lichte' weefsel, zoals globus pallidus heeft veel hogere MGE afkomstige, tdTomato + celdichtheid in vergelijking met het striatum). Herhaal voor alle striatum.
- Herhaal deze procedure voor alle pups, om ervoor te zorgen ter vervanging van de sACSF in de petrischaaltjes tussen pups om ervoor te zorgen dat de sACSF koude en vers blijft.
7. het genereren van eencellige Dissociations
- Na voltooiing van de dissectie bereid een 1 mg/mL Pronase oplossing door weging van 10 mg Pronase en oplossen in 10 mL carboxygenated sACSF.
- Overdracht van het weefsel van de collectie flesjes van 50 mL tot 5 mL ronde onderkant buizen met 2 mL van de Pronase-sACSF-oplossing. Incubeer het weefsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, schudden/flicking de buis 3 - 4 keer met je vinger tijdens de incubatie te mengen van de monsters.
- Tijdens deze incubatie, bereiden reconstitutie oplossing: 1% FBS (100 μl) + DNAse (1 μL van 1:10,000 voorraad DNAse) in 10 mL carboxygenated sACSF.
- Na de 20 minuten, verwijder voorzichtig de pronase oplossing niet storen het weefsel aan de onderkant, en 1-2 mL van de oplossing van de reconstitutie (totale volume is afhankelijk van de hoeveelheid weefsel beginnen) te vervangen.
- Mechanisch distantiëren van het weefsel door het weefsel met de eerder bereid brand-gepolijst Pasteur pipetten triturating. Beginnen met de grote boring (~ 600 µm) Pipet, gecombineerd en verdrijven de weefsel oplossing ten minste tien keer te breken van het weefsel. Geen bubbels in de oplossing invoeren. Herhaal dit proces voor het medium droeg pipet en de kleine droeg pipet. De oplossing moet bewolkt en geen duidelijke stukje weefsel moet zichtbaar zijn in de collectie buizen.
- Pipetteer de cel lysate oplossing door een 50 µm filter in 5 mL conische buizen te verwijderen van een willekeurige cel samengeklonterd. Doorgaan met deze oplossingen van eencellige stroom cytometry (of mogelijk rechtstreeks naar een cel tellen als sorteren niet nodig is).
8. voorbereiding van de cel FACS-gezuiverd oplossingen voor transplantatie
- Na ontvangst van de mobiele oplossingen van de stroom cytometer, breng de oplossing over in een (of meerdere) 1,5 mL conische buizen en draaien de cellen bij 500 g gedurende 5 min bij 4oC. Na het centrifugeren, Verwijder media zo dat ~ 20-40 µL blijven in de buis. Reconstrueren cellen in dit resterende media (en combineren oplossing indien meerdere buizen waren nodig).
- Op een klein stukje parafilm, klikt u met de Meng 2 µL van cell oplossing + 8 µL sACSF + 10 µL van trypan blauwe vlek. Pipetteer 10 µL in een hemocytometer met de dia deksel.
- Het aantal levende cellen in elk van de 4 x 4 vierkante rasters in de hoeken van de hemocytometer met behulp van een standaard laboratorium hand tally counter (dode cellen zullen blauw van de kleurstof), en de gemiddelde deze 4 punten. Dit getal vermenigvuldigt met 100 om te bepalen van het aantal cellen per µL.
- Indien nodig, volume aanpassen, zodat de cellen in een concentratie van 10.000-30.000 cellen/µL in reconstitutie oplossing zijn. Eindconcentratie is afhankelijk van de totale hoeveelheid cellen en gewenste aantal transplantaties. Houden van de cellen op het ijs voor transplantatie
9. transplantatie in P0-2 WT Pups
- Wikkel een pup WT in sommige parafilm of een handschoen en plaats die het goed bedekt onder het ijs. Stel de timer in voor 5 minuten en start het. Na die tijd, verwijderen van de pup en controleer dat het reageert niet op het knijpen van de hindpaw.
- Terwijl de pup op ijs is, meng de cel oplossing waarbij het meerdere malen om ervoor te zorgen de celsuspensie is goed gemengd vóór het laden (Meng de cellen vóór het laden van de micropipet voor elke injectie). Dan de micropipet van de minerale olie leeg en vul het volledig met de celsuspensie.
- Plaats de narcose pup op de petrischaal met zijn hoofd op de zelfklevende putty liggen, zodat de bovenkant van het hoofd relatief vlak is. Plaats de cassette met de diamant gat over het hoofd van de pup, om de huid strak te trekken wordt uitgerekt en het hoofd is stevig, maar dat de muis is een comfortabele en ademhaling goed. Lambda moet worden weergegeven door het gat van de diamant.
Figuur 3 : Schema en afbeeldingen voor transplantatie
(A) foto's van injectie setup. Merk op dat lambda is duidelijk zichtbaar door de pup de schedel en moet worden gebruikt voor de micropipet zeroing. Schaal bar = 1 inch. (B) schematische voorstelling afgebeeld van de injectie-procedure te richten op de hippocampus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Verplaats de beveiligde pup onder de Nanoject en de micropipet te verlagen, zodat het uiteinde van de micropipet zich op direct boven lambda. Het opnemen van de x-en y-coördinaten op de manipulator.
- Aanpassen van de manipulator knoppen als u wilt de micropipet verplaatsen naar de gewenste coördinaten langs de mediolateral en de as van de anteroposterior van het hoofd: S1 Cortex → anterior 1,0 mm en 1,0 mm lateraal, Hippocampus → 0,75-1.0 mm anterior en 1.0-1.2 mm lateraal, Striatum → 2.0-2.2 mm voorste en laterale van 1,5 mm. Coördinaten kunnen enigszins worden aangepast om te compenseren voor de leeftijd van de pup (bijvoorbeeld P0 vs. P2) of de stam van muizen (bijvoorbeeld CD1 muizen groter zijn en C57/B6 op P2).
- Verlaag de micropipet totdat het vormt een kleine uitholling op de huid. Vervolgens draai de z-as manipulator knop stevig maar voorzichtig om te rijden het micropipet via de huid en de schedel aan het invoeren van de hersenen. Wanneer de micropipet in de hersenen, de druk op de schedel zal worden vrijgegeven en de uitholling zal verdwijnen.
- De micropipet iets worden ingetrokken totdat de tip wordt omgeven door een kegel van huid, gevormd als een tent. Lees de coördinaten langs de z-as: dit zal de z-as nul punt.
- Verlagen van de micropipet naar de gewenste diepte: Cortex → 0,75-1.0 mm, Hippocampus → 1,2-1,5 mm, Striatum → 2.0-2.5 mm. diepte kunnen enigszins worden aangepast om te compenseren voor age of stam van de pup.
- Injecteer de celsuspensie met behulp van het programma van de Nanoject III hierboven beschreven. Na injectie programma is voltooid, wacht 15-20 s de micropipet om te minimaliseren van oplossing lekt uit de injectieplaats langzaam wordt ingetrokken.
- Als uitvoeren van bilaterale injecties, opnieuw de nul van de micropipet boven lambda en verplaatst naar de juiste coördinaten in het andere halfrond. Anderzijds kan men twee injecties in de cortex van het hetzelfde halfrond maken door het bewegen van de micropipet 1 mm anterior van de eerste injectie.
- Zodra de transplantatie voltooid is, verwijder de tape en breng de pup op de verwarming pad. Indien nodig, labelen de pup door staart of teen knippen. Zodra de pup heeft opnieuw een rode kleur en beweging is, plaats het terug in de kooi met de moeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol laat zien hoe u oogst specifieke hersengebieden vanuit vroege postnatale brains (Figuur 1-2), verzamelen van eencellige dissociations van interneuron precursoren en deze cellen in verschillende hersengebieden in naïef WT transplantatie postnatale pups (Figuur 3). Voor de analyse van de posthoc, zijn hersenen die interneuron voorloper transplantaten ontvangen geoogst tussen P30-35 te karakteriseren cel morfologie, neurochemical markeringen en elektrofysiologische eigenschappen. Dit soort tests worden vaak uitgevoerd tussen P21-P30 in normale muizen, maar aangezien de rijping van getransplanteerde cellen iets als gevolg van de dissectie/dissociatie-procedure oplopen misschien, wachten een extra 5-10 dagen wordt aanbevolen om dit te compenseren vertraagde rijping. Het soort analyse moet worden uitgevoerd zal het bepalen van de juiste strategie om de oogst van de hersenen. Met name zien we deed niet preferentiële celdood van specifieke interneuron subgroepen die voor of tegen bepaalde subtypen20kon bias.
Voor de analyse van immunohistochemical, muizen werden geperfundeerd met 4% paraformaldehyde en de hersenen werden verwijderd. 50 μm vibratome segmenten waren voor bereid door de regio gerichte hersenen en opgeslagen in antivries oplossing en/of verwerkt voor immunokleuring als eerder beschreven20. Sommige hersenen bevatte geen tomaat + cellen, die zou kunnen te wijten zijn aan ongepaste targeting (bijvoorbeeld injectie te diep in de ventrikel), cellen verloren of apoptosis ondergaan tijdens de praktijk procedure, of afkeuring van de getransplanteerde cellen door de host. Gebaseerd op de laatste cel graven, geschat wordt dat slechts 2-5% van de geënte cellen overleven20, dat strookt met andere transplantatie procedures22,23.
Niet verrassend, was er aanzienlijke variabiliteit in het totale aantal tomaat + cellen in succesvolle transplantaties, variërend van tientallen tot verscheidene duizend tomaat + cellen (figuur 4A). Geënte cellen waren gelokaliseerd in de juiste regio's, met veel interneuron morphologies en goed gekarakteriseerd interneuron neurochemical markeringen (figuur 4B) weer te geven. Vergelijkbare cel overleving nummers en rijping profielen werden waargenomen, zelfs wanneer cellen waren geënt in nieuwe omgevingen in heterotopic transplantaties (figuur 4C).
Naast analyse van immunohistochemical, werd elektrofysiologische analyse op geënte cellen uitgevoerd om te bevestigen dat ze zijn geïntegreerd in de hersenen circuits en verwachte intrinsieke en afvuren beeldschermeigenschappen. Hersenen zijn geoogst van P30-35 muizen en segmenten voorbereid voor fysiologische opnamen als eerder beschreven20. De geënte interneuronen gepresenteerd volwassene-achtige fysiologische eigenschappen en verschillende bakken patronen kunnen worden gekenmerkt die waren vertegenwoordiger van goed gekarakteriseerd interneuron subtypen (figuur 5A), suggereren dat geënt interneuronen waren in staat om goed te rijpen in de hostomgeving. Om te verifiëren dat getransplanteerde cellen werden geïntegreerd in de neuronale netwerk, werden sEPSCs ook opgenomen (figuur 5B). Daarnaast werden een subset van transplantaties uitgevoerd met interneuronen uiting van ChR2 gevolgd door het opnemen van een piramidale cellen gelokaliseerd in de buurt van getransplanteerde interneuronen. Deze gegevens laten zien dat postsynaptisch GABAergic stromingen zijn opgeroepen door blauw licht (figuur 5C-D).
Figuur 4 : Geënte interneuron precursoren vullen host hersengebieden representatieve secties van P30 WT muizen die getransplanteerd werden met tomaat + interneuron precursoren bij P1. (A) In homotoop cortex-naar-cortex transplantaties, de geënte cellen vullen alle corticale lagen en morphologies die na te bootsen van endogene interneuronen weer te geven. Geselecteerde afbeeldingen markeren de variabiliteit in cel nummers uit verschillende transplantaties, met de linker afbeelding met een veel groter aantal tomaat + cellen per sectie in vergelijking met de transplantatie aan de rechterkant. (B) lage vergroting (links) en hoge vergroting (rechts) vertegenwoordiger secties van homotoop hippocampus-naar-hippocampus transplantaties. Merk op dat de meerderheid van de tomaat + cellen in het stratum oriens (zo) express SST (waarschijnlijk O-LM-cellen) Overwegende dat vele tomaat + cellen in het stratum pyramidale (SP) express PV (waarschijnlijk mand cellen), vergelijkbaar met endogene hippocampal interneuronen. (C) voorbeeld van een heterotopic transplantatie (Cortex-naar-Striatum) met tomaat + aanwezig in het striatum. Schaal bars = 200 μm in A in lage mag Configuratiescherm van B, 50 μm in C en hoog vermogen mag in B. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Geënte interneuronen zijn electrophysiologically volwassen en integreren in de host neuronale netwerk
(A) representatieve voorbeelden van de hoogste frequenties van de vuren opgenomen van geënte interneuronen. Links, snel Spiking interneuron van een heup-naar-Ctx graft, geïnjecteerd huidige stappen:-100 pA en 520 pA; juiste, Non-Fast Spiking interneuron uit een Ctx-naar-Ctx graft, geïnjecteerd huidige stappen:-100 pA en 360 pA. (B) voorbeeld van sEPSCs opgenomen in een Late Spiking interneuron van een heup-tot-heup-transplantatie. (C) representatief beeld weergeven van Nkx2.1-Cre; Ai32 cellen (YFP) uit een Ctx-naar-Ctx verplant met een biocytin gevulde (rood) piramidale cel. Schaal bar = 50 μm. (D) voorbeeld van een GABAergic postsynaptisch stromingen opgeroepen door blauw licht pulsen opgenomen in piramidale cellen, met een [145 mM] Cl - recorded. In zwart, gemiddelde sporen; in het rood, gemiddelde reactie opgenomen in aanwezigheid van Gabazine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een kritisch aspect van dit protocol is het maximaliseren van het overlevingsvermogen van de cellen. Ervoor te zorgen dat de weefsels en cellen altijd in ijskoude carboxygenated sACSF is noodzakelijk ter bevordering van de overleving van de cel. Dit vereist een efficiënte dissectie en dissociatie strategie om te minimaliseren van de lengte van de tijd dat de cellen in diverse oplossing en buiten de omgeving van de hersenen. Afhankelijk van het aantal hersengebieden wordt ontleed en getransplanteerd, kan het zinvol zijn om een partner die steun in de dissectie en/of transplantatie stappen te verlagen van de lengte van het experiment. Om ervoor te zorgen de gezondheid en de overleving van de pup, is het ook essentieel voor sneller ijs anesthesie (< 4 min) en de pup verwarmd met licht tijdens de transplantatie procedure houden.
Er kunnen aanzienlijke variabiliteit in de getransplanteerde hersenen, sommige kunnen niet geënte cellen bevatten terwijl andere hersenen bevat duizenden. Het combineren van verschillende P0-P2 nesten voor dissectie kan verhogen het aantal cellen geoogst voor enten, die kan men ofwel de celdichtheid transplantatie verhogen en/of verhoging van het aantal geënte pups, allebei waarvan de waarschijnlijkheid van zal verbeteren succesvolle transplantaties. Te richten op de juiste hersenen-regio, is het essentieel dat de pup het hoofd wordt gestabiliseerd en niet wordt verplaatst als de verlaging van de micropipet in de hersenen. Een verschuiving van het hoofd of buigend van de schacht van de micropipet kan leiden tot mistargeting en onnauwkeurig injecties (zoals verlies van cellen in de laterale ventrikel). Ook, de presterende meerdere injectie sites per pup (eenzijdig of bilateraal), kan er slagingspercentages verbeteren in het geval dat één van de injectieplaats is mistargeted. Het zou in de toekomst optimaal te ontwikkelen van een efficiënter stereotaxic strategie om te stabiliseren van de pup en bieden meer accurate en consistente injecties.
Th P0-P2 tijdsbestek werd gekozen voor zowel wetenschappelijke en technische redenen. Op deze leeftijd, de meeste interneuron precursoren hebt gemigreerd naar hun terminal sites maar hebben minimale milieu-interacties. Deze periode kan niet geldt voor andere neuronale celtypen en hersengebieden, zodat men kan willen deze timepoints aanpassen voor hun specifieke doeleinden. Het zou bijvoorbeeld interessant om te vergelijken het therapeutisch potentieel van deze precursoren interneuron P0-P2 geoogst met MGE-geoogste cellen: een leeftijd wellicht meer voordelen en/of minder ongewenste bijwerkingen dan de andere. Bovendien zou het interessant zijn om uit te voeren van heterochronic transplantaties (bijvoorbeeld het verzamelen van cellen op P0-P2 en verplanten in P7-10 Hersenen, of vice versa) hoe temporele veranderingen in het milieu in het gedrang cel lot en rijping. Het voordeel van het uitvoeren van injecties op P0-2 is dat de schedel relatief dun en kan gemakkelijk worden gepenetreerd met een scherpe micropipet. Injecties over P5 vergt verwijderen of dunner wordend van de schedel.
De analyse beschreven in dit protocol is beperkt tot de specifieke kenmerken van interneuron subtypen die differentieel tussen hersengebieden worden uitgedrukt. In de toekomst een kon gebruik maken van de kracht van eencellige sequencing te karakteriseren de volledige transcriptoom geënte cellen. Deze onbevooroordeelde benadering kan het identificeren van specifieke genen (of grotere signalering cascades) die sterk verrijkt of uitgeput getransplanteerde cellen ten opzichte van inspecties, die zou geven inzicht in de kandidaat-lidstaten milieu signalen die van invloed zou zijn lot vaststelling of rijping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health (K99MH104595) en de NICHD intramurale research program aan T.J.P. Wij danken de Gord Fishell, wiens lab deze aanpak was oorspronkelijk gevestigd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
