Summary
Desafiando las neuronas jóvenes en nuevas regiones del cerebro puede revelar penetraciones importantes en cómo el entorno esculpe maduración y destino neuronal. Este protocolo describe un procedimiento para cosechar precursores interneurona de regiones específicas del cerebro y transplantarlas o homotopically o heterotopically en el cerebro de crías de postnatales.
Abstract
Maduración y la determinación de destino neuronal requiere una interacción intrincada entre señales ambientales y programas genéticos. Sin embargo, desenmarañar los papeles de intrínseca vs extrínsecos mecanismos que regulan este proceso de diferenciación es un enigma para los neurobiólogos del desarrollo. Este problema se magnifica por interneuronas GABAérgicas, una población celular muy heterogénea que nace de las estructuras embrionarias transitorias y se someten a una prolongada fase migratoria para dispersar en el telencéfalo. Para explorar cómo diferentes cerebro entornos afectan interneurona suerte y maduración, desarrollamos un protocolo para recolección de precursores de fluorescencia etiquetada interneurona inmaduros de regiones específicas del cerebro de ratones recién nacidos (P0-P2). A esta edad, la migración de interneurona es casi completa y estas células residen en sus entornos descanso finales con relativamente poca integración sináptica. Siguiendo la colección de unicelular mediante citometría de flujo, estos precursores de la interneurona se trasplantan en P0 P2 cachorros postnatales de tipo salvaje. Realizando ambos homotópicas (por ejemplo, corteza a corteza) o heterotópico (por ejemplo, corteza a hipocampo) trasplantes, uno puede evaluación cómo desafiante interneuronas inmaduros en los nuevos entornos del cerebro afecta a su destino, la maduración y la integración del circuito. Cerebro puede ser cosechado en ratones adultos y ensayaron con una amplia variedad de análisis posthoc de las células injertadas, incluyendo inmunohistoquímica, electrofisiológicos y transcripcional de perfiles. Este planteamiento general proporciona a los investigadores con una estrategia de análisis cómo distintos ambientes de cerebro pueden influir en numerosos aspectos del desarrollo de la neurona e identificar si características neuronales específicas son conducidas principalmente por programas genéticos de cableado o señales ambientales.
Introduction
Función cortical adecuada requiere un equilibrio entre las neuronas excitatory de la proyección e inhibitorios interneurons de GABAérgico, una población muy heterogénea con morfologías distintas, propiedades electrofisiológicas, conectividad y neuroquímicos marcadores. Función de interneuronas (y subgrupos específicos interneurona) y desarrollo anormal se ha relacionado con la Patobiología de trastornos psiquiátricos como la esquizofrenia, autismo y epilepsia1,2,3. Además, muchos genes implicados en estos trastornos cerebrales se enriquecen fuertemente en interneuronas joven4. Por lo tanto, una mayor comprensión de los mecanismos que regulan la maduración y la determinación del destino de interneurona es necesario para comprender el desarrollo normal y las posibles etiologías de numerosas enfermedades del cerebro.
Interneuronas de forebrain nacen principalmente de dos estructuras embrionarias transitorias, las eminencias ganglionares mediales y caudales (MGE y CGE, respectivamente). Estas células postmitotic (precursores de la interneurona) luego pasar por una fase prolongada migración tangencial para dispersar en el telencéfalo donde se integran en una gran variedad de circuitos. Interneurons MGE derivados consisten en tres subgrupos en gran parte no superpuestos, neuroquímicamente definidos: fast spiking interneurons parvalbúmina (PV+), no-fast spiking interneuronas de la somatostatina (SST+) y tarde clavando neuronal nítrico interneuronas de sintasa (nNOS+) de óxido que constituyen las células hippocampal de neurogliaform y hiedra. Numerosos laboratorios han identificado varios mecanismos dentro de la MGE que regulan las decisiones de destino inicial en PV+ o SST + interneurons, incluyendo gradientes espaciales de morfógenos, fecha de nacimiento de los precursores de la interneurona y el modo de división neurogénica 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. se ha propuesto que interneuronas distinguen inicialmente en 'cardenal clases' y luego progresivamente maduran hasta convertirse en 'clases definitivas' al interactuar con su medio ambiente11. La evidencia reciente indica que algunos subtipos de interneurona maduro pueden ser genéticamente cableado como estas células se convierten en postmitotic en las eminencias ganglionares, indicando que programas genéticos intrínsecos definidos principios pueden desempeñar un papel más grande que antes apreciada12,13. Sin embargo, la cuestión clave de cómo los programas genéticos intrínsecos interactúan con señales ambientales a la diferenciación de la unidad en subtipos distintos interneurona sigue siendo en gran parte inexplorada.
Numerosos estudios han trasplantado células embrionarias MGE directamente en una variedad de regiones del cerebro, con los resultados del consenso que injertaron células maduras y liberan GABA para inhibir generalmente los circuitos endógeno local14,15, 16,17,18,19. Estos prometedores observaciones han generado un interés significativo en el uso de células pluripotentes inducidas humanas (hIPSC)-derivado de interneuronas para tratar una variedad de enfermedades del cerebro. Sin embargo, muy pocos de estos estudios determinar si estas células injertadas maduran en los tipos esperados de interneuronas maduras, un componente esencial cuando uno piensa en enfoques traslacionales.
Para abordar cómo el entorno influye interneurona diferenciación y maduración, una estrategia fue ideada para trasplante precursores inmaduros interneurona en nuevos entornos de cerebro para examinar si interneuronas injertados adoptan características del anfitrión medio ambiente o conservar características de las donantes medio ambiente20. MGE trasplantes no son adecuados para abordar esta cuestión porque el MGE contiene una población mixta de células de proyección de GABAérgico que dispersan a lo largo de numerosas regiones de cerebro21e interneurona. Sin saber donde estas células MGE habría emigrado, uno puede no evaluar completamente cómo estos trasplantes son afectadas por el entorno del cerebro. Por cosecha de precursores del mesencéfalo en los puntos de tiempo postnatales tempranos, este problema es burlado por la obtención de células inmaduras que han completado su migración y alcanzaron su objetivo región del cerebro pero tienen mínima interacción con el medio ambiente. Al centrarse en las características específicas de interneuronas que se expresan diferencialmente entre regiones distintas del cerebro, entonces uno puede determinar cómo el entorno de host cambia propiedades interneurona. El enfoque general que se describe en este Protocolo debería ser aplicable a cualquier investigador que quiere examinar las neuronas jóvenes cómo comportarse cuando desafió en un nuevo entorno.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo con arreglo a las pautas de los institutos nacionales de salud y fueron aprobados por el NICHD Animal Care y el Comité uso (ACUC). El protocolo descrito a continuación utiliza Nkx2.1 CreC / +; Ai9+- cachorros para cosechar precursores derivados de MGE interneurona, pero puede realizarse en cualquier línea de ratón reportero fluorescente deseada. Machos y hembras ratones postnatales tempranos (P0-P2) fueron utilizados indiscriminadamente para tejido donante y huésped.
1. preparación de la solución
- Preparar sacarosa líquido cefalorraquídeo artificial (sACSF) según la siguiente receta (unidad en mM): NaCl 87, 26 NaHCO3, 2.5 KCl 1.25 NaH2PO4, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 glucosa, sacarosa 75 saturado con 95% O 2, 5% CO2 a pH = 7.4.
- Llenar un vaso de precipitados con 350 mL puro ddH2O basado en el volumen final deseado (500 mL de sACSF debería ser suficiente para 1-2 camadas), añadir una barra de agitación magnética y coloque el vaso sobre la placa de agitación.
- Peso de todas las sales (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4, glucosa, sacarosa), uno a la vez y añadir al agua según la siguiente tabla. Cantidades pueden ser ajustadas según el volumen final deseado.
Reactivo de Peso molecular Concentración (mM) G/500 mL Cloruro de sodio 58.44 87 2.54 Bicarbonato de sodio 84.01 26 1.09 Cloruro de potasio 74.55 2.5 0.09 Fosfato de sodio monobásico 119.98 1.25 0.08 Glucosa 180.16 10 0,9 Sacarosa 342.3 75 12.84 - La solución con 95% O2, 5% CO2 (carboxygen) por al menos 20-30 minutos antes de añadir la cantidad apropiada de CaCl2 (0,25 mL de una solución de 1 M de sACSF de 500 mL) y MgCl2 (3,5 mL de una solución de 1 M de sACSF de 500 mL) de la burbuja .
- Comprobar el pH con un medidor de pH estándar. Si preparado correctamente, la solución debe tener pH = 7.4.
- Llevar la solución hasta un volumen final de 500 mL con puro ddH2O en un cilindro graduado.
- sACSF puede ser preparado hasta 1-2 días de antelación. Antes de usar, coloque en hielo y burbuja con carboxygen durante al menos 15 minutos antes de inicio de la disección y la botella de sACSF burbujas a lo largo de la disección.
2. disección preparación
- Las siguientes herramientas deben ser esterilizados esterilizado: por lo menos un pequeño fino unas tijeras afiladas, 2 Pinzas finas (estilo #5), curvas finas pinzas, cerebro seccionado matrice molde y varias cuchillas de afeitar. Una pequeña espátula para extraer el cerebro del cráneo es opcional.
- Configurar la estación de trabajo cerca de microscopios de disección con platos de petri (9 cm y diámetros de 4 cm), 50 mL tubos cónicos de plástico para recoger las regiones aisladas del cerebro y gran diámetro a transferencia plástico pipetas, todos mantenidos en hielo. Preparar varios tubos de 50 mL de sACSF de carboxygenated en el hielo. Si más de una región del cerebro de disección, asegúrese de correctamente y claramente etiquetar los tubos y pipetas de transferencia para evitar la contaminación.
- Tienen un cubo de hielo adicional para la anestesia de hielo de cachorros por hipotermia y una bolsa de residuos peligrosos adecuado para deshacerse de cadáveres.
- Pipetas Pasteur de vidrio pulido de fuego se preparan para trituración de tejidos. Use un mechero de Bunsen para esterilizar y forma de la punta de la pipeta. Preparar varias pipetas con orificios de diferente diámetro: grande (~ 600 μm), medio (~ 300 μm) y pequeño (~ 100 μm). Prueba de flujo a través de consejos de uso de agua para asegurar la trituración diferentes velocidades. Pipeta de al menos una de cada clase es necesario para cada región del cerebro aislado, pero con varios extras para cada tamaño se recomienda en caso de obstrucción o ruptura consejos.
3. trasplante de la preparación
- Utilizar un extractor de electrodo para preparar Micropipetas de vidrio de punta fina. Romper o bisel la punta para hacer un punto de ángulo agudo, con la punta con un diámetro de ~ 20-40 μm. Visualmente inspeccione las puntas con un microscopio para asegurarse de que no hay polvo o partículas de vidrio residual están obstruyendo la abertura.
- Utilizando una jeringa de aguja fina, llene completamente la micropipeta de vidrio con aceite mineral. Inserte la micropipeta en el aparato de Nanoject (u otro dispositivo de microinyección). Para el III Nanoject, configurar el programa siguiente: volumen = 60 nL, tasa = 30, ciclos = 25, retardo = 1 s.
- Garantizar la Nanoject para el manipulador que se adjunta a una base magnética y ajustar el manipulador para que la Nanoject esté apuntando hacia abajo, no inclinada a lo largo de la x o y eje.
- Fije algunos masilla adhesiva (~ 1-2 cm para cachorros P0 P2) en la parte superior de la tapa de una caja de Petri creando una superficie elevada para que descanse la cabeza del cachorro sobre.
- Corte ~ 6-8 cm largo rayas del laboratorio de la cinta y haga un agujero en forma de rombo en el medio. La cinta se utiliza para estabilizar la cabeza de la cría durante el procedimiento, mientras que también estiramiento de la piel y permitiendo la visualización fácil de lugares de interés y la región específica.
- Preparar una almohada junto a la estación de inyección y gire el control a 'low' antes de comenzar las inyecciones. Cubra la almohadilla con algunas toallas de papel o un cojín del pañal.
- Si realiza varias condiciones de trasplante, tiene unas pequeñas tijeras lista para realizar recorte de punta y cola para etiqueta cachorros reciben inyecciones diferentes.
4. extracción de cerebro de ratón P0 P2
- Justo antes de iniciar el procedimiento, llenar varias placas de Petri con refrigerado, carboxygenated sACSF. También se llenan los tubos de colección ~ 25 mL sACSF.
- Envuelva un cachorro P0 P2 en algunos parafilm o un guante y que lo bien cubierto bajo el hielo. Ajustar un temporizador de 5 minutos e iniciarlo. Después de ese tiempo, retirar el cachorro y comprobar que no responde a la sejeción de la hindpaw.
- Decapitar el cachorro y recoger la cabeza en una placa Petri con sACSF. Cortar la piel a lo largo de la línea media para exponer el cráneo.
- Localizar la apertura en el cráneo, la médula espinal cerebelo e inserte un extremo de las pinzas a lo largo de la porción dorsal del cráneo. Suavemente Sujete el cráneo en la línea media y 'pelar' lejos piezas lateralmente para exponer el cerebro, teniendo cuidado de no dañar el cerebro.
- Al retirar las porciones dorsales y laterales del cráneo, use las pinzas o la espátula para eliminar suavemente el cerebro del cráneo sacando debajo de la superficie ventral del cerebro, tratando de no dañar cualquier área. Colocar el cerebro en otra placa de Petri con carboxygenated sACSF.
Nota: Presentamos a dos estrategias diferentes para la disección por el hipocampo, el estriado y la corteza. La primera estrategia (pasos 5.1-5.10) es útil para cualquier línea de ratón mientras que la segunda estrategia (pasos 6.1-6.7) necesitaría un ratón fluorescente reportera para separar limpiamente el estriado del pallidus del globus y otras estructuras cerebrales. Si no se desea el cuerpo estriado, luego ignorar las porciones específicas del cuerpo estriado de las dos técnicas
Figura 1 : Esquema e imágenes de disección de cerebro, técnica #1
Técnica de disección que se describe en pasos 5.1-5.10. Si se desea el tejido estriatal, coloque P1 cerebro en el lado ventral de la matrices de cerebro hacia arriba. Coloque las hojas de afeitar en matrice ranuras a través del cerebro anterior para obtener secciones coronales a través del cuerpo estriado. Quitar partes del estriado de ambos hemisferios, repita para todas las secciones que contienen estriado que son anterior hipocampo. Si no se desea el tejido estriatal, simplemente hemisect el cerebro, coloque el lado intermedio del hemisferios hacia arriba en el plato y retirar las estructuras del cerebro ventral medial (tálamo, ganglios basales, etc.) para exponer el hipocampo. Utilice unas pinzas para pellizcar de hipocampo, luego voltee el hemisferio y utilice unas pinzas para diseccionar a un trozo de tejido cortical. Las líneas negras verticales a través de los hemisferios esquemáticos donde los cortes sería quitar las secciones de estriado. Barra de escala = 500μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. cosecha de cuerpo estriado, el hipocampo y la corteza, técnica #1
- Coloque todo el cerebro en seccionamiento matrice molde, lado ventral hacia arriba. Coloque 1 hoja de afeitar a través de la porción más anterior del cerebro (a través del tracto olfatorio anterior).
- Inserte otra hoja de afeitar sólo posterior a la primera para generar un corte de 0,5 mm y colocar una hoja de afeitar adicional posterior a este.
- Transferir estas rodajas a un plato de petri con carboxygenated sACSF y coloque el resto del cerebro en un plato separado con sACSF. Transferencia de las rebanadas del estriado a un ámbito de disección para visualizar el cuerpo estriado. Estos sectores deben contienen grandes porciones de la estriado anterior y carecen de hipocampo. Utilizar un fluorescente disección alcance con Nkx2.1 Cre+-; Ai9+- rebanadas para diferenciar la tdTomato estriada débil señal de la señal de la fuerte tdTomato del pallidus del globus.
- Con o sin fluorescencia, pode en el estriado de ambos hemisferios en todas las secciones y transferencia estriada trozos para tubo de 50 mL debidamente etiquetados con sACSF, almacenar en hielo.
- Hemisect el cerebro a lo largo de la línea media con pinzas o una hoja de afeitar, y el hemisferio por lo que la superficie medial es hacia arriba.
- Extirpar el tejido ventral del cerebro (tálamo, ganglios basales, etcetera) pellizcando de este tejido con unas pinzas. Cuando termine, el hipocampo (estructura en forma de salchicha que abarca el eje anteroposterior a lo largo de la corteza dorsal) y el lado ventricular de la corteza debe ser claramente visible.
- Para quitar el hipocampo, inserte las puntas de las pinzas delante del hipocampo anterior y suavemente separar el hipocampo la corteza moviendo las pinzas posteriorly y pellizcando a lo largo de la frontera hipocampo cortical. Transferir el hipocampo aislado para tubo de 50 mL debidamente etiquetados con sACSF, almacenar en hielo.
- Para diseccionar la corteza, coloque el lado medial de la corteza hemiseccionada hacia abajo. Entonces use las pinzas para pellizcar la más dorsal, porciones ventrales, anteriores y posteriores de la corteza para dejar un trozo cuadrado de Corteza somatosensorial medial, ~ 2 mm x 2 mm. tapa la corteza quede lado medial hacia arriba y limpia de cualquier exceso tejido no-cortical (tálamo los ganglios basales, etcetera.) en la superficie medial si es necesario. Transferir el pedazo de corteza para tubo de 50 mL debidamente etiquetados con sACSF, almacenar en hielo.
- Repita el procedimiento con el otro hemisferio para recoger el hipocampo y la corteza regiones.
- Repita este procedimiento para todos los cachorros, asegúrese de reemplazar el sACSF en las cajas Petri entre los cachorros para asegurarse de que la sACSF sigue siendo frío y fresco.
Figura 2 : Esquema e imágenes de disección de cerebro, técnica #2
Técnica de disección que se describe en pasos 6.1 6.7. Pin el cerebro en un disección lado dorsal del plato hacia arriba. Después de pelar la corteza adelante, hipocampo y cuerpo estriado son visibles y pueden eliminarse, una sección de corteza se puede quitar como se describe en la técnica anterior. Dependiendo de la línea de ratón transgénico, estriado puede limpiarse para eliminar el pallidus del globus y otros tejidos. En Nkx2.1Cre; Ai9 línea de ratón, el pallidus del globus tiene una densidad significativamente mayor de células de tomate + en comparación con el cuerpo estriado. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. cosecha estriado, el hipocampo y la corteza, técnica #2
- Coloque el lado ventral del cerebro en un plato de petri sylgard recubierto que contiene sACSF y precisar a través del cerebelo y corteza anterior o bulbos olfativos.
- A partir de un hemisferio, utilizar fórceps curvado suavemente separar la corteza posterior del hipocampo subyacente u otros tejidos. Coloque suavemente la corteza pelada en placa de Petri. Repita para el otro hemisferio. Hipocampo y cuerpo estriado deben ser claramente visibles en el cerebro expuesto.
- Utilice pinzas para pellizcar un hipocampo en la línea media y pelar hipocampo lateralmente para eliminar. Colocar en frasco con hielo y repetir con otro hipocampo.
- Para estriado, raspar suavemente alrededor de los bordes del estriado para aflojarlo del tejido circundante. Luego retire el estriado por pellizcarla fuera de debajo y añadir al tubo de la colección en el hielo. Repita para otros estriado.
- Las secciones corticales pueden ser cosechadas como se describe en el paso 5.8.
- Si utiliza una línea de ratón transgénico reportero (por ejemplo, Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, etc.), transferencia de cuerpo estriado a una placa Petri con sACSF y ver bajo fluorescente alcance de disección. Utilice pinzas para extraer cualquier tejido no estriado estriado (en Nkx2.1-Cre; Ai9 ratones, eliminar todo el tejido 'brillante', pallidus del globus tiene mucho mayor derivado de MGE, tdTomato + densidad celular comparada con el cuerpo estriado). Repita para todos estriado.
- Repita este procedimiento para todos los cachorros, asegúrese de reemplazar el sACSF en las cajas Petri entre los cachorros para asegurarse de que la sACSF sigue siendo frío y fresco.
7. generar Dissociations unicelular
- Una vez completada la disección, preparar un 1 mg/mL solución de pronasa pesaje 10 mg pronasa y disolver en 10 mL carboxygenated sACSF.
- Transferencia del tejido de los frascos de colección de 50 mL a 5 mL alrededor de tubos que contienen 2 mL de la solución de pronasa-sACSF. Incubar por 20 min a temperatura ambiente, agitando/sacudiendo el tubo 3 ó 4 veces con el dedo durante la incubación para mezclar las muestras de tejido.
- Durante la incubación, preparar la solución de reconstitución: 1% FBS (100 μL) + DNAasa (1 μL de 1: 10,000 stock DNasa) en 10 mL carboxygenated sACSF.
- Después de 20 minutos, retirar cuidadosamente la solución de pronasa para no perturbar el tejido en la parte inferior y sustituirla por 1-2 mL de la solución de reconstitución (volumen total depende a partir de cantidad de tejido).
- Disocian mecánicamente el tejido por trituración del tejido con las pipetas de Pasteur de fuego pulido previamente preparados. A partir de la pipeta (~ 600 μm) de gran diámetro, aspirar y expulsar la solución de tejido por lo menos diez veces para romper el tejido. No introducir burbujas en la solución. Repita este proceso para el medio alesaje pipeta y pipeta del alesaje pequeño. La solución debe ser nublada y no clara pieza de tejido debe ser visible en los tubos de la colección.
- Pipeta de la solución de lisado de células a través de un filtro de 50 μm en tubos cónicos de 5 mL para eliminar cualquier célula agrupa. Proceder con estas soluciones de unicelular a la citometría de flujo (o potencialmente directamente a la célula contando si no clasifica es necesario).
8. Preparar soluciones celular FACS purificada para el trasplante
- Al recibir las soluciones de la célula de la citometría de flujo, transferir la solución a uno (o varios) tubos cónicos de 1.5 mL y centrifugar las células a 500 g durante 5 min a 4oC. Después de la centrifugación, retirar los medios de comunicación así que ~ 20-40 μl permanecen en el tubo. Reconstituir las células en este quedan los medios de comunicación (y combinar la solución si se necesitan tubos múltiples).
- En un pequeño trozo de parafilm, se mezclan 2 μl de la solución celular + 8 μl sACSF + 10 μl de colorante azul de trypan. Pipetee 10 μL en un hemocitómetro con tapa deslizante.
- Contar el número de células vivas en cada una de las rejillas cuadradas de 4 x 4 en las esquinas del hemocitómetro usando un contador de cuenta de mano de laboratorio estándar (células muertas serán azules desde el tinte), y promedio de estas 4 cuentas. Multiplique a este número por 100 para determinar el número de células por μl.
- Si es necesario, ajustar el volumen para que las células están en una concentración de 10.000-30.000 células/μl de solución de reconstitución. Concentración final depende de la cantidad total de células y número de trasplantes. Mantener las células en hielo para el trasplante
9. trasplante en P0-2 peso cachorros
- Envuelva un cachorro WT en algunos parafilm o un guante y que lo bien cubierto bajo el hielo. Establecer un temporizador para 5 minutos e iniciarlo. Después de ese tiempo, retirar el cachorro y comprobar que no responde a la sejeción de la hindpaw.
- Mientras el cachorro está en el hielo, mezclar la solución celular mediante pipeteo varias veces para asegurar la suspensión de células se mezcla bien antes de cargar (mezcla de las células antes de cargar la micropipeta por cada inyección). A continuación vaciar la micropipeta de la vaselina y llenarlo completamente con la suspensión de células.
- Coloque el cachorro anestesiado en la caja Petri con la cabeza de mentira en la masilla adhesiva para que la parte superior de la cabeza es relativamente plana. Coloque la cinta con el agujero del diamante en la cabeza del cachorro, tirando tensa para la piel se estira y la cabeza es firme pero que el ratón es cómodo y respirando bien. Lambda debe ser visible a través del agujero del diamante.
Figura 3 : Esquema e imágenes para el trasplante de
(A) imágenes de la instalación de la inyección. Tenga en cuenta que lambda es claramente visible a través del cráneo del cachorro y puede usarse para poner a cero la micropipeta. Barra de escala = 1 pulgada. (B) esquema que representa el procedimiento de inyección para apuntar el hipocampo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Mueva el cachorro asegurado bajo el Nanoject y baje la micropipeta de modo que la punta de la micropipeta está en directamente sobre lambda. Registrar las coordenadas x-y en el manipulador.
- Ajuste los botones de manipulador para mover la micropipeta a las coordenadas deseadas a lo largo de la mediolateral y el eje anteroposterior de la cabeza: corteza S1 → 1,0 mm anterior y lateral de 1.0m m, hipocampo → 0.75-1.0 mm anterior y lateral de 1.0-1.2m m, Striatum → 2,0-2,2 mm anterior y lateral de 1, 5 mm. Coordenadas pueden ajustarse ligeramente para compensar la edad de la cría (por ejemplo, P0 y P2) y la cepa de ratones (por ejemplo, son más grandes que ratones CD1 y C57/B6 en P2).
- Baje la micropipeta hasta que forma una pequeña concavidad en la piel. Luego gire el eje manipulador firmemente pero con cuidado para manejar la micropipeta a través de la piel y el cráneo para entrar en el cerebro. Cuando la micropipeta entra en el cerebro, se liberará la presión en el cráneo y la concavidad desaparecerá.
- Retraiga la micropipeta ligeramente hasta que la punta está rodeada por un cono de piel, en forma de una tienda de campaña. Leer las coordenadas a lo largo de los ejes z: este será el punto del eje cero.
- Bajar la micropipeta a la profundidad deseada: corteza → 0.75-1.0 mm, hipocampo → 1.2-1.5 m m, Striatum → 2.0-2.5 mm. profundidad puede ajustarse ligeramente para compensar por edad o cepa del cachorro.
- Inyectar la suspensión de células mediante el programa de Nanoject III descrito anteriormente. Después de la inyección el programa es completo, espere 15-20 s antes de retraerse lentamente la micropipeta para minimizar fugas fuera del sitio de la inyección de la solución.
- Si realizando inyecciones bilaterales, volver a cero la micropipeta sobre lambda y mover las coordenadas adecuadas en el otro hemisferio. Alternativomente, uno puede hacer dos inyecciones en la corteza del mismo hemisferio moviendo la micropipeta 1 mm anterior de la primera inyección.
- Una vez finalizado el trasplante, retire la cinta y transferencia el cachorro en la almohada. Si es necesario, seleccionar el cachorro por recorte de cola o dedo del pie. Una vez que el cachorro ha reacquired un color rojo y está en movimiento, coloque en la jaula con la madre.
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Representative Results
Este protocolo muestra cómo cosechar las regiones específicas del cerebro de cerebro postnatal temprano (figura 1-2), recoger dissociations unicelular de los precursores de la interneurona y transplante de estas células en varias regiones del cerebro en ingenuo WT cachorros postnatales (figura 3). Para el análisis posthoc, cerebros que recibieron injertos de interneurona precursor fueron cosechados entre P30-35 para caracterizar la morfología celular, marcadores neuroquímicos y propiedades electrofisiológicas. Estos tipos de ensayos se realizan a menudo entre P21-P30 en ratones normales, pero puesto que la maduración de las células trasplantadas podría retrasarse ligeramente debido al procedimiento de disección/disociación, esperar 5-10 días adicionales se recomienda para compensar este maduración retrasada. El tipo de análisis a realizar determinará la estrategia adecuada para cosechar el cerebro. En particular, no observamos muerte celular preferencial de subgrupos específicos interneurona que podría sesgar para o contra ciertos subtipos de20.
Para el análisis de immunohistochemical, ratones fueron perfundidos con paraformaldehído al 4% y el cerebro fueron quitado. 50 μm vibratome rodajas fueron preparados a través de la región específica del cerebro y almacenados en solución anticongelante o procesados para la inmunotinción como se describió anteriormente20. Algunos cerebros no contenía ningún tomate + células, que podrían ser debido a la orientación (por ejemplo, inyección demasiado profunda en el ventrículo), células perdidas o que experimenta apoptosis durante el procedimiento del injerto o rechazo de las células trasplantadas por el anfitrión. De acuerdo con un recuento final, se estima que sólo 2-5% de las células injertadas sobrevivir20, que coincide con otros procedimientos de trasplante22,23.
No en vano, había variabilidad significativa en el número total de células de tomate + en trasplantes exitosos, que van desde decenas hasta varias miles de tomate + células (Figura 4A). Las células injertadas fueron localizadas en las regiones correcto, muchos exhibiendo morfologías interneurona y marcadores neuroquímicos interneurona bien caracterizada (Figura 4B). Números similares de supervivencia celular y perfiles de maduración se observaron incluso cuando las células fueron injertadas en nuevos entornos en trasplante heterotópico (figura 4).
Además el análisis de immunohistochemical, realizó análisis electrofisiológico en las células injertadas para confirmar que se han integrado en los circuitos del cerebro y mostrar las propiedades intrínsecas y disparo esperados. Los cerebros fueron extraídos de ratones P30-35 y rodajas prepararon para grabaciones fisiológicas anteriormente descritas20. Las interneuronas injertados presentaron propiedades fisiológicas del adulto y disparo distinto patrones podrían ser que caracteriza representativos de interneurona bien caracterizado subtipos (figura 5A), lo que sugiere que injertan interneuronas fueron capaces de madurar adecuadamente en el entorno de host. Para comprobar que las células trasplantadas fueron integradas en la red neuronal, sEPSCs fueron también grabadas (figura 5B). Además, un subconjunto de los trasplantes se realizaron con interneuronas expresar ChR2 seguido por registro a partir de las células piramidales localizadas cerca de interneuronas trasplantados. Estos datos demostraron que corrientes GABAérgica postsinápticas son evocadas por la luz azul (figura 5-D).
Figura 4 : Precursores de interneurona injertado pueblan las regiones del cerebro anfitrión secciones representativas de los ratones WT P30 que fueron trasplantados con tomate + precursores interneurona en P1. (A) en homotópicas trasplantes de corteza a corteza, las células injertadas rellenar todas las capas corticales y mostrar morfologías que mímico endógenos interneuronas. Las imágenes destacan la variabilidad en el número de células de diferentes trasplantes, con la imagen de la izquierda con un número mucho mayor de tomate + células por sección en comparación con el trasplante en el lado derecho. (B) Ampliación baja (izquierda) y secciones representativas de alta magnificación (derecha) de injertos de hipocampo a hipocampo homotópicas. Tenga en cuenta que la mayoría de las células en el estrato oriens tomate + express (tan) SST (células de LM O probables) mientras que muchas células de tomate + en el pyramidale del estrato (SP) expresan PV (células de cesta probable), similar al endógenos interneurons hippocampal. (C) ejemplo de un trasplante heterotópico (corteza al estriado) con tomate + presente en el cuerpo estriado. Barras de escala = 200 μm en la A en el panel de baja en B, 50 μm en C y mag de alta potencia en B. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Interneuronas injertadas son electrophysiologically maduras e integrar en la red neuronal de host
(A) ejemplos representativos de las frecuencias más altas de la leña registran de interneuronas injertados. Izquierda, interneurona rápido pinchado de un injerto de cadera a Ctx, inyecta pasos actuales: pA-100 y 520 pA; derecho, no-Fast Spiking interneurona de un injerto de Ctx-Ctx, inyectado medidas actuales: -100 pA y 360 PA. (B) ejemplo de sEPSCs registrado en una interneurona tarde clavando de un trasplante de cadera a cadera. (C) imagen representativa muestra Nkx2.1-Cre; Ai32 las células (YFP) Ctx-a-Ctx de trasplante con una célula piramidal (rojo) lleno de biocitina. Barra de escala = 50 μm. (D) ejemplo de una corrientes postsináptica GABAérgica evocada por pulsos de luz azul grabado en las células piramidales, grabado con un [145 mM Cl-]. En negro, medios rastros; en rojo, medio de respuesta registrado en presencia de Gabazine. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un aspecto fundamental de este protocolo es maximizar la supervivencia de las células. Asegurar que el tejido y las células siempre están en sACSF de carboxygenated de hielo frío es necesario para promover la supervivencia celular. Esto requiere una disección eficiente y una estrategia de disociación para reducir al mínimo la longitud de tiempo que pasan de las células en solución diferentes y fuera del entorno del cerebro. Dependiendo del número de regiones del cerebro disecado y trasplantados, puede ser beneficioso tener un socio ayuda en los pasos de la disección o trasplante para disminuir la duración del experimento. Para asegurar la salud y la supervivencia de la cría, también es fundamental para minimizar el tiempo de anestesia de hielo (< 4 min) y mantener el cachorro climatizado con luz durante el procedimiento de trasplante.
Puede haber variabilidad significativa en el cerebro trasplantado, algunos no pueden contener las células injertadas mientras otros cerebros contienen miles. La combinación de varias camadas de P0 P2 para la disección puede aumentar el número de células cosechadas para injertos, que permite aumentar la densidad de trasplante de la célula o aumentar el número de crías de injertado, que mejorará la probabilidad de trasplantes exitosos. Para llegar a la región adecuada del cerebro, es fundamental que la cabeza del cachorro se estabiliza y no se mueve al bajar la micropipeta en el cerebro. Cualquier desplazamiento de la cabeza o doblar el eje de la micropipeta puede resultar en inyecciones mistargeting e inexactas (como la pérdida de células en el ventrículo lateral). También, realizar múltiples sitios de inyección por cachorro (unilateral o bilateral) puede mejorar las tasas de éxito en el caso de un sitio de la inyección es mistargeted. En el futuro, sería óptimo para desarrollar una estrategia más eficiente estereotáctica para estabilizar el cachorro y para proporcionar inyecciones más precisas y coherentes.
Marco de tiempo TH P0-P2 fue elegido por razones científicas y técnicas. A esta edad, más precursores de interneurona han migrado a sus sitios terminal pero tienen mínimas interacciones ambientales. Este período de tiempo no pueden mantener cierto para otros tipos de células neuronales y las regiones del cerebro, por lo que uno puede desear ajustar estos puntos de tiempo para sus fines específicos. Por ejemplo, sería interesante comparar el potencial terapéutico de estos precursores de la interneurona de P0-P2 cosechadas con células de MGE-cosecha: una edad tenga más ventajas y menos efectos secundarios no deseados que la otra. Además, podría ser interesante realizar trasplantes heterocrónicas (por ejemplo, recolección de células en P0 P2 y trasplantar cerebros P7-10, o viceversa) identificar cambios temporales como en el ambiente podría afectar el destino celular y maduración. La ventaja de realizar inyecciones a P0-2 es que el cráneo es relativamente delgado y puede ser fácilmente penetrado con una micropipeta sharp. Cualquier inyecciones sobre P5 requiere eliminación o adelgazamiento del cráneo.
El análisis descrito en el presente Protocolo se limita a especificidades de subtipos de interneurona que se expresan diferencialmente entre regiones del cerebro. En el futuro, uno podría utilizar el poder de la secuencia única célula para caracterizar el transcriptoma completo de las células injertadas. Este enfoque imparcial podría identificar genes específicos (o grandes cascadas de señales) que son fuertemente enriquecido o empobrecido en células trasplantadas comparadas a los controles, que proporcionan una visión candidato señales ambientales que podrían influir en destino determinación o maduración.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por los institutos nacionales de salud (K99MH104595) y el programa de investigación intramuros del NICHD para T.J.P. Agradecemos a ERGE Fishell, en cuyo laboratorio fue establecido originalmente este enfoque.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
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