Summary
Desafio jovens neurônios em novas regiões do cérebro pode revelar importantes insights sobre como o ambiente esculpe, maturação e destino neuronal. Este protocolo descreve um procedimento para colheita precursores interneurônio de regiões específicas do cérebro e transplantá-las de qualquer homotopically ou heterotopically para o cérebro dos filhotes pós-natal.
Abstract
Maturação e determinação neuronal destino requer uma intrincada interação entre programas genéticos e sinais ambientais. No entanto, destrinçar os papéis de intrínseco versus extrínsecos mecanismos que regulam este processo de diferenciação é um enigma para todos os neurobiologists do desenvolvimento. Esta questão é ampliada para gabaérgica interneurônios, uma população celular incrivelmente heterogênea que nasce das estruturas embrionárias transitórias e passam por uma fase migratória prolongada para dispersar ao longo do telencéfalo. Para explorar diferentes como cérebro ambientes afetam interneurônio destino e maturação, desenvolvemos um protocolo para a colheita fluorescente etiquetadas interneurônio imaturo precursores de regiões específicas do cérebro em ratos recém-nascidos (P0-P2). Nesta idade, migração de interneurônio está quase completa e estas células são residentes em seus ambientes de descanso finais com relativamente pouca integração sináptica. Coleção de soluções de célula única via citometria de fluxo, na sequência destes precursores interneurônio são transplantados P0-P2 sua filhotes pós-natal. Através da realização de ambos homotopicamente (por exemplo, córtex-para-córtex) ou heterotópica (por exemplo, córtex-para-hipocampo) transplantes, pode avaliar como desafiador interneurônios imaturos em novos ambientes de cérebro afeta seu destino, maturação e integração do circuito. Cérebro pode ser colhido em ratos adultos e analisado com uma grande variedade de análises posthoc enxertados em células, incluindo a imuno-histoquímica, eletrofisiológicos e transcriptional de criação de perfil. Esta abordagem geral fornece investigadores com uma estratégia a ensaiar como distintos ambientes do cérebro podem influenciar numerosos aspectos do desenvolvimento do neurônio e identificar se especificidade neuronal é conduzida principalmente por programas genéticos hardwired ou Dicas ambientais.
Introduction
Função cortical adequada requer um equilíbrio entre neurônios de projeção excitatória e inibitória gabaérgica interneurônios, uma população extremamente heterogêneo com morfologias distintas, Propriedades eletrofisiológicas, conectividade e neuroquímicos marcadores. Desenvolvimento anormal e função de interneurônios (e subgrupos específicos interneurônio) tem sido associada com o Patobiológico de transtornos psiquiátricos como esquizofrenia, autismo e epilepsia1,2,3. Além disso, muitos genes implicados nestes distúrbios cerebrais são fortemente enriquecidos em interneurônios jovem4. Assim, uma maior compreensão dos mecanismos que regulam a maturação e interneurônio destino determinação é necessária para compreender o desenvolvimento normal e potenciais etiologias de numerosas doenças do cérebro.
Interneurônios prosencéfalo nascem principalmente a partir de duas estruturas embrionárias transitórias, as medial e caudais Eminências ganglionar (MGE e CGE, respectivamente). Estas células postmitotic (precursores de interneurônio) em seguida, passam por uma fase de migração tangencial prolongada para dispersar ao longo do telencéfalo onde eles integrarem uma grande variedade de circuitos. MGE-derivado interneurônios consistem em três subgrupos em grande parte não-sobreposição, neuroquimicamente definidos: rápido spiking interneurônios parvalbumin (PV+), não-fast spiking interneurônios somatostatina (SST+) e tarde cravação neuronal nítrico Interneurônios óxido de sintase (nNOS+) que constituem as células neurogliaform e ivy hippocampal. Numerosos laboratórios identificaram vários mecanismos dentro do MGE que regulam o destino inicial as decisões em PV+ ou SST + interneurônios, incluindo gradientes espaciais de morphogens, data de nascimento de precursores interneurônio e o modo de divisão neurogênica 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. tem sido proposto que interneurônios inicialmente diferenciarem em 'classes cardeais' e em seguida, progressivamente maduro em 'classes definitivas', como eles interagem com seu ambiente11. Provas recentes indicam que alguns subtipos de interneurônio maduro podem ser geneticamente hardwired como essas células se tornam postmitotic nas Eminências ganglionar, indicando que os programas genéticos intrínsecos definidos precoce podem desempenhar um papel maior do que anteriormente agradecido12,13. No entanto, a questão fundamental de como os programas genéticos intrínsecos interagem com pistas ambientais para diferenciação de unidade em subtipos distintos interneurônio permanece largamente inexplorada.
Numerosos estudos transplantamos células embrionárias MGE diretamente em uma variedade de regiões do cérebro, com os resultados de consenso que transplantaram células maduras e liberação de GABA para inibir geralmente o circuito endógeno local14,15, 16,17,18,19. Estas observações de prometendo geraram interesse significativo no uso de células-tronco pluripotentes induzidas humana (hIPSC)-derivado de interneurônios para tratar uma variedade de doenças do cérebro. No entanto, muito poucos desses estudos avaliar se estas células enxertadas maduro em tipos esperados dos interneurônios maduros, um componente crítico quando se pensa em abordagens translacionais.
Para resolver, como o ambiente influencia interneurônio diferenciação e maturação, uma estratégia foi concebida para transplante de precursores imaturos interneurônio em novos ambientes de cérebro a fim de examinar se enxertados interneurônios adotam características do host ambiente ou manter características do doador ambiente20. MGE transplantes não são adequados para abordar esta questão, porque o MGE contém uma população mista de interneurônio e células de projeção gabaérgica que dispersarem ao longo de inúmeras regiões de cérebro21. Sem saber onde estas células MGE que migraram, um pode não totalmente avaliar como esses transplantes são afetados pelo ambiente de cérebro. Por colheita precursores interneurônio no início pós-natal momentos, este problema é contornado pela obtenção de células imaturas que completou sua migração e atingiu sua meta região do cérebro, mas ter a mínima interação com o ambiente. Centrando-se em características específicas de interneurônios diferencialmente expressos entre regiões distintas do cérebro, pode então determinar como o ambiente de host muda Propriedades interneurônio. A abordagem geral descrita no presente protocolo deve ser aplicável para qualquer investigador que quer examinar os neurônios como jovens se comportam quando desafiado em um novo ambiente.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health e foram aprovados pelo cuidado do Animal de FORMULADORES e Comissão de utilização (ACUC). O protocolo descrito abaixo utiliza Nkx2.1-CreC / +; Ai9+ /- filhotes para colher precursores interneurônio MGE-derivado, mas podem ser executadas em qualquer linha de rato repórter fluorescentes desejado. Masculinos e femininos ratos pós-natal precoce (P0-P2) foram utilizados indiscriminadamente para tecido doador e host.
1. preparação da solução
- Prepare-se sacarose artificial líquido cefalorraquidiano (sACSF) de acordo com a seguinte receita (unidade em mM): NaCl 87, 26 NaHCO3, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 glicose, sacarose 75 saturado com 95% O 2, 5% de CO2 em pH = 7.4.
- Encha um copo com 350ml ddH puro2O com base no volume final desejado (500 mL de sACSF deve ser suficiente para ninhadas de 1-2), adicionar uma barra de agitação magnética e colocar o copo sobre a placa de agitação.
- Peso de todos os sais (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4, glicose, sacarose), um de cada vez e adicione à água de acordo com a tabela a seguir. Quantidades podem ser ajustadas dependendo do volume final desejado.
Reagente Peso molecular Concentração (mM) Gramas/500 mL Cloreto de sódio 58.44 87 2.54 Bicarbonato de sódio 84.01 26 1,09 Cloreto de potássio 74.55 2.5 0,09 Fosfato de sódio monobásico 119.98 1.25 0.08 Glicose 180.16 10 0.9 Sacarose 342.3 75 12.84 - Bolha a solução com 95% O2, 5% CO2 (carboxygen) pelo menos 20-30 minutos antes de adicionar a quantidade apropriada de CaCl2 (0,25 mL de uma solução 1 M para sACSF de 500 mL) e MgCl2 (3,5 mL de uma solução 1 M para sACSF de 500 mL) .
- Verifica o pH usando um medidor de pH padrão. Se preparado corretamente, a solução deve ter pH = 7,4.
- Trazer a solução para o volume final de 500 mL com puro ddH2O em um cilindro graduado.
- sACSF pode ser preparado até 1-2 dias à frente. Antes de usar, Coloque gelo bolha com carboxygen pelo menos 15 minutos antes do início da dissecação e mantenha o frasco de sACSF borbulhar durante a dissecação.
2. dissecação preparação
- As seguintes ferramentas devem ser esterilizadas/esterilizadas: pelo menos um bem afiadas tesouras pequenas, 2 pinça fina (estilo #5), pinça fina, cérebro matrice molde e várias lâminas de corte em curva. Uma pequena espátula para remover o cérebro do crânio é opcional.
- Configurar a estação de trabalho perto de microscópios de dissecação, com pratos de petri (9 cm e diâmetros de 4 cm), 50 mL cônicos tubos plásticos para recolher as regiões do cérebro isolado e grande furo plástica transferência pipetas, todos mantidos no gelo. Prepare vários tubos de 50ml cheios de sACSF de carboxygenated no gelo. Se mais de uma região do cérebro de dissecação, certifique-se de corretamente e rotular claramente tanto os tubos de coleção e as pipetas de transferência para evitar a contaminação.
- Tem um balde de gelo adicional para anestesia de gelo dos filhotes através de hipotermia e um saco de adequada de resíduos perigosos para descarte de carcaças.
- Prepare fogo polido vidro que pipetas Pasteur para trituração de tecido. Use um bico de Bunsen para esterilizar e dar forma a ponta da pipeta. Preparar várias pipetas com aberturas diferentes do furo: grande (~ 600 µm), médio (~ 300 µm) e pequeno (~ 100 µm). Testar o fluxo através de dicas usando água para garantir a trituração de diferentes velocidades. Pipeta de pelo menos um de cada tipo é necessária para cada região de cérebro isolado, mas ter vários extras para cada tamanho é recomendado em caso de entupimento ou quebra dicas.
3. transplante preparação
- Use um extrator de eletrodo para preparar Micropipetas de vidro de ponta fina. Quebrar ou chanfrar a ponta para fazer um ponto afiado em ângulo, com a ponta de diâmetro de ~ 20-40 µm. Inspecione visualmente as pontas com um microscópio para não garantir que nenhuma poeira ou partículas de vidro residual estão obstruindo a abertura.
- Utilizando uma seringa de agulha fina, preencha completamente a micropipeta de vidro com óleo mineral. Insira a micropipeta no aparelho de Nanoject (ou outro dispositivo de microinjeção). Para o III Nanoject, configurar o programa a seguir: Volume = 60 nL, taxa = 30, ciclos = 25, Delay = 1 s.
- Proteja o Nanoject para o manipulador é anexado a uma base magnética e ajustar o manipulador para que o Nanoject está apontando para baixo, não inclinada ao longo do x ou y eixo.
- Anexar uma massa adesiva (~ 1-2 cm para filhotes P0-P2) à parte superior da tampa de um prato de petri, criando uma superfície elevada para descansar a cabeça do filhote de cachorro na.
- Corte ~ 6-8 cm listras longas do laboratório de fita e fazem um buraco em forma de diamante no meio. A fita será usada para estabilizar a cabeça do filhote durante o procedimento, ao mesmo tempo esticar a pele e permitindo a fácil visualização do Marcos e da região de destino.
- Prepare uma almofada de aquecimento ao lado da estação de injeção e ative a configuração de 'baixa' antes de começar as injeções. Cobrir a almofada com toalhas de papel ou uma almofada de fralda.
- Se realizando várias condições de transplante, tem uma pequena tesoura pronta para realizar recorte do dedo do pé/cauda a tag Puppies receber injeções diferentes.
4. remoção de cérebro de rato P0-P2
- Bem antes de iniciar o procedimento, preencha várias caixas de Petri com refrigerados, carboxygenated sACSF. Também encha os tubos de coleta com sACSF ~ 25 mL.
- Embrulhe um filhote P0-P2 em alguns parafilm ou uma luva e o lugar que é bem coberto sob o gelo. Definir um temporizador para 5 minutos e iniciá-lo. Após esse tempo, retire o filhote e verificar que não responde a beliscar do hindpaw.
- Decapitar o filhote e recolher a cabeça em uma placa de Petri cheia de sACSF. Corte a pele ao longo da linha mediana para expor o crânio.
- Localize a abertura no crânio na medula espinhal/rombencéfalo e insira uma extremidade da pinça ao longo da porção dorsal do crânio. Delicadamente, segure o crânio na linha e 'descascar' peças afastadas lateralmente para expor o cérebro, tomando cuidado para não danificar o cérebro.
- Após a remoção da porção dorsal e lateral do crânio, use a pinça ou espátula para remover suavemente o cérebro do crânio por escavar abaixo da superfície ventral do cérebro, a tentar não danificar qualquer área. Coloca o cérebro em outra placa de Petri preenchida com carboxygenated sACSF.
Nota: Apresentamos duas estratégias diferentes para dissecar para fora o hipocampo, corpo estriado e córtex. A primeira estratégia (etapas 5.1-5.10) é útil para qualquer linha de rato, Considerando que a segunda estratégia (etapas 6.1-6,7) precisaria de um mouse de repórter fluorescentes para separar corretamente o striatum do globo pálido e outras estruturas do cérebro. Se não for desejado corpo estriado, então ignore as partes específicas do corpo estriado das duas técnicas
Figura 1 : Diagrama esquemático e imagens para dissecação cerebral, técnica #1
Técnica de dissecação descrita nos passos 5.1-5.10. Se o tecido striatal é desejado, coloque cérebro P1 no lado ventral do cérebro matrizes. Colocar lâminas de barbear nas ranhuras de matrice através do cérebro anterior para obter as seções coronais através do corpo estriado. Remover peças striatal de ambos os hemisférios, repita para todas as seções que contenham striatum que estão à frente do hipocampo. Se tecido striatal não é desejado, simplesmente hemisect o cérebro, coloque no prato do lado medial os hemisférios e remover as estruturas do cérebro ventral-medial (tálamo, gânglios, etc.) para expor o hipocampo. Use uma pinça para pitada de hipocampo, em seguida, vire o hemisfério e usar uma pinça para dissecar para fora um pedaço de tecido cortical. As linhas pretas verticais através os hemisférios esquemáticos onde os cortes seria para remover as seções de striatal. Barra de escala = 500μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. colheita Striatum, hipocampo e córtex, técnica #1
- Coloque todo o cérebro no seccionamento matrice molde, lado ventral acima. Coloque 1 lâmina através da porção mais anterior do cérebro (através do trato olfatório anterior).
- Insira a lâmina de barbear outra só posterior ao primeiro para gerar uma fatia de 0,5 mm e coloque uma lâmina de barbear adicional posterior a esta.
- Transferir estes cortes para uma placa de Petri com carboxygenated sACSF e coloque o resto do cérebro para um prato separado com sACSF. Transfira as fatias striatal para um escopo de dissecação para visualizar striatum. Essas fatias devem conter grandes porções do striatum anterior e falta de hipocampo. Use um fluorescente dissecando o escopo com Nkx2.1-Cre+ /-; Ai9fatias de+ /- para diferenciar o tdTomato fraco striatal do sinal do sinal forte tdTomato do globo pálido.
- Com ou sem fluorescência, pitada para fora o corpo estriado de ambos os hemisférios em todas as seções e transferência striatal pedaços de tubo de 50ml corretamente etiquetados com sACSF, armazenar no gelo.
- Hemisect o cérebro ao longo da linha mediana usando fórceps ou uma lâmina de barbear, e leigos do Hemisfério para que a superfície medial é virada para cima.
- Remova o tecido de cérebro ventral (tálamo, gânglios basais, etc) por beliscar fora este tecido com fórceps. Quando completo, o hipocampo (uma estrutura em forma de salsicha abrangendo o eixo ântero-posterior ao longo do córtex dorsal) e ventrículo lateral do córtex deve ser claramente visível.
- Para remover o hipocampo, insira as pontas da pinça na frente do hipocampo anterior e suavemente separar o hipocampo córtex movendo o fórceps posteriormente e comprimir ao longo da fronteira hippocampal-cortical. Transfira o hipocampo isolado para tubo de 50ml corretamente etiquetados com sACSF, armazenar no gelo.
- Para dissecar o córtex, coloque o lado medial córtex hemisected para baixo. Em seguida, use a pinça para beliscar mais dorsal, ventrais, anteriores e posteriores porções do córtex para deixar um pedaço quadrado do córtex somatossensorial medial, ~ 2 mm x 2 mm. Flip o córtex então lado medial é acima e limpo de qualquer excesso de tecido não-cortical (tálamo gânglios, etc.) na superfície medial, se necessário. Transferir a parte do córtex para tubo de 50ml corretamente etiquetados com sACSF, armazenar no gelo.
- Repita o procedimento com o outro hemisfério para coletar hipocampo e córtex regiões.
- Repita este procedimento para todos os filhotes, certificando-se de substituir o sACSF nos pratos de petri entre filhotes para garantir que o sACSF permanece frio e fresco.
Figura 2 : Diagrama esquemático e imagens para dissecação cerebral, técnica #2
Técnica de dissecação descrita nos passos 6.1-6,7. Cérebro de PIN para uma dissecação prato dorsal para cima. Depois de descascar o córtex para a frente, o hipocampo e o corpo estriado são visíveis e podem ser removidos, em seguida, uma seção do córtex pode ser removida conforme descrito na técnica anterior. Dependendo da linha de rato transgénico, striatum pode ser limpa para remover globus pallidus e outros tecidos. Em Nkx2.1Cre; Ai9 linha de rato, o globo pálido tem uma densidade significativamente maior de tomate + células em comparação com o corpo estriado. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. colheita Striatum, hipocampo e córtex, técnica #2
- Coloque do lado ventral do cérebro para baixo em um prato de petri sylgard revestido contendo sACSF e fixá-lo através do cerebelo e córtex anterior ou bulbos olfatórios.
- Começando com um hemisfério, use fórceps curvado delicadamente separar o córtex posterior do hipocampo subjacente e outros tecidos. Colocar suavemente o córtex pelado plana na placa de Petri. Repita para o outro hemisfério. Hipocampo e striatum devem ser claramente visíveis no cérebro exposto.
- Use fórceps para beliscar um hipocampo na linha e descasque o hipocampo lateralmente para remover. Coloque no frasco de recolha no gelo e repita com outro hipocampo.
- Para o corpo estriado, raspe suavemente em torno das bordas do striatum para soltá-lo no tecido circundante. Retire o striatum por Beliscá-lo fora de debaixo e adicione ao tubo de coleta no gelo. Repita para o outro corpo estriado.
- Seções corticais podem ser colhidas conforme descrito na etapa 5,8.
- Se usando uma linha de rato transgénico repórter (por exemplo, Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-as boas práticas agrícolas, etc.), corpo estriado de transferência para uma placa de Petri com sACSF e vista sob fluorescente dissecando o escopo. Use a pinça para remover qualquer resto de tecido não-striatal do striatum (em Nkx2.1-Cre; Ai9 ratos, remover todo o tecido 'brilhante', como globus pallidus tem muito MGE-derivado, tdTomato + célula uma densidade mais elevada em relação ao corpo estriado). Repita para todo corpo estriado.
- Repita este procedimento para todos os filhotes, certificando-se de substituir o sACSF nos pratos de petri entre filhotes para garantir que o sACSF permanece frio e fresco.
7. gerando única célula dissociações
- Após a dissecação é completa, prepare um 1 mg/mL solução Pronase pesando 10 mg Pronase e dissolver em 10 mL carboxygenated sACSF.
- Transferência do tecido de frascos de coleta de 50 mL a 5 mL redonda tubos contendo 2 mL da solução Pronase-sACSF. Incube o tecido por 20 min em temperatura ambiente, agitação/sacudir o tubo 3 - 4 vezes com o dedo durante a incubação a misturar as amostras.
- Durante esta incubação, preparar a solução de reconstituição: 1% FBS (100 μL) + DNAse (1 μL de 1:10,000 estoque DNAse) em 10 mL carboxygenated sACSF.
- Após os 20 minutos, Retire cuidadosamente a solução pronase para não perturbar o tecido na parte inferior e substituí-lo por 1-2 mL da solução de reconstituição (volume total é dependente começando a quantidade de tecido).
- Mecanicamente, dissocia o tecido por moer o tecido com as pipetas de Pasteur polido fogo previamente preparados. Começando com a grande furo (~ 600 µm) pipeta, aspirar e expelir a solução de tecido pelo menos dez vezes para romper o tecido. Não introduza bolhas a solução. Repita este processo por meio de pipeta do furo e o pequeno furo pipeta. A solução deve ser nublada e sem claro pedaço de tecido deve ser visível em tubos de coleção.
- Pipeta agrupa a solução lisado celular através de um filtro de 50 µm em tubos cônicos de 5 mL para remover qualquer célula. Prosseguir com essas soluções de célula única para citometria de fluxo (ou potencialmente diretamente a célula contando se nenhuma classificação é necessária).
8. Preparar soluções FACS-purificado de células para transplante
- Após receber as soluções de célula o citômetro de fluxo, transferir a solução para um (ou vários) tubos cônicos de 1,5 mL e girar as células a 500 g durante 5 min à 4oC. Após a centrifugação, remover mídia então aquele ~ 20-40 µ l permanecem no tubo. Reconstituir células neste restante de mídia (e combinar a solução se eram necessários vários tubos).
- Em um pequeno pedaço de parafilm, misture 2 µ l da solução celular + 8 µ l sACSF + 10 µ l de mancha azul trypan. Pipeta de 10 µ l em um hemocytometer com tampa corrediça.
- Contar o número de células vivas em cada uma das grades 4 x 4 quadradas nos cantos do hemocytometer usando um contador de contagem de mão padrão de laboratório (células mortas será azuis da tintura), e estes 4 contagens a média. Multiplique esse número por 100, para determinar o número de células por µ l.
- Se necessário, ajuste o volume para que as células estão em uma concentração de 10.000-30.000 células / µ l de solução de reconstituição. Concentração final é dependente da quantidade total de células e o número desejado de transplantes. Manter as células no gelo para transplante
9. transplante em WT P0-2 filhotes
- Embrulhe um filhote WT em alguns parafilm ou uma luva e o lugar que é bem coberto sob o gelo. Definir um temporizador para 5 min e iniciá-lo. Após esse tempo, retire o filhote e verificar que não responde a beliscar do hindpaw.
- Enquanto o filhote está no gelo, misturar a solução de células pipetando-lo várias vezes para garantir a suspensão celular é bem misturada previamente ao seu embarque (misturar as células antes de carregar a micropipeta para cada injeção). Em seguida Esvazie a micropipeta de óleo mineral e preenchê-lo completamente com a suspensão de eritrócitos.
- Coloque o filhote anestesiado com cabeça deitado sobre a massa adesiva para que o topo da cabeça é relativamente plano sobre o prato de petri. Coloque a fita com o furo do diamante em toda a cabeça do filhote, puxando-o tenso para garantir que a pele é esticada e a cabeça é firme, mas que o mouse é bem confortável e a respirar. Lambda deve ser visível através do orifício de diamante.
Figura 3 : Diagrama esquemático e imagens para transplante
(A) fotos da instalação de injeção. Observe que lambda é claramente visível através do crânio do filhote de cachorro e deve ser usado para zerar a micropipeta. Barra de escala = 1 polegada. (B) esquema mostrando o procedimento de injeção alvo do hipocampo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Mova o filhote protegido sob o Nanoject e baixar a micropipeta, de modo que a ponta da micropipeta a está diretamente acima de lambda. Gravar as coordenadas x-y no manipulador.
- Ajustar os manípulos do manipulador para mover a micropipeta para as coordenadas desejadas ao longo do mediolateral e o eixo ântero-posterior da cabeça: → S1 córtex anterior 1,0 mm e 1.0 mm lateral, hipocampo → 0.75-1.0 mm anterior e lateral de 1.0-1.2 mm, corpo estriado → 2.0-2.2 mm anterior e lateral de 1,5 mm. As coordenadas podem ser ajustadas ligeiramente para compensar a idade do filhote (por exemplo, P0 vs P2) ou a cepa de ratos (por exemplo, CD1 ratos são maiores do que e C57/B6 em P2).
- Baixe a micropipeta até formar uma pequena concavidade na pele. Então gire o botão de manipulador do eixo z com firmeza, mas suavemente para dirigir a micropipeta através da pele e o crânio para entrar no cérebro. Quando a micropipeta entra no cérebro, a pressão no crânio será lançada e a concavidade desaparecerá.
- Retrai a micropipeta ligeiramente até que a ponta está rodeada por um cone de pele, a forma de uma tenda. Ler as coordenadas ao longo dos eixos z: este será o ponto do eixo z de zero.
- Baixe a micropipeta para a profundidade desejada: córtex → 0.75-1.0 mm, hipocampo → 1.2-1.5 mm, lata de 2.0-2.5 mm. profundidade do Striatum → ligeiramente ajustadas para compensar a idade ou estirpe do filhote.
- Injete a suspensão de células usando o programa Nanoject III descrito acima. Após a injeção programa completo, esperar 15-20 s antes lentamente retraindo a micropipeta para minimizar a solução vazando para fora do local da injeção.
- Se realizando bilateral injeções, re-zero a micropipeta acima lambda e mover-se para as coordenadas adequadas no outro hemisfério. Alternativamente, pode-se fazer duas injeções no córtex do hemisfério mesmo movendo a micropipeta 1 mm anterior da primeira injeção.
- Uma vez concluída a transplantação, remova a fita e transferir o filhote sobre a placa de aquecimento. Se necessário, marca o filhote pelo recorte de cauda ou dedo do pé. Uma vez que o filhote tem readquirido uma cor vermelha e está se movendo, coloque-o em gaiola com a mãe.
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Representative Results
Este protocolo demonstra como colheita de regiões cerebrais específicas do cérebro pós-natal precoce (Figura 1-2), coletar dissociações única célula de precursores interneurônio e transplante dessas células em várias regiões do cérebro ingênuo WT filhotes pós-natal (Figura 3). Para análises posthoc, cérebros que recebeu interneurônio precursor enxertos foram colhidos entre P30-35 para caracterizar a morfologia celular, marcadores neuroquímicos e propriedades eletrofisiológicas. Esses tipos de ensaios são frequentemente realizados entre P21-P30 em ratos normais, mas desde que a maturação das células transplantadas pode ser um ligeiro atraso devido ao processo de dissecação/dissociação, esperar um adicional de 5-10 dias é recomendado para compensar este maturação retardada. O tipo de análise a ser realizada vai ditar a estratégia adequada para colher o cérebro. Em particular, nós não observaram morte celular preferencial dos subgrupos específicos interneurônio que poderia influenciar a favor ou contra determinados subtipos de20.
Para a análise imuno-histoquímica, ratos foram perfundidos com paraformaldeído 4% e os cérebros foram removidos. 50 μm vibratome fatias foram preparadas pela região específica do cérebro e armazenadas em solução anticongelante e/ou transformadas para immunostaining como descrito anteriormente,20. Um pouco de cérebro não continha qualquer tomate + células, que poderiam ser devido à inadequada como alvo (por exemplo, a injeção muito fundo para o ventrículo), células perdidas ou passando por apoptose durante o procedimento de enxerto, ou a rejeição das células transplantadas pelo host. Com base na contagem de células final, estima-se que apenas 2-5% de células transplantadas sobreviver20, que está em consonância com outros procedimentos de transplante22,23.
Não surpreendentemente, não houve variabilidade significativa no número total de células tomate + em transplantes bem sucedidos, que variam de dezenas a várias células mil tomate + (Figura 4A). As células transplantadas foram localizadas nas regiões corretas, com muitos exibindo morfologias interneurônio e bem caracterizadas interneurônio neuroquímicos marcadores (Figura 4B). Números semelhantes de sobrevivência celular e perfis de maturação foram observados mesmo quando as células foram enxertadas em novos ambientes em transplantes heterotópica (Figura 4).
Além de análise imuno-histoquímica, realizou-se análise eletrofisiológica em células transplantadas para confirmar que eles integraram em circuitos cerebrais e exibir propriedades intrínsecas e disparando esperadas. Cérebros foram colhidos de P30-35 ratos e fatias preparado para gravações fisiológicas como anteriormente descrito,20. Os interneurônios transplantados apresentaram propriedades fisiológicas como adulto e fuzilamento distinto padrões podem ser caracterizada que eram representativas de interneurônio bem caracterizada subtipos (Figura 5A), sugerindo que enxertados interneurônios foram capazes de amadurecer adequadamente no ambiente de host. Para verificar que as células transplantadas foram integradas na rede neuronal, sEPSCs também foram registrados (Figura 5B). Além disso, um subconjunto de transplantes foram realizados com interneurônios expressando ChR2 seguido por gravação de células piramidais localizados perto de interneurônios transplantados. Esses dados demonstraram que pós-sináptica gabaérgica correntes são evocadas por luz azul (Figura 5-D).
Figura 4 : Enxertados interneurônio precursores preenchem regiões do cérebro anfitrião seções representativas de ratos de P30 WT que foram transplantados com tomate + precursores interneurônio no P1. (A) homotopicamente transplantes de córtex-para-córtex, as células transplantadas preenchem todas as camadas corticais em Exibir morfologias que imitam interneurônios endógenos. Imagens selecionadas destacam a variabilidade no número de células de diferentes transplantes, com imagem à esquerda, tendo um número muito maior de tomate + células por seção, em comparação com o transplante do lado direito. (B) baixa ampliação (à esquerda) e seções representativas de alta magnificação (à direita) de enxertos do hipocampo-para-hipocampo homotópico. Note que a maioria das células tomate + no estrato oriens (então) express SST (células susceptíveis de O-LM) Considerando que muitas células tomate + no estrato pyramidale (SP) expressam PV (células cesta provável), semelhante ao interneurônios hippocampal endógenos. (C) exemplo de um transplante heterotópico (córtex-a-corpo estriado) com tomate + presente no striatum. Escala de barras = 200 μm na no painel de baixo mag em B, 50 μm em C e alta potência mag em B. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Enxertados interneurônios são electrophysiologically maduros e integrar na rede neuronal do host
(A) exemplos representativos nas frequências mais altas fuzilamento gravado a partir de interneurônios enxertados. Esquerda, Fast Spiking interneurônio de um enxerto de quadril-para-Ctx, injetado passos atuais: pA-100 e 520 pA; certo, Non-Fast Spiking interneurônio de um enxerto de Ctx-para-Ctx, injetado atuais passos: -100 pA e 360 PA. (B) exemplo de sEPSCs gravado em um interneurônio tarde cravação de um transplante de quadril-quadril. (C) imagem representativa exibindo Nkx2.1-Cre; Ai32 (YFP) de células de um-para-Ctx Ctx transplante com uma célula piramidal (vermelha) cheio de biocytin. Barra de escala = 50 μm. (D) exemplo de um correntes pós-sinápticas gabaérgica evocada por pulsos de luz azuis gravado nas células piramidais, gravado com uma [145 mM] Cl-. Em traços negros, médios; em vermelho, médio de resposta gravada na presença de Gabazine. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um aspecto crítico deste protocolo é maximizar a capacidade de sobrevivência das células. Garantindo que os tecidos e as células são sempre em sACSF de carboxygenated fria como o gelo é necessário promover a sobrevivência da pilha. Isto requer uma dissecção eficiente e estratégia de dissociação para minimizar o comprimento de tempo que as células gastam em solução várias e fora do ambiente do cérebro. Dependendo do número de regiões do cérebro sendo dissecado e transplantados, pode ser útil ter um parceiro nas etapas a dissecação e/ou transplante de auxílio para diminuir o comprimento do experimento. Para garantir a saúde e a sobrevivência do filhote, é também fundamental para minimizar o tempo de anestesia de gelo (< 4 min) e manter o filhote aquecido com luz durante o procedimento de transplante.
Pode haver variabilidade significativa no cérebro transplantado, alguns não podem conter quaisquer células enxertadas, enquanto outros cérebros conterá milhares. Combinar várias ninhadas de P0-P2 para dissecação pode aumentar o número de células colhidas para enxertia, que permite aumentar a densidade celular do transplante e/ou o aumento do número de filhotes enxertados, ambos os quais irão melhorar a probabilidade de transplantes de sucesso. Para atingir a região do cérebro apropriada, é fundamental que do filhote está estabilizada e não se move quando abaixar a micropipeta para o cérebro. Qualquer movimento da cabeça ou flexão do eixo micropipeta pode resultar em injeções mistargeting e imprecisas (tais como a perda de células para o ventrículo lateral). Além disso, realizar vários sites de injeção por filhote (unilateralmente ou bilateralmente) pode melhorar taxas de sucesso no caso de um local de injeção é mistargeted. No futuro, seria ideal para desenvolver uma estratégia mais eficiente estereotáxica para estabilizar o filhote e fornecer injeções mais precisas e consistentes.
Frame de tempo Th P0-P2 foi escolhido por razões científicas e técnicas. Nesta idade, a maioria dos precursores interneurônio migraram para seus sites terminais mas têm interacções ambientais mínimas. Neste período de tempo não pode prender verdadeiro para outros tipos de células neuronais e regiões do cérebro, então um pode querer ajustar estes momentos para seus fins específicos. Por exemplo, seria interessante comparar o potencial terapêutico destes precursores de interneurônio P0-P2 colhidas com células colhidas-MGE: uma idade pode ter mais benefícios e/ou menos indesejáveis efeitos colaterais do que o outro. Além disso, pode ser interessante realizar transplantes heterocrónico (por exemplo, coletando células em P0-P2 e transplantar em cérebros P7-10, ou vice versa) identificar alterações como temporais no ambiente pode afetar o destino de célula e maturação. A vantagem de executar injeções em P0-2 é que o crânio é relativamente fino e pode ser facilmente penetrado com uma micropipeta afiada. Qualquer injeções sobre P5 exigirá a remoção ou diluindo o crânio.
A análise descrita neste protocolo é limitada às características específicas dos subtipos de interneurônio diferencialmente expressos entre regiões do cérebro. No futuro, um poderia utilizar o poder do sequenciamento de célula única para caracterizar a completa transcriptoma das células transplantadas. Esta abordagem imparcial poderia identificar genes específicos (ou maiores cascatas de sinalização) que são fortemente enriquecido ou empobrecido em células transplantadas, comparadas aos controles, que iria fornecer a introspecção do candidato pistas ambientais que iria influenciar o destino determinação ou maturação.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health (K99MH104595) e o programa de pesquisa intramural FORMULADORES para T.J.P. Agradecemos Gord Fishell, em cujo laboratório esta abordagem foi estabelecida originalmente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
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