Summary
מאתגר צעיר הנוירונים באזורים במוח חדש יכול לחשוף תובנות חשובות איך הסביבה מפסל גורל עצביים ועם בגרות. פרוטוקול זה מתאר הליך כדי לקצור מבשרי interneuron מאזורים ספציפיים במוח, השתלת אותם גם homotopically או heterotopically לתוך המוח של הגורים כמחנכת.
Abstract
גורל עצביים נחישות ועם בגרות דורשת מורכבות הגומלין בין הסביבה אותות ותוכניות גנטי. אולם, disentangling את התפקידים של מהותי לעומת חיצוני מנגנונים המסדירים את תהליך בידול זה היא בעיה עבור כל neurobiologists התפתחותית. בעיה זו מוגדל עבור GABAergic interneurons, אוכלוסיה הטרוגנית מאוד תא נולד מתוך מבנים עובריים ארעי, עוברים שלב הנדידה ממושך כדי לפזר ברחבי telencephalon. על מנת לחקור כמה שונה המוח סביבות משפיעים על interneuron הגורל ועם בגרות, פיתחנו פרוטוקול עבור קציר שכותרתו fluorescently interneuron לא בוגר מבשרי מאזורים ספציפיים במוח בעכברים היילוד (P0-P2). בגיל הזה, interneuron ההעברה כמעט מושלם, תאים אלה מתקיימות בסביבות מנוחתו הסופי שלהם עם יחסית מעט שילוב סינפטית. בעקבות אוסף של פתרונות תא בודד באמצעות cytometry זרימה, אלו סימנים מקדימים interneuron מושתלים לתוך P0-P2 wildtype לאחר הלידה הגורים. על ידי ביצוע שני homotopic (למשל, קליפת-כדי-קליפת) או הטרוטופיות (למשל, קליפת-כדי-היפוקמפוס) השתלות, אחד לא יכול להעריך איך מאתגר interneurons ילדותי בסביבות המוח החדש משפיע שלהם הגורל, ההבשלה ושילוב במעגל. המוח יכול להיות שנקטפו בעכברים בוגרים, לבדיקה עם מגוון רחב של ניתוח posthoc על תאי המושתל, כולל immunohistochemical, אלקטרופיזיולוגיות, תעתיק פרופיל. כללי לגישה זו חוקרים עם אסטרטגיה assay סביבות מובחנות איך המוח יכול להשפיע על היבטים רבים של פיתוח נוירון ולזהות אם תכונותיה עצביים מונעים בעיקר על-ידי תוכניות גנטי קשיחה או רמזים סביבתיים.
Introduction
בקליפת המוח לתפקוד תקין דורש איזון בין הנוירונים הקרנה סינאפסות מעכבות GABAergic interneurons, אוכלוסיה הטרוגנית מאוד ברורים מורפולוגיות, מאפייני אלקטרופיזיולוגיות, קישוריות, עצבית סמנים. התפתחות לא תקינה ותפקוד של interneurons (וגם interneuron ספציפיים תת-קבוצות) נקשר את pathobiology של הפרעות פסיכיאטריות כגון סכיזופרניה, אוטיזם, אפילפסיה1,2,3. יתר על כן, גנים רבים מעורבים אלה הפרעות מוח חזק מועשר interneurons צעירים4. לפיכך, הבנה טובה יותר של המנגנונים המווסתים interneuron הגורל נחישות ועם בגרות יש צורך להבין להתפתחות התקינה של פוטנציאל אטיולוגיה של מחלות מוח רבים.
Interneurons הקדמי נולדים בעיקר מן שני מבנים עובריים ארעי, הרוחביים ganglionic המדיאלי, סימטרית (MGE ו- CGE, בהתאמה). אלו תאים postmitotic (interneuron סימנים מקדימים) ואז לעבור שלב ההעברה וצורניים ממושך כדי לפזר ברחבי telencephalon שבו הם לשלב מגוון רחב של מעגלים. Interneurons MGE-derived מורכב שלוש תת-קבוצות במידה רבה שאינם חופפים, neurochemically הגדרה: עולה מהר parvalbumin (PV+) interneurons, במהירות שאינה עולה somatostatin (SST+) interneurons, ולא מאוחר עולה עצביים חנקתית תחמוצת interneurons סינתאז (nNOS+) המהווים תאים neurogliaform ואייבי בהיפוקמפוס. מעבדות רבות זיהו מספר מנגנונים בתוך MGE המסדירים גורל הראשונית החלטות PV+ או SST + interneurons, כולל מעברי צבע המרחבי של אורגניזם, תאריך לידה של סימנים מקדימים interneuron המצב של חטיבת neurogenic 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. זה הוצע כי interneurons להבדיל בתחילה למחלקות' מונה', ואז בהדרגה בוגר למחלקות' סופי' כפי שהם אינטראקציה עם הסביבה שלהם11. הראיות זה התבצעה מציין כי כמה סוגי interneuron בוגר עלול להיות גנטית קשיחה כמו תאים אלה הופכים postmitotic, ganglionic הרוחביים, המציין כי מוקדם שהוגדרו מהותי גנטי תוכניות עשוי לשחק תפקיד גדול יותר מאשר בעבר בברכה12,13. שאלת המפתח של מה תוכניות גנטי מהותי אינטראקציה עם רמזים סביבתיים ליצור בידול לתוך תת interneuron ברורים, אולם נותרה נחקרו במידה רבה.
מחקרים רבים יש להשתיל תאים עובריים MGE ישירות לתוך מגוון של אזורים במוח, עם התוצאות קונצנזוס זה הושתל תאים בוגרים ולשחרר גאבא לעכב את המעגלים אנדוגני המקומי14,15, בדרך כלל 16,17,18,19. אלה המבטיח תצפיות יצרו עניין משמעותי באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (hIPSC)-נגזר interneurons לטיפול במגוון מחלות המוח. עם זאת, מעטים המחקרים הללו להעריך אם תאים אלה המושתל בוגר של סוגי הצפוי interneurons בוגר, מרכיב קריטי כאשר אחד חושב על גישות translational.
כדי לטפל כיצד הסביבה משפיע על התמיינות interneuron ועם בגרות, אסטרטגיה הומצאה השתלת interneuron ילדותי מבשרי לתוך סביבות המוח החדש על מנת לבחון interneurons המושתל לאמץ תכונות של המארח הסביבה או לשמור על תכונות הסביבה תורם20. השתלות MGE אינם מתאימים להתייחס לשאלה זו, כי MGE מכיל אוכלוסייה מעורבת של interneuron ו- GABAergic הקרנה התאים לפזר ברחבי המוח רבים אזורים21. מבלי לדעת היכן היגרו תאים אלה MGE, אחד יכול לא לגמרי להעריך כמה השתלות אלה מושפעות על ידי הסביבה המוח. בבציר מבשרי interneuron ב timepoints לאחר הלידה המוקדמת, בעיה זו הוא מצויין על ידי קבלת תאים לא בשלה יש להשלים את ההעברה שלהם, במטרתם המוח באזור אבל יש אינטראקציה מינימלית עם הסביבה. על-ידי התמקדות בתכונות ספציפיות של interneurons באים לידי ביטוי באופן שונה בין אזורים שונים במוח, אז ניתן לקבוע כיצד הסביבה מארח משתנה interneuron מאפיינים. הגישה הכללית המתוארות ב פרוטוקול זה צריך להיות החלים על כל חוקר רוצה לבחון כמה צעיר נוירונים מתנהגים כאשר אתגר בסביבה חדשה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים ניסיוני נערכו בהתאם להנחיות מכוני הבריאות הלאומיים, אושרו על ידי NICHD חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC). הפרוטוקול המתואר להלן מנצל Nkx2.1-CreC / +; Ai9+ /- כלבלבים לקצור מבשרי נגזר MGE interneuron, אך ניתן לבצע כל קו העכבר הרצוי כתב פלורסנט. גם זכר וגם נקבה מוקדם כמחנכת עכברים (P0-P2) שימשו ללא הבחנה רקמות התורם ואת המארח.
1. פתרון הכנה
- להכין סוכרוז מלאכותי השדרתי (sACSF) במתכון הבא (יחידת במ מ): NaCl 87, NaHCO 263, 2.5 אשלגן כלורי,2פו ' NaH 1.25 '4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, גלוקוז 10, 75 סוכרוז רווי 95% O 2, 5% CO2 ב- pH = 7.4.
- מילוי גביע ב- ddH טהור 350 מ ל2O מבוסס באמצעי האחסון הרצוי הסופי (500 מ של sACSF צריך להיות מספיק בשביל 1-2 המלטות), להוסיף פס מגנטי מערבבים ומניחים את הספל על הצלחת מערבבים.
- משקל כל המלחים (NaCl, NaHCO3, אשלגן כלורי, NaH2PO4, גלוקוז, סוכרוז), אחד בכל הפעם ולהוסיף המים בהתאם לטבלה שלהלן. ניתן להתאים כמויות בהתאם לנפח הרצוי הסופי.
מגיב משקל מולקולרי ריכוז (מ מ) גרם/500 מ נתרן כלוריד 58.44 87 2.54 סודיום ביקרבונט 84.01 26 1.09 אשלגן כלורי 74.55 2.5 0.09 סודיום פוספט monobasic 119.98 1.25 0.08 גלוקוז 180.16 10 0.9 סוכרוז 342.3 75 12.84 - בועה הפתרון עם 95% או2, 5% CO2 (carboxygen) לפחות 20-30 דקות לפני הוספת את הכמות המתאימה של CaCl2 (0.25 mL פתרון 1 מ' sACSF 500 מ"ל) ו- MgCl2 (3.5 מ"ל של פתרון 1 מ' sACSF 500 מ ל) .
- בדוק את ה-pH באמצעות מד pH הרגיל. אם מוכן כהלכה, הפתרון צריך להיות pH = 7.4.
- להביא את הפתרון הסופי נפח של 500 מ"ל עם ddH טהור2O ב- משורה.
- sACSF יכול להיות מוכן עד 1-2 ימים מראש. לפני השימוש, במקום על הקרח בועה עם carboxygen לפחות 15 דקות לפני תחילת חיתוך ו את הבקבוק של sACSF מבעבעים ברחבי הקרע.
2. ניתוח הכנה
- הכלים הבאים צריך להיות מעוקר/בלוק: לפחות אחד קטן בסדר מספריים חדות, מלקחיים בסדר 2 (סגנון #5), עקומים מלקחיים בסדר, המוח חלוקתה matrice עובש, סכיני גילוח מספר. מרית קטנה כדי להסיר במוח הגולגולת היא אופציונלית.
- להגדיר תחנת העבודה ליד לנתיחה מיקרוסקופים עם צלחות פטרי (9 ס מ, קטרים 4 ס מ), 50 מ ל חרוט צינורות פלסטיק כדי לאסוף את האזורים במוח מבודד ונשא גדול העברה פלסטיק פיפטות, כל מה שמר על קרח. הכן טורפדו 50 מ"ל במספר מלא carboxygenated sACSF על הקרח. אם לנתח את האזור במוח אחד או יותר, הקפד כראוי, באותיות ברורות הצינורות אוסף והן את פיפטות העברה כדי למנוע זיהום.
- יש דלי קרח נוספים עבור קרח הרדמה ולהמליט באמצעות היפותרמיה, שקית לפסולת תקין להיפטר הגוויות.
- היכונו זכוכית מלוטשים אש פסטר סיליקון רקמות trituration. השתמש מבער בונזן כדי לעקר ולעצב את קצה פיפטה. להכין מספר פיפטות עם פתחים שונים משעמם: גדול (~ 600 מיקרומטר), בינוני (~ 300 מיקרומטר) וקטנים (~ 100 מיקרומטר). לבדוק זרימה באמצעות טיפים באמצעות מים כדי להבטיח מהירויות שונות trituration. פיפטה אחד לפחות מכל סוג יש צורך בכל אזור המוח מבודדים, אך יש כמה נוספות עבור כל גודל מומלץ במקרה של סתימת או שבירת טיפים.
3. השתלת הכנה
- השתמש של פולר אלקטרודה כדי להכין זכוכית שקצהו פיין micropipettes. לשבור או מסגרת משופעת קצה כדי להבהיר נקודה בזווית חדה, עם קצה בעל קוטר של ~ 20-40 מיקרומטר. מבחינה ויזואלית לבחון את הטיפים עם מיקרוסקופ כדי לוודא כי אין אבק או זכוכית שיורית חלקיקים הם הפרעה הצמצם.
- באמצעות מזרק מחט בסדר, למלא לגמרי את micropipette כוס שמן מינרלי. הכנס micropipette את המנגנון Nanoject (או התקן אחר microinjection). עבור השלישי Nanoject, להגדיר את התוכנית הבאה: נפח = 60 nL, קצב = 30, מחזורי = 25, עיכוב = 1 s.
- לאבטח את Nanoject כדי manipulator שמצורף ל בסיס מגנטי, ולהתאים את מניפולטור כך Nanoject מכוון ישר למטה, לא מוטה לאורך ציר x או y ציר.
- לצרף כמה שמשות דבק (~ 1-2 ס מ עבור הגורים P0-P2) לחלק העליון של השער של צלחת פטרי יצירת משטח מוגבה כדי להניח את הראש של הגורים על.
- גזור ~ 6-8 ס מ ארוכה פסים של המעבדה להקליט ולעשות חור בצורת יהלום באמצע. הקלטת ישמש כדי לייצב את ראשו של הכלבלב במהלך ההליך, תוך כדי גם מתיחת העור, המאפשר ויזואליזציה קל של ציוני דרך, את האזור.
- הכנת כרית החימום בסמוך לתחנת הזרקה, והפעל להגדרה 'נמוך' לפני התחלת זריקות. לכסות את משטח זה עם מגבות נייר או משטח החתלה.
- אם ביצוע השתלת תנאים מרובים, יש מספריים קטנים מוכן לבצע חיתוך הבוהן/זנב תג כלבלבים המקבל זריקות שונות.
4. הסרה של מוח העכבר P0-P2
- ממש לפני תחילת ההליך, למלא מספר צלחות פטרי עם צוננת, carboxygenated sACSF. גם למלא את צינור אוסף sACSF ~ 25 מ.
- לעטוף גור P0-P2 כמה מצלמות-מיקרוסקופים או הכפפה ובמקום שזה מכוסה מתחת לקרח. להגדיר שעון עצר עבור 5 דקות ולהתחיל אותו. לאחר מכן, להסיר את הכלבלב ולבדוק כי זה אינו מגיב צביטות hindpaw.
- לערוף הכלבלב ולאסוף את הראש בצלחת פטרי מלא sACSF. לחתוך את העור לאורך הקו האמצעי לחשוף את הגולגולת.
- אתר פתיחת הגולגולת-חוט השדרה/hindbrain והוסף קצה אחד של המלקחיים לאורך החלק הגבי של הגולגולת. בעדינות תופס את הגולגולת בקו האמצע, 'קליפה' חתיכות משם רוחבית לחשוף את המוח, נזהר שלא נזק למוח.
- בעת הסרה של החלק הגבי והחלק לרוחב של הגולגולת, השתמש המלקחיים או המרית בעדינות להסיר במוח הגולגולת על ידי חפנה מתחת לפני השטח הגחוני של המוח, מנסה שלא לפגוע בכל תחום. המקום המוח לתוך צלחת פטרי עוד מלא carboxygenated sACSF.
הערה: אנו מציגים שתי אסטרטגיות שונות ניקוד החוצה ההיפוקמפוס, סטריאטום ואת קליפת המוח. האסטרטגיה הראשונה (שלבים 5.1-5.10) הוא שימושי עבור כל קו בעכבר ואילו האסטרטגיה השנייה (שלבים 6.1-6.7) צריך עכבר כתב פלורסנט נקיה להפריד את סטריאטום את globus pallidus ומבנים אחרים של המוח. אם סטריאטום אינו רצוי, אז להתעלם החלקים סטריאטום ספציפיים של שתי טכניקות
איור 1 : מפרטים טכניים ותמונות לניתוח מוח, טכניקה #1
דיסקציה בטכניקה המתוארת צעדים 5.1-5.10. אם הרקמה striatal רצוי, המקום P1 המוח בצד הגחוני של המוח מטריצות. למקם את סכיני matrice חריצי דרך המוח הקדמי כדי להשיג חלקים הילתית דרך סטריאטום. הסר striatal חתיכות של שתי ההמיספרות, לחזור עבור כל המקטעים המכיל סטריאטום כי הם והשתרשה עמוק בלבה ההיפוקמפוס. אם הרקמה striatal אינו רצוי, פשוט hemisect המוח, המקום הצד המדיאלי ההמיספרות בצלחת, להסיר את המבנים במוח הגחוני / המדיאלי (תלמוס, גרעיני הבסיס, וכו ') כדי לחשוף את ההיפוקמפוס. השתמש פינצטה חופן. היפוקמפוס, ואז להתהפך בחצי הכדור ולהשתמש פינצטה שווייץ נתח של רקמות קורטיקלית. הקווים השחורים אנכי דרך ההמיספרות סכמטית שבו החתכים יהיה להסיר את הסעיפים striatal. סרגל קנה מידה = 500μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
5. הקציר סטריאטום, ההיפוקמפוס, קליפה, טכניקה #1
- במקום כל המוח על חלוקתה matrice עובש, בצד הגחוני למעלה. מקום 1 גילוח דרך החלק הקדמי ביותר של המוח (באמצעות מערכת הריח הקדמי).
- להוסיף עוד גילוח רק האחורי הראשונה כדי ליצור פרוסה 0.5 מ מ, ולמקם גילוח נוסף אחורי לאישה הזאת.
- להעביר את פרוסות אלה צלחת פטרי עם carboxygenated sACSF ומניחים את שאר המוח על צלחת נפרדת עם sACSF. להעביר את הפרוסות striatal טווח ויבתר להמחיש סטריאטום. פרוסות אלה צריך להכיל חלקים גדולים סטריאטום הקדמי וחסרי ההיפוקמפוס. השתמש של פלורסנט לנתח היקף עם Nkx2.1-Cre+ /-; Ai9פרוסות+ /- כדי להבדיל את tdTomato striatal חלש אות מן האות tdTomato חזקה של globus pallidus.
- עם או בלי קרינה פלואורסצנטית את סטריאטום בין שתי ההמיספרות בכל המקטעים של העברת striatal נתחים צניעותו כראוי שכותרתו 50 מ עם sACSF החלקה, לאחסן בקירור.
- Hemisect המוח לאורך הקו האמצעי באמצעות מלקחיים או סכין גילוח, ולהניח הכדור כך השטח המדיאלי פונה.
- להסיר את רקמת המוח הגחון (תלמוס, גרעיני הבסיס, וכו ') על ידי צובט את הרקמה הזאת עם מלקחיים. מתי להשלים, ההיפוקמפוס (מבנה בצורת נקניק המתפרסות על-פני הציר anteroposterior לאורך קליפת המוח הגבי), שניתן יהיה צד חדרית של קליפת המוח.
- כדי להסיר את ההיפוקמפוס, להוסיף את קצות המלקחיים לפני ההיפוקמפוס הקדמי ולהפריד בעדינות ההיפוקמפוס מאזור הקליפה על-ידי הזזת המלקחיים posteriorly, התכווצות לאורך הגבול בהיפוקמפוס-קורטיקליים. להעביר את ההיפוקמפוס מבודד כראוי שכותרתו 50 מ ל צינור עם sACSF, לאחסן בקירור.
- כדי לנתח את קליפת המוח, במקום הצד המדיאלי של קליפת hemisected למטה. לאחר מכן השתמש המלקחיים כדי לצבוט ביותר מהראש, חלקים הגחון, anterior ואת אחורי של קליפת להשאיר חתיכה מרובעת של המדיאלי קליפה המגע, ~ 2 מ מ x 2 מ מ. הפוך קליפת אז הצד המדיאלי הוא למעלה ונקי של כל רקמות קורטיקלית עודף (תלמוס גרעיני הבסיס, וכו '.) על פני השטח המדיאלי במידת הצורך. גוש בקליפת המוח להעביר צינור כראוי שכותרתו 50 מ עם sACSF, לאחסן בקירור.
- חזור על התהליך עם ההמיספרה השנייה כדי לאסוף גם את hippocampi וגם את קליפת אזורים.
- חזור על הליך זה עבור כל הגורים, מקפיד להחליף את sACSF, צלחות פטרי בין הגורים כדי להבטיח sACSF יישאר קר ורענן.
איור 2 : מפרטים טכניים ותמונות לניתוח מוח, טכניקה #2
דיסקציה בטכניקה המתוארת צעדים 6.1-6.7. להצמיד המוח צדדי הגבי ויבתר מנה למעלה. לאחר קילוף קליפת קדימה, ההיפוקמפוס סטריאטום גלויים, ניתן להסיר, ולאחר מכן ניתן להסיר מקטע של קליפת כמתואר בשיטה הקודמת. בהתאם העכבר הטרנסגניים קו, ניתן לנקות סטריאטום כדי להסיר globus pallidus ורקמות אחרות. ב- Nkx2.1Cre; Ai9 קו העכבר, globus pallidus יש צפיפות גבוהה יותר באופן משמעותי של עגבניות + תאים בהשוואה סטריאטום. סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
6. הקציר סטריאטום, ההיפוקמפוס, קליפה, טכניקה #2
- מניחים בצד הגחוני במוח למטה מצופים sylgard פטרי המכילות sACSF ותגיד לי במדויק דרך המוח הקטן, בקליפה או נורות הריח.
- החל מבאונה אחת, להשתמש מלקחיים מעוקל להפריד בעדינות את קליפת המוח האחורי של ההיפוקמפוס כבסיס ורקמות אחרות. בעדינות שכבה קליפת קלופים שטוח על צלחת פטרי. חזור על האונה אחרים. Hippocampi סטריאטום צריך להיות בבירור במוח חשוף.
- להשתמש מלקחיים כדי לצבוט אחד ההיפוקמפוס בקו האמצע ולהתקלף ההיפוקמפוס רוחבית כדי להסיר. למקם את האוסף המבחנה בקרח וחזור עם אחרים ההיפוקמפוס.
- עבור סטריאטום, לגרד בעדינות מסביב לקצוות של סטריאטום לשחרר אותו מן הרקמה שמסביב. לאחר מכן להסיר את סטריאטום על-ידי צובט את זה מ מתחת, להוסיף אוסף שפופרת על קרח. חזור על סטריאטום אחרים.
- ניתן לקצור חלקים קורטיקליים כפי שמתואר בשלב 5.8.
- אם משתמש קו העכבר כתב מהונדס (למשל, Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, וכו '), להעביר סטריאטום צלחת פטרי עם sACSF ולהציג תחת פלורסנט לנתח היקף. להשתמש מלקחיים כדי להסיר כל רקמות ללא-striatal סטריאטום (ב- Nkx2.1-Cre; Ai9 עכברים, להסיר כל רקמות "בהיר", כמו globus pallidus יש הרבה צפיפות גבוהה יותר MGE-נגזרים, tdTomato + תא בהשוואה סטריאטום). חזור על כל סטריאטום.
- חזור על הליך זה עבור כל הגורים, מקפיד להחליף את sACSF, צלחות פטרי בין הגורים כדי להבטיח sACSF יישאר קר ורענן.
7. יצירת תא בודד Dissociations
- עם השלמת הקרע, הכן 1 מ"ג/מ"ל Pronase פתרון על ידי במשקל של 10 מ ג Pronase, המסת ב 10 מ"ל carboxygenated sACSF.
- העברת הרקמות מן הבקבוקונים אוסף 50 מ ל מ ל סביב צינורות התחתון המכיל 2 מ"ל של הפתרון Pronase-sACSF. דגירה הרקמה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, רועד/מצליף ברכבת התחתית 3 - 4 פעמים עם האצבע שלך במהלך הדגירה לערבב את הדגימות.
- במהלך הזה דגירה, להכין שיחזור פתרון: 1% FBS (100 μL) + DNAse (1 μL של 1:10,000 במניה DNAse) ב- 10 מ"ל carboxygenated sACSF.
- לאחר כשעתיים 20, בזהירות להסיר את הפתרון pronase כדי לא להפריע הרקמה בתחתית, ולהחליף אותו עם 1-2 מ"ל של הפתרון הכינון (הנפח הכולל הוא תלוי מתחילה כמות הרקמה).
- מכנית מביצועם הרקמה על ידי triturating הרקמה עם פיפטות פסטר בעבר מוכן מלוטשים אש. החל מפיפטה (~ 600 מיקרומטר) גדולה, האחות, לגרש את הפתרון רקמות לפחות 10 פעמים כדי לשבור את הרקמה. לא להציג בועות לתוך הפתרון. חזור על תהליך זה עבור המדיום נשא פיפטה ונשא הקטן פיפטה. הפתרון צריך להיות מעונן, אין פיסת הרקמה ברור צריך להיות גלוי הצינורות אוסף.
- Pipet הפתרון lysate תא דרך מסנן 50 מיקרומטר לתוך צינורות חרוט מ ל להסיר תא כלשהו קיבוץ. . המשך עם הפתרונות תא בודד לזרום cytometry (או פוטנציאל ישירות לתא סופר אם אין מיון נדרש).
8. הכנת את התא מטוהר FACS פתרונות עבור השתלת
- עם קבלת הפתרונות תא מ cytometer הזרימה, להעביר את הפתרון אחד (או יותר) 1.5 mL חרוט צינורות, לסובב את התאים ב 500 גרם במשך 5 דקות בבית 4oC. לאחר צנטריפוגה, להסיר מדיה כל כך הזה ~ 20-40 µL נשארים בצינור. לשקם תאים זו נותרת מדיה (וגם לשלב פתרון אם צינורות מרובים היו נחוצים).
- על חתיכה קטנה של מצלמות-מיקרוסקופים, מערבבים יחד 2 µL של פתרון תא + 8 µL sACSF + 10 µL של כתם trypan blue. Pipet 10 µL אל hemocytometer עם מכסה שקופיות.
- לספור את מספר תאים חיים בכל אחת 4 x 4 מחותם בפינות hemocytometer באמצעות מונה טלי יד מעבדה סטנדרטיים (תאים מתים יהיה כחול מן לצבוע), ולחשב ממוצע אלה הארבעה. להכפיל את המספר הזה-100 כדי לקבוע את מספר התאים לכל µL.
- במידת הצורך, התאם האחסון כך התאים נמצאים בריכוז של 10,000-30,000 תאים/µL בתמיסה הכינון. הריכוז הסופי תלוי בסכום הכולל של תאים, מספר השתלות הרצוי. לשמור על הקרח על השתלת תאים
9. השתלת לתוך הגורים WT P0-2
- לעטוף גור WT כמה מצלמות-מיקרוסקופים או הכפפה ובמקום שזה מכוסה מתחת לקרח. הגדרת שעון עצר עבור 5 דקות ולהתחיל אותו. לאחר מכן, להסיר את הכלבלב ולבדוק כי זה אינו מגיב צביטות hindpaw.
- בעוד הכלבלב הוא על קרח, לערבב הפתרון התא על ידי pipetting זה מספר פעמים כדי להבטיח התליה תא מעורבב היטב לפני טעינה (לערבב את התאים לפני טעינת את micropipette עבור כל זריקה). לאחר מכן לרוקן את micropipette של שמן מינרלי, למלא אותו לחלוטין התליה תא.
- מניחים את הגור anesthetized על הפטרי כשראשו מונח על הטיט דבק כך את החלק העליון של הראש הוא שטוחה יחסית. מכניסים את הקלטת עם החור יהלום על פני ראש הכלבלב, משיכתו מתוח על מנת להבטיח את העור נמתח, הראש הוא המשרד העכבר הוא טוב נוח ונושם. למדא צריך להיות גלוי דרך החור יהלום.
איור 3 : מפרטים טכניים, תמונות עבור השתלת
(א) תמונות של הזרקת ההתקנה. שימו לב למבדה הזה נראה בבירור דרך הגולגולת של הכלבלב, אמור לשמש מכוונת את micropipette. סרגל קנה מידה = 1 אינץ '. (B) מפרטים טכניים המתארים את הליך הזרקת למקד את ההיפוקמפוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- להעביר הגורים מאובטחת תחת Nanoject ולהוריד את micropipette כך קצה micropipette היא על ישירות מעל למדא. להקליט את הקואורדינטות x-y ב- manipulator.
- להתאים את ידיות מניפולטור כדי להעביר micropipette את הציון הרצוי לאורך של mediolateral והן לאורך ציר anteroposterior של הראש: → S1 Cortex הקדמי 1.0 מ מ ו- 1.0 מ מ לרוחב, ההיפוקמפוס ← 0.75-1.0 מ מ קדמי ו- 1.0-1.2 מ מ לרוחב, סטריאטום ← 2.0-2.2 מ"מ הקדמי, 1.5 מ מ לרוחב. הציון ניתן לכוונן מעט כדי לפצות על גיל הגורים (למשל, P0 לעומת P2) או את המתח של עכברים (למשל, CD1 עכברים גדולים יותר וגם C57/B6-P2).
- הנמך את micropipette עד להיווצרות של השקערורית קטנים על העור. לאחר מכן סובב את ציר z מניפולטור בחוזקה אך בעדינות כדי להסיע את micropipette דרך העור כדי להזין את המוח. כאשר micropipette מזין את המוח, הלחץ על הגולגולת ישוחררו, השקערורית ייעלמו.
- . משכי את micropipette מעט עד הקצה מוקף גביע של העור, בצורת אוהל. לקרוא את הקואורדינטות לאורך הצירים z: זו תהיה נקודת ציר z אפס.
- הנמך את micropipette לעומק הרצוי: קליפת ← 0.75-1.0 מ"מ, ההיפוקמפוס ← 1.2-1.5 מ. מ., סטריאטום ← 2.0-2.5 מ מ. עומק יכול להיות מותאם מעט כדי לפצות על גיל או זן של הכלבלב.
- להזריק התליה תא באמצעות התוכנית Nanoject השלישי שתוארו לעיל. לאחר ההזרקה התוכנית הושלמה, להמתין 15-20 s לפני לאט פותחים את micropipette כדי למזער את פתרון ואז יצאו ההזרקה.
- אם מבצע זריקות דו צדדיים, מחדש מאפס את micropipette מעל למדא והזז הקואורדינטות המתאים בחצי הכדור השני. לחילופין, אפשר להכין שתי זריקות לתוך קליפת הכדור אותו על-ידי הזזת את micropipette 1 מ מ הקדמי של הזריקה הראשונה.
- לאחר השתלת תושלם, הוצא את הקלטת ולהעביר את הגור על גבי כרית החימום. במידת הצורך, לתייג את הגור על ידי גזירת זנב או הבוהן. לאחר הכלבלב יש השיגו צבע אדום, נעה, מקם אותו חזרה לכלוב עם האמא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מדגים כיצד הקציר אזורים ספציפיים במוח של המוח כמחנכת מוקדם (איור 1-2) לאסוף dissociations תא בודד של סימנים מקדימים interneuron, השתלת תאים אלה לתוך אזורים שונים במוח,-תמימה WT לאחר הלידה הגורים (איור 3). לניתוח posthoc, המוח שקיבלו שתלי קודמן interneuron נקטפו בין P30-35 לאפיין תא מורפולוגיה, סמני עצבית ומאפיינים אלקטרופיזיולוגיות. סוגים אלה של מבחני מתבצעות לעתים קרובות בין P21-P30 בעכברים נורמלי, אך מאז ההבשלה של התאים המושתלים עלול להתעכב מעט בשל ההליך דיסקציה/דיסוציאציה, ממתינים 5-10 ימים נוספים מומלץ כדי לפצות על כך התבגרות מאוחרת. סוג הניתוח שיבוצע יכתיב את האסטרטגיה הנכונה כדי לקצור את המוח. ראוי לציין, אנחנו לא להתבונן מוות תאי מועדף של תת-קבוצות interneuron ספציפי זה יכולת הטיה בעד או נגד מסוימת יחוברו20.
ניתוח immunohistochemical, עכברים היו perfused עם 4% paraformaldehyde, המוח הוסרו. פרוסות vibratome μm 50 היו מוכן דרך האזור במוח יישוב המאוחסן בפתרון חומר נגד קיפאון ו/או מעובד עבור immunostaining כמו שתואר לעיל20. קצת שכל לא הכילה כל עגבניה + תאים, אשר יכול להיות בגלל פסולים מיקוד (למשל, הזרקת עמוק מדי לתוך הנוזלים), תאים אבודים או שעברו אפופטוזה במהלך הליך הרכבה, או דחייה של התאים המושתלים על ידי המארח. בהתבסס על ספירת הסופי, ההערכה היא שלא רק 2-5% של תאים המושתל לשרוד20, אשר עולה בקנה אחד עם אחרים השתלת ההליכים22,23.
באופן לא מפתיע, היתה השתנות משמעותית במספר הכולל של עגבניות + בתאים השתלות מוצלחות, ועד עשרות אלפי עגבניות + תאים אחדים (איור 4A). תאי המושתל נרשמו נקודתית באזורים הנכונים, עם רבים הצגת interneuron מורפולוגיות וסמנים מאופיין היטב interneuron עצבית (איור 4B). המספרים דומים של הישרדות תא ופרופילים ההבשלה נצפו אפילו כאשר התאים היו הושתל סביבות חדש, השתלות הטרוטופיות (איור 4C).
בנוסף immunohistochemical ניתוח, ניתוח אלקטרופיזיולוגיות על תאי המושתל בוצעה כדי לאשר כי הם השתלבו לתוך המוח המעגלים ולהציג מאפיינים פנימיים, ירי הצפוי. המוח היו שנקטפו עכברים P30-35, פרוסות מוכן להקלטות פיזיולוגיים כמו בעבר תיאר20. Interneurons המושתל הציג תכונות פיזיולוגיות כמו מבוגר, ירי נפרדים דפוסי יכול להיות מאופיין זה היו נציגים של interneuron מאופיין היטב יחוברו (איור 5A), מציע את זה הושתל interneurons הצליחו בוגר כראוי סביבת המחשב המארח. כדי לוודא כי התאים המושתלים שולבו בתוך הרשת העצבית, sEPSCs היו גם מוקלט (איור 5B). בנוסף, קבוצת משנה של השתלות בוצעו עם interneurons לבטא ChR2 ואחריו הקלטה מתאי כפירמידה מקומי ליד interneurons מושתל. נתונים אלה הראו כי זרמים GABAergic postsynaptic ולידיעה על ידי אור כחול (איור 5C-D).
איור 4 : Interneuron המושתל מבשרי לאכלס אזורים במוח מארח מקטעים נציג של עכברים P30 WT היו מושתלים עם עגבניות + interneuron סימנים מקדימים ב P1. (א) ב- homotopic cortex-כדי-קליפת השתלות, תאי המושתל לאכלס את כל השכבות קורטיקלית ולהציג מורפולוגיות המחקים interneurons אנדוגני. התמונות הנבחרות לסמן את ההשתנות של מספרי הטלפון הנייד של השתלות שונות, עם התמונה השמאלית בעל מספר גדול בהרבה של עגבניות + תאים לכל סעיף בהשוואה ההשתלה בצד ימין. הגדלה נמוכה (B) (משמאל) קטעים נציג (מימין) בהגדלה מ homotopic ההיפוקמפוס-כדי-היפוקמפוס שתלים. שימו לב כי הרוב המכריע של עגבניות + בתאים oriens הרובד (אז) מביעים SST (תאים O-LM סביר) ואילו רבים עגבניות + התאים הרובד pyramidale (SP) אקספרס PV (סל סביר תאים), הדומה interneurons בהיפוקמפוס אנדוגני. (ג) דוגמה השתלת הטרוטופיות (קליפת המוח-כדי-סטריאטום) עם עגבניות + נוכח סטריאטום. גודל ברים = μm 200 א' בלוח mag נמוך ב- B, μm 50 ג' ו מתח גבוה mag ב' אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : Interneurons המושתל בוגרים electrophysiologically ולשלב בתוך הרשת העצבית מארח
(א) דוגמאות מייצגות של התדרים ירי הגבוהה ביותר נרשמה מ interneurons המושתל. משמאל, interneuron מהר עולה של הירך-כדי-אקס שתל, מוזרק צעדים הנוכחי:-100 הרשות והרשות 520; נכון, במהירות שאינה עולה interneuron של השתלה אקס-אל-אקס, מוזרק צעדים הנוכחי:-100 pA ו- 360 הפלסטינית. (B) דוגמה sEPSCs הקליטה ב interneuron מאוחר עולה מהשתלת ירך-כדי-היפ. (ג) תמונה ייצוגית הצגת Nkx2.1-Cre; Ai32 השתלת תאים (YFP) מן אקס-אל-אקס עם מלא biocytin (אדום) כפירמידה תא. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ד) דוגמה הזרמים postsynaptic GABAergic עורר על ידי להבזקי האור הכחול הקליט בתאים כפירמידה, הקליט עם [145 מ מ] Cl-. שחור, ממוצע עקבות; באדום, התגובה הממוצע הקליט בנוכחות Gabazine. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היבט קריטי אחד של פרוטוקול זה הוא למקסם את השרידות של התאים. להבטיח כי רקמות ותאים נמצאים תמיד קר כקרח carboxygenated sACSF יש צורך לקדם את הישרדות cell. זה דורש ניתוח יעיל ואסטרטגיה דיסוציאציה כדי לצמצם את משך הזמן התאים מבלים פתרון שונים והן מחוצה הסביבה המוח. תלוי במספר אזורים במוח להיות גזור, מושתלים, זה יכול להיות מועיל שיש לו שותף סיוע בשלבי ניתוח ו/או השתלת כדי להקטין את משך הניסוי. כדי להבטיח את בריאות והישרדות של הכלבלב, חשוב גם כדי למזער את הזמן הרדמה קרח (< 4 דקות) ולשמור הכלבלב מחוממת עם אור במהלך ההליך השתלת.
שם יכול להיות משמעותי השתנות במוחם המושתלים, חלקם אינו יכול להכיל תאים המושתל בעוד אחרים המוח תכיל אלפי. שילוב של מספר המלטות P0-P2 עבור ניתוח יכול להגדיל את מספר התאים נמסקו עבור השתלת עור, המאפשר גם להגדיל את צפיפות התאים השתלת ו/או להגדיל את מספר הגורים המושתל, אשר שניהם תשפר את הסבירות של השתלות מוצלחות. כדי למקד את האזור במוח תקין, זה קריטי כי הראש של הכלבלב מיוצב, ואינו זז בעת הורדת את micropipette לתוך המוח. כל הסטה של הראש או כיפוף של הפיר micropipette יכול לגרום זריקות mistargeting ולא מדויקות (כגון אובדן תאים לתוך החדר לרוחב). כמו כן, ביצוע באתרי הזרקה מרובות לכל גור (באופן חד צדדי או דו צדדיים) יכול לשפר את אחוזי ההצלחה למקרה אחד ההזרקה הוא mistargeted. בעתיד, זה יהיה אופטימלי לפתח אסטרטגיה stereotaxic יעיל יותר כדי לייצב את הכלבלב ולספק יותר זריקות מדויקים ועקביים.
מסגרת הזמן Th P0-P2 נבחרה מטעמים מדעיים וטכניים. בגיל הזה, רוב interneuron מבשרי היגרו לאתרים מסוף שלהם, אבל יש אינטראקציות סביבתית מינימלית. ייתכן מסגרת זמן זו לא מחזיקה נכון עבור דופאמינרגיים סוגים אחרים של אזורים במוח, אז אחד ייתכן שתרצה להתאים את timepoints האלה למטרות ספציפיות שלהם. לדוגמה, זה יהיה מעניין להשוות את הפוטנציאל הטיפולי של אלה מבשרי interneuron שנקטפו P0-P2 עם תאים שנקטפו MGE: גיל אחד ייתכן יותר עם הטבות ו/או פחות תופעות לוואי לא רצויות יותר מהשני. בנוסף, זה יכול להיות מעניין לבצע השתלות heterochronic (למשל, איסוף תאים בחלק P0-P2, משתילים למוחות P7-10, או להפך) כדי לזהות שינויים טמפורלית איך הסביבה יכול להשפיע על גורל ועם בגרות. היתרון של ביצוע זריקות ב2-P0 הוא כי הגולגולת הוא דק יחסית, יכול להיות חדרו בקלות עם micropipette חד. כל זריקות מעל P5 ידרוש הסרת או דליל הגולגולת.
ניתוח הנתונים המתוארים פרוטוקול זה מוגבלת לתכונות ספציפיות של תת interneuron באים לידי ביטוי באופן שונה בין אזורים במוח. בעתיד, אחד יכול לנצל את הכוח של תא בודד רצף לאפיין את transcriptome המלא של תאי המושתל. גישה זו לא משוחד יוכל לזהות גנים ספציפיים (או מפלים איתות גדול יותר) זה חזק מועשר או מדולדל התאים המושתלים לעומת שולט, אשר יספק תובנות המועמד רמזים סביבתיים שישפיעו על הגורל נחישות או התבגרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (K99MH104595), את תוכנית המחקר מגזר NICHD כדי T.J.P. אנו מודים Fishell גורד, במעבדה של מי גישה זו הוקמה במקור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
