Summary
Сложной молодых нейронов в новых регионах мозга может выявить важные выводы как окружающей среды лепит нейрональных судьба и созревания. Этот протокол описывает процедуру урожай межнейронного прекурсоров из конкретных мозга и пересадить их либо homotopically или heterotopically в мозг послеродовой щенков.
Abstract
Нейрональных судьба решимость и созревания требует сложной взаимосвязи генетических программ и экологические сигналы. Однако распутывание роли внутренней против внешней механизмов, которые регулируют этот процесс дифференциации является загадкой для всех развития neurobiologists. Эта проблема усиливается для интернейронов ГАМК, невероятно гетерогенных клеток населения, которая рождается из переходных зародышевых структур и проходят фазу затяжного мигрирующих разойтись во всем конечного мозга. Чтобы исследовать как различные мозга среды влияют на межнейронного судьбы и созревания, мы разработали протокол для уборки дневно обозначенные незрелых межнейронного прекурсоров из регионов конкретных мозга новорожденных мышей (P0-P2). В этом возрасте межнейронного миграции почти завершена и эти клетки живут в их окончательное отдыхая средах с относительно мало синаптических интеграции. После сбора одноклеточного решений через проточной цитометрии эти межнейронного прекурсоров пересаживают в послеродовой щенков wildtype P0-P2. Выполняя обе гомотопных (например, кора коры) или heterotopic (например, коры головного мозга и гиппокампе) трансплантаций, можно оценить как сложной незрелых интернейронов в новых средах мозга влияет на их судьбу, созревания и цепи интеграции. Мозги может быть собран в взрослых мышей и assayed с широкий спектр posthoc анализа на привитых клетки, включая иммуногистохимии, электрофизиологических и transcriptional профилирования. Этот общий подход обеспечивает следователей с стратегию анализа как собственный мозг средах могут влиять многочисленные аспекты развития нейрон и определить если особенностей нейронов в первую очередь вызвано жестко генетических программ или Экологические сигналы.
Introduction
Надлежащего кортикальной функции требует установления баланса между возбуждающим проекции нейронов и тормозящий ГАМК интернейронов, чрезвычайно разнородных населения с собственный морфологии, электрофизиологические свойства, подключения и нейрохимические маркеры. Аномальное развитие и функции интернейронов (и конкретные межнейронного подгрупп) связан с pathobiology психических расстройств, таких как шизофрения, аутизм и эпилепсии1,2,3. Кроме того многих генов, вовлеченных в эти заболевания мозга сильно обогащенный в молодых интернейронов4. Таким образом более глубокого понимания механизмов, которые регулируют межнейронного судьба решимость и созревания необходима для понимания нормального развития и потенциальных этиологии многочисленных заболеваний головного мозга.
Переднего интернейронов рождаются главным образом из двух переходных зародышевых структур, медиальной и хвостовой Ганглиозный Высокопреосвященства (MGE и КГЭ, соответственно). Эти постмитотических клеток (межнейронного прекурсоров) затем проходят фазу затяжного тангенциальная миграции разойтись во всем конечного мозга, где они интегрировать широкий спектр схем. МГЕ производные интернейронов состоят из трех основном non перекроя, neurochemically определенных подгрупп: быстро пики интернейронов Парвальбумин (PV+), не быстро, пики интернейронов соматостатина (SST+) и поздно пики нейрональных азотная Оксид интернейронов синтазы (nNOS+), которые составляют гиппокампа клетки neurogliaform и плюща. Многочисленные лаборатории выявили несколько механизмов в рамках MGE, которые регулируют первоначальный судьба решения в PV+ или SST + интернейронов, включая пространственные градиенты morphogens, Дата рождения межнейронного прекурсоров и режим нейрогенный отдела 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. было предложено, что интернейронов первоначально дифференцироваться в «кардинал классы» и затем, постепенно перерастет «окончательного классы», как они взаимодействуют с их окружающей среды11. Последние данные свидетельствуют, что некоторые пожилые межнейронного подтипы может быть генетически hardwired как эти клетки становятся Постмитотические в ганглиозных Высокопреосвященства, указав, что ранние определенных встроенных генетических программ могут играть более значительную роль, чем ранее оценены12,13. Однако ключевой вопрос как встроенные генетической программы взаимодействуют с окружающей среды подсказки для привода дифференцировку в собственный межнейронного подтипы остается значительной степени неизученными.
Многочисленные исследования пересаживали эмбриональных клеток МГЕ непосредственно в различных областях мозга, с результатами консенсус, которые привиты клетки зрелых и освободить ГАМК обычно подавлять местные эндогенного схема14,15, 16,,1718,19. Эти перспективные замечания вызвали значительный интерес к использованию человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hIPSC)-производных интернейронов для лечения различных заболеваний головного мозга. Однако очень немногие из этих исследований оценить, если эти привитые клетки Зрелые в ожидаемые типы зрелых интернейронов, критический компонент, когда один думает о переводческие подходы.
Чтобы решить, как окружающая среда влияет на межнейронного дифференцировки и созревания, стратегия была разработана для пересадки незрелых межнейронного прекурсоров в новых условиях мозга для того чтобы рассмотреть ли привитые интернейронов принять функций хоста окружающей среды или сохранить функции от доноров окружающей среды20. МГЕ трансплантаты не подходят решать этот вопрос, потому что МГЕ содержит смешанное население межнейронного и ГАМК проекции клеток, которые расходятся в многочисленных регионах мозга21. Не зная, где эти клетки МГЕ бы мигрировали, один не может оценить полностью как эти трансплантаций среда влияет на мозг. При уборке межнейронного прекурсоров в раннем послеродовом timepoints, эта проблема это обойти путем получения незрелых клеток, которые завершили их миграции и достиг своей цели мозга региона, но имеют минимальное взаимодействие с окружающей средой. Сосредоточив внимание на специфические особенности интернейронов, которые выражаются дифференциально между регионами собственный мозг, затем можно определить, как хост-среды изменения межнейронного свойств. Общий подход, изложенный в настоящем протоколе должны быть применимы к любой следователь что хочет изучить как молодые нейроны ведут себя, когда оспаривается в новой среде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами национальных институтов здоровья и были одобрены NICHD животное уход и использование Комитета (ACUC). Описанные ниже протокол использует Nkx2.1-CreC / +; Ai9+ / щенков урожай МГЕ производные межнейронного прекурсоров, но может быть выполнена на любой желаемой флуоресцентные репортер мыши линии. Послеродовой мышей мужского и женского начала (P0-P2) были использованы огульн для доноров и принимающих ткани.
1. решение подготовка
- Подготовить сахарозы искусственных спинномозговой жидкости (sACSF) согласно следующим рецептом (единица в мм): 87 NaCl, 26 NaHCO3, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 глюкозы, 75 сахарозы, насыщенных с 95% O 2, 5% CO2 при pH = 7,4.
- Заполнить стакан с 350 мл чистого ddH2O на основе окончательного желаемого объема (500 мл sACSF должно быть достаточно для 1-2 помета), добавить панель магнитные перемешать и стакан на пластину перемешать.
- Вес все соли (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4, глюкоза, сахароза), один в то время и добавить в воду согласно следующей таблице. Суммы может быть скорректирована в зависимости от окончательного нужного тома.
Реагент Молекулярная масса Концентрация (мм) Грамм/500 мл Натрия хлорид 58,44 87 2.54 Гидрокарбонат натрия 84.01 26 1.09 Хлорид калия 74.55 2.5 0,09 Монокальций фосфат натрия 119.98 1.25 0,08 Глюкоза 180.16 10 0.9 Сахароза 342.3 75 12.84 - Пузырь раствор с 95% O2, 5% CO2 (carboxygen) для по крайней мере 20-30 минут перед добавлением соответствующее количество CaCl2 (0,25 мл с 1 М раствора для sACSF 500 мл) и MgCl2 (3,5 мл с 1 М раствора для sACSF 500 мл) .
- Проверьте с помощью стандартного pH-метр рН. Если подготовлен правильно, решение должно иметь рН = 7,4.
- Принести решение окончательный объем 500 мл с чистой ddH2O в мерный цилиндр.
- sACSF может быть подготовлен до 1-2 дня вперед. Перед использованием место на льду и пузырь с carboxygen по крайней мере 15 минут до начала рассечение и держите бутылку sACSF пузырьков всей рассечение.
2. рассечение подготовка
- Следующие инструменты следует стерилизовать автоклавного твердения: по крайней мере один небольшой штраф острыми ножницами, 2 штрафа щипцы (стиль #5), изогнутые тонкой щипцы, мозг, секционирование матрица плесени и несколько лезвий. Маленький шпатель для удаления мозг от черепа является необязательным.
- Настройка рабочей станции вблизи рассечение Микроскопы с Петри (9 см и диаметром 4 см), 50 мл конические пластиковые трубы для сбора изолированных мозга регионов и большой родила пластиковые передачи пипетки, все хранится на льду. Подготовьте несколько 50 мл трубки с carboxygenated sACSF на льду. Если разбор более чем одной области мозга, убедитесь, что правильно и четко обозначить трубки для сбора и передачи пипетки, чтобы избежать загрязнения.
- Есть дополнительные ведро льда для льда анестезии щенков через гипотермии и надлежащего опасных отходов мешок, чтобы распоряжаться туши.
- Огонь полировка стекла, которую пипетки Пастера подготовиться Тритурация ткани. Горелка Бунзена используйте для стерилизации и форма кончика пипетки. Подготовьте несколько пипеток с различными диаметр отверстия: большой (~ 600 мкм), средние (~ 300 мкм) и маленькие (~ 100 мкм). Проверить поток через советы, использование воды для обеспечения различных Тритурация скорости. По крайней мере один из пипетки каждого вида необходима для каждого региона изолированных мозга, но имеющие несколько дополнительных для каждого размера рекомендуется в случае закупорки или разрыва советы.
3. трансплантация подготовка
- Используйте съемник электрода для подготовки острым концом стекла micropipettes. Перерыв или скос кончик сделать резкое угловой точки, с наконечником диаметром ~ 20-40 мкм. осмотрите кончики с микроскопом, чтобы убедиться, что нет пыли или остаточные стекла частиц препятствует диафрагмы.
- С помощью тонкой иглой шприца, полностью заполните микропипеткой стекла с минеральным маслом. Вставьте микропипеткой аппаратом Nanoject (или другое устройство микроинъекции). Для Nanoject III, настроить следующую программу: объем = 60 nL, ставка = 30, циклы = 25, задержка = 1 s.
- Безопасный Nanoject манипулятора, который прилагается к магнитным основанием и настроить манипулятор так, что Nanoject указывая прямо вниз, не наклонена вдоль оси x или y оси.
- Прикрепить некоторые клеевой шпаклевки (~ 1-2 см для щенков P0-P2) в верхней части обложки чашку Петри, создавая повышенных поверхности, чтобы отдохнуть голову щенка на.
- Вырезать ~ 6-8 см длиной полосы лаборатории ленты и сделать ромбовидной отверстие в середине. Лента будет использоваться для стабилизации головы щенка во время процедуры, а также растяжения кожи и позволяет легко визуализация архитектурных памятников и целевого региона.
- Приготовить грелку рядом со станцией инъекции и включите параметр «Лоу» перед началом инъекций. Обложка pad с некоторые бумажные полотенца или пеленки колодки.
- Если выполнение нескольких условий трансплантации, маленькие ножницы, готовы выполнять отсечения ног/хвост тег щенков принимающих различные инъекции.
4. Удаление мозга мыши P0-P2
- Прямо перед началом процедуры, заполните несколько чашек Петри с охлажденной, carboxygenated sACSF. Также заполните коллекцию трубки с sACSF ~ 25 мл.
- Оберните P0-P2 щенка в некоторых парафина или перчатку и место, где она хорошо покрыты под льдом. Установите таймер на 5 минут и запустите его. После этого времени удалите щенком и проверьте, что он не реагировать щипать из hindpaw.
- Обезглавить щенком и собирать в голову в чашку Петри, заполнены с sACSF. Вырежьте кожу вдоль средней линии подвергать черепа.
- Найдите отверстие в черепе на задний мозг/спинного и вставьте один конец щипцы вдоль наспинная часть черепа. Аккуратно возьмите череп на срединной и «очистить» прочь части боков подвергать мозга, стараясь не повредить мозг.
- После удаления спинной и боковые части черепа Используйте щипцы или шпателем аккуратно удалить мозга от черепа, черпая под вентральной поверхности мозга, стараясь не повредить любой области. Поместите мозга в другой чашке Петри заполнены с carboxygenated sACSF.
Примечание: Мы представляем две разные стратегии для рассечения гиппокампа, Полосатое тело и коры. Первая стратегия (шаги 5.1-5.10) является полезным для любой мыши линии, в то время как Вторая стратегия (шаги 6.1-6.7) потребуется флуоресцентные репортер мыши аккуратно отделить стриатума от Глобус бледного и других структур головного мозга. Если нежелательно Полосатое тело, затем игнорируйте стриатума конкретных частей двух методов
Рисунок 1 : Схема и изображений для мозга рассечение, техника #1
Рассечение приемы, описанные в шагах 5.1-5.10. Если полосатой ткани, место P1 мозга в мозг матрицы вентральной стороне вверх. Место лезвия в матрице слоты через передний мозг, чтобы получить коронковой части через стриатума. Удаление полосатой куски из обоих полушарий, повторите для всех разделов, содержащих стриатума находящиеся впереди гиппокампа. Если нежелательно полосатой ткани, просто hemisect мозга, место медиальной стороне полусферы вверх в блюдо и удалить структуры мозга вентральный медиальный (таламус, базальных ганглиев и т.д.) подвергать гиппокампа. Использование пинцета щепотку гиппокампа, а затем переверните полушария и использовать пинцет для того чтобы рассечь, кусок ткани коры головного мозга. Вертикальные черные линии через схемы полушарий, где разрезы бы удалить секции полосатой. Шкалы бар = 500μm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
5. урожай стриатума, гиппокамп и коры, техника #1
- Поместите весь мозг на секционирование матрица плесень, вентральной стороне вверх. Место 1 лезвие бритвы через наиболее передняя часть головного мозга (через переднюю обонятельный тракт).
- Вставьте другой лезвие только задняя к первой для создания среза 0,5 мм и сместите дополнительное лезвие для этот один.
- Передача этих фрагментов в чашке Петри с carboxygenated sACSF и разместите остальную часть мозга в отдельное блюдо с sACSF. Передать рассечения область для визуализации стриатума полосатой ломтиками. Эти фрагменты должен содержать большую часть передней стриатума и отсутствие гиппокампа. Использование флуоресцентных, пройдя через область с Nkx2.1-Cre+ /; Ai9+ / ломтики различать слабые полосатой tdTomato сигнал от сильного tdTomato сигнал Глобус бледного.
- С или без флуоресценции выделяться стриатума от обоих полушарий на всех секций и передачи полосатой куски для правильно помечены 50 мл трубки с sACSF, хранить на льду.
- Hemisect мозг вдоль средней линии, с помощью щипцов или лезвием бритвы и заложить полушария, так что медиальной поверхности вверх.
- Удалите вентральной мозговой ткани (таламус, базальных ганглиев, и т.д.), щипать от этой ткани с щипцами. По завершении, гиппокамп (колбаса в форме структуры, охватывающей переднезаднем оси вдоль наспинная коры) и желудочковая стороне коры должна быть отчетливо видна.
- Для удаления гиппокампа, вставьте советы щипцы перед передней гиппокампа и аккуратно отделить гиппокампа от коры, перемещая щипцы кзади и щипать гиппокампа кортикального слоя на границе. Перевести правильно помечены 50 мл трубки с sACSF изолированные гиппокампа, хранить на льду.
- Для того чтобы рассечь коры, место hemisected кора медиальной стороны вниз. Затем используйте щипцы для щепотка наиболее спинной, брюшины, передней и задней части коры оставить квадратный кусок медиальной соматосенсорной коры, ~ 2 мм х 2 мм. флип коры так медиальной стороне вверх и чистой любой избыток не кортикального слоя ткани (таламус базальных ганглиев, и т.д.) на медиальной поверхности в случае необходимости. Перевести правильно помечены 50 мл трубки с sACSF кусок коры, хранить на льду.
- Повторите эту процедуру с другом полушарии собирать гиппокампах и коры регионов.
- Повторите эту процедуру для всех щенков, убедившись в том заменить sACSF в чашках Петри между щенков для обеспечения того, чтобы sACSF холодные и свежие.
Рисунок 2 : Схема и изображений для мозга рассечение, техника #2
Рассечение приемы, описанные в шагах 6.1-6.7. Штифт мозг на спинной стороне рассечения блюдо вверх. После пилинга коры вперед, гиппокамп и Полосатое тело являются видимыми и могут быть удалены, то часть коры могут быть удалены, как описано в предыдущем методе. В зависимости от линии трансгенные мыши Полосатое тело можно очистить для удаления Глобус бледного и других тканей. В Nkx2.1Cre; Ai9 мыши линии, глобус бледного имеет значительно большую плотность помидор + клеток, по сравнению с стриатума. Шкалы бар = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
6. урожай стриатума, гиппокамп и коры, техника #2
- Мозг вентральной стороне вниз в sylgard покрытием Петри блюдо, содержащие sACSF и контактный его через мозжечка и передней коры или обонятельной луковицы.
- Начиная с одного полушария, используйте щипцы изогнутые осторожно отделить задней коры от базовой гиппокампа и других тканей. Аккуратно положите очищенных от коры плашмя на Петри блюдо. Повторите для других полушарии. Гиппокампах и Полосатое тело должно быть отчетливо видна в подвергается мозга.
- Используйте корнцанг щепотку один гиппокампа в средней линии и гиппокампа сбоку, чтобы удалить кожуру. Место в коллекции флакона на льду и повторите с другой гиппокампа.
- Полосатое тело аккуратно выскоблите вокруг краев Полосатое тело, чтобы ослабить его от окружающих тканей. Затем удалите стриатума, щипать его из под и добавить к коллекции трубки на льду. Повторите для других стриатума.
- Корковых разделы могут быть собраны, как описано в шаге 5.8.
- При использовании трансгенных репортер мыши линии (например, Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFPи т.д.), передача стриатума Петри блюдо с sACSF и посмотреть под люминесцентные, пройдя через область. Используйте щипцы для удаления любого не полосатой ткани из стриатума (в Nkx2.1-Cre; Ai9 мышей, удалить все «светлый» ткани, как глобус бледного имеет гораздо выше МГЕ производные, tdTomato + плотность ячеек по сравнению с стриатума). Повторите для всех стриатума.
- Повторите эту процедуру для всех щенков, убедившись в том заменить sACSF в чашках Петри между щенков для обеспечения того, чтобы sACSF холодные и свежие.
7. Создание диссоциацией одну ячейку
- После завершения рассечение Подготовьте 1 мг/мл Проназа решение весом 10 мг Проназа и растворяют в 10 мл carboxygenated sACSF.
- Передача ткани из коллекции флаконы по 50 мл по 5 мл раунд дно пробирки, содержащие 2 мл раствора Проназа sACSF. Инкубируйте ткани на 20 мин при комнатной температуре, пожимая/стряхивая трубку 3 - 4 раза с пальцем во время инкубации смешать образцы.
- Во время этой инкубации, приготовляют раствор растворения: 1% FBS (100 мкл) + DNAse (1 мкл мэм акции DNAse) в 10 мл carboxygenated sACSF.
- После 20 минут тщательно удалить Проназа решение не беспокоить ткани на нижней и заменить его 1-2 мл раствора растворения (общий объем зависит от начиная количество ткани).
- Механически отделить ткани, истирание ткани с ранее подготовленные огонь полированные пипетки Пастера. Начиная с пипеткой (~ 600 мкм) крупнотоннажных, аспирационная и изгонять ткани решение по крайней мере десять раз с распадаются на ткани. Не вводить в раствор пузыри. Повторите этот процесс для среднего родила пипетки и малых родила пипеткой. Решение должно быть ясно, и не ясно, кусок ткани должен быть видимым в коллекции трубок.
- Накапайте решение lysate клетки через фильтр 50 мкм в 5 мл конические трубы, чтобы удалить любую ячейку сгустки. Перейти с этих решений одной ячейки проточная цитометрия (или потенциально напрямую в ячейку, считая, если не сортировка необходима).
8. Подготовка решения СУИМ очищенная клеток для трансплантации
- По получении решения клетки от проточный цитометр, решение передать один (или несколько) 1,5 мл конические трубы и спина клетки на 500 g 5 мин на 4oC. После центрифугирования, удалите СМИ так что ~ 20-40 мкл остаются в трубе. Восстановить клетки в этом остальные средства массовой информации (и объединить решение, если необходимо несколько трубок).
- На небольшой кусок парафина Смешайте 2 мкл клеток решение + 8 мкл sACSF + 10 мкл Трипановый синий пятно. Накапайте 10 мкл в Горяева с сдвиньте крышку.
- Подсчитать количество живых клеток в каждой из 4 x 4 квадратных сетки в углах Горяева, используя стандартный лабораторный ручной подсчет счетчика (мертвые клетки будет синий от красителя), и в среднем эти 4 отсчета. Умножьте это число на 100, чтобы определить количество клеток / мкл.
- Если необходимо, отрегулировать громкость, так что клетки находятся в концентрации 10 000-30 000 клеток/мкл в растворе растворения. Конечная концентрация зависит от общего количества клеток и желаемое количество трансплантаций. Держите клетки на льду для трансплантации
9. пересадка в детенышей P0-2 Вт
- Оберните WT щенка в некоторых парафина или перчатку и место, где она хорошо покрыты под льдом. Установите таймер на 5 минут и запустите его. После этого времени удалите щенком и проверьте, что он не реагировать щипать из hindpaw.
- В то время как щенка на льду, mix решение клеток, закупорить он несколько раз для обеспечения суспензию клеток хорошо перемешивается до погрузки (смесь клетки перед загрузкой микропипеткой для каждой инъекции). Затем очистить микропипеткой минерального масла и заполнить его полностью с суспензию клеток.
- Место наркотизированных щенка на Петри блюдо с его голову, лежа на клеевой шпаклевки, так что относительно плоской верхней части головы. Место ленты с отверстием алмазов через головы щенка, потянув ее тугой обеспечить, кожа растягивается и руководитель фирмы, но, что мышь является удобной и дышит хорошо. Лямбда должна быть видна через отверстие алмазов.
Рисунок 3 : Схема и изображений для трансплантации
(A) фотографии установки впрыска. Обратите внимание, что лямбда отчетливо видна через щенка череп и должно использоваться для обнуления микропипеткой. Шкалы бар = 1 дюйм. (B) схемы с изображением процедуры инъекции целевой гиппокампа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Переместить обеспеченного щенка под Nanoject и ниже микропипеткой, таким образом, чтобы кончик микропипеткой на непосредственно над лямбда. Запись координат x-y на манипулятор.
- Отрегулируйте манипулятор ручки для перемещения микропипеткой желаемого координаты по медиолатеральной и переднезаднем оси головы: S1 коры → 1,0 мм передней и 1,0 мм боковые, гиппокампе → 0,75-1,0 мм передней и боковых 1,0-1,2 мм, стриатума → 2,0-2,2 мм передней и боковых 1,5 мм. Координаты можно подобрать слегка компенсировать возраст щенка (например, P0 против P2) или деформации мышей (например, CD1 мышей больше и C57/B6 в P2).
- Опустите микропипеткой, до тех пор, пока она образует небольшой вогнутости на коже. Затем поверните ручку манипулятор z-axis твердо, но осторожно диск микропипеткой через кожу и черепа, чтобы войти в мозг. Когда микропипеткой входит мозга, давление на череп будет выпущен и вогнутость исчезнут.
- Убрать микропипеткой слегка, пока кончик окружен конус кожи, форменн как палатку. Читать координаты по оси z: это будет z-axis нулевой точки.
- Опустите микропипеткой до желаемой глубины: коры → 0,75-1,0 мм, гиппокамп → 1,2-1,5 мм, стриатума → 2,0-2,5 мм, глубина может корректироваться слегка компенсировать возраста или штамм щенка.
- Инъекционные суспензии клеток, используя программу Nanoject III, описанных выше. После инъекции программа является полной, подождите 15-20 s перед медленно втягивать микропипеткой для сведения к минимуму утечки из укола решения.
- Если выполнение двусторонних инъекции, повторно нулевой микропипеткой выше лямбда и перейти к правильной координаты в другом полушарии. Кроме того можно сделать две инъекции в коре же полушария, перемещая микропипеткой 1 мм передней первой инъекции.
- После трансплантации завершена, удалите ленту и передавать щенка на грелку. При необходимости, Теги щенка, хвост или мыс отсечения. Как только щенок выкупила красный цвет и движется, поместите его обратно в клетке с матерью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол демонстрирует урожай регионах конкретных мозга от раннего послеродового мозги (рис. 1-2), собрать одну ячейку диссоциацией межнейронного прекурсоров и пересадить эти клетки в различных регионах мозга в наивной WT послеродовые щенков (рис. 3). Для posthoc анализа мозги, которые получили межнейронного прекурсоров графтов собрано между P30-35 характеризовать морфологии клеток, нейрохимических маркеры и электрофизиологических свойств. Эти типы анализов часто проводятся между P21-P30 в обычных мышей, но поскольку созревания пересаженные клетки может быть немного задержано, благодаря процедуре вскрытия/диссоциации, ждать еще 5-10 дней рекомендуется для компенсации этого задержка созревания. Тип анализа, чтобы выполняться будет диктовать правильную стратегию для урожая в мозг. В частности мы не наблюдали преференциальных клеточной гибели конкретных межнейронного подгрупп, которые могли бы исказить за или против некоторых подтипы20.
Для иммуногистохимии анализа мышей были увлажненную с параформальдегида 4% и мозги были удалены. 50 мкм vibratome ломтики были подготовлены через целевые мозга регионе и хранятся в раствор антифриза или обработаны для иммуноокрашивания как описано20. Мозги не содержит каких-либо помидор + клетки, которые могут быть из-за неправильной ориентации (например, инъекции слишком глубоко в желудочке), клетки потерял или проходят apoptosis в прививочных процедуры или неприятие пересаженные клетки принимающей. На основе окончательного клеток, предполагается что только 2-5% привитых клеток выжить20, которое соответствует другие процедуры трансплантации22,23.
Не удивительно был значительной изменчивости в общее количество помидор + клеток в успешной трансплантации, начиная от десятков до нескольких тысяч помидор + клеток (рис. 4A). Привитые клетки были локализованы в правильной регионах, со многими отображение межнейронного морфологии и хорошо изученных межнейронного нейрохимических маркеры (рис. 4В). Наблюдались аналогичные цифры выживания клетки и созревания профили, даже когда клетки были привиты в новых условиях в heterotopic трансплантации (рис. 4 c).
Помимо Иммуногистохимический анализ чтобы убедиться, что они интегрированы в цепь мозга и ожидаемой внутренней и стрельбы свойства отображения была проведена электрофизиологический анализ на привитых клетки. Мозги были собраны от мышей P30-35 и фрагменты для физиологических записи как ранее описанных20. Привитые интернейронов представил взрослого как физиологические свойства и собственный стрельбы, шаблоны могут быть охарактеризованы, были представитель хорошо изученных межнейронного подтипы (Рисунок 5A), предполагая, что привитые интернейронов были в состоянии должным образом созревают в среде узла. Чтобы убедиться, что пересаженные клетки были интегрированы в нейронной сети, sEPSCs были также записанные (Рисунок 5B). Кроме того подмножество пересадки были выполнены с интернейронов, выражая ChR2 следуют записи из пирамидальных клеток локализованных вблизи пересаженных интернейронов. Эти данные свидетельствуют, что постсинаптических ГАМК течения вызванные синий свет (рис. 5 c-D).
Рисунок 4 : Привитые межнейронного прекурсоров заполнения принимающих регионах мозга представитель Секции от P30 WT мышей, которые были пересажены с томат + межнейронного прекурсоров на P1. (A) в гомотопных коры к коре трансплантаций, привитые клетки заполнить все слои коры и отображение морфологии, которые имитируют эндогенного интернейронов. Выбранные изображения выделите изменчивость числа клеток из различных трансплантации, с левого изображения, имеющие гораздо большее количество помидор + клеток в каждой секции, по сравнению с пересадки на правой стороне. (B) малое увеличение (слева) и представитель Секции большого увеличения (справа) от гомотопных гиппокампа в гиппокампе графтов. Обратите внимание, что большинство помидор + клеток в пласт oriens (SO) Экспресс SST (вероятно, O-LM клетки), тогда как многие помидор + клеток в pyramidale слой (SP) Экспресс PV (вероятно, корзина клетки), похож на эндогенных гиппокампа интернейронов. (C) пример heterotopic трансплантации (Cortex-стриатума) с томат + в стриатума. Масштаб баров = 200 мкм в A панели низкой маг в B, 50 мкм в C и высокой мощности mag в б. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Electrophysiologically Зрелые привитые интернейронов и интегрировать в нейронной сети host
(A) представитель примеры самых высоких частот стрельбы записаны от привитых интернейронов. Слева, быстро пики межнейронного от хип-Ctx трансплантата, вводят текущие шаги:-100 Па и ПА 520; право, Non-Fast пики межнейронного от СТХ-Ctx трансплантата, вводят текущие шаги: -100 Па и 360 ПА. (B) пример sEPSCs записан в конце пики межнейронного от бедра до бедра трансплантации. (C) представитель изображения, отображение Nkx2.1-Cre; Ai32 клетки (рекламы ЯФП) от Ctx для Ctx пересадки с biocytin заполнены (красный) пирамидальной клетке. Шкалы бар = 50 мкм. (D) пример ГАМК постсинаптических токов, вызываемые синий световых импульсов записан в пирамидальных клеток, записанный с [145 мм] Cl-. В черном средняя следы; в красном среднее время ответа записаны в присутствии Gabazine. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одним из важнейших аспектов настоящего Протокола максимизация выживаемость клеток. Обеспечение того, что ткани и клетки, всегда в ледяной carboxygenated sACSF необходимо поощрять выживание клетки. Это требует эффективного диссекции и диссоциации стратегии для сведения к минимуму продолжительность времени, которое клетки проводят в различных решений и вне среды мозга. В зависимости от числа регионов мозга расчлененные и пересадить это может быть полезно иметь партнера помощь в диссекции и/или трансплантации шаги для уменьшения продолжительности эксперимента. Для обеспечения здоровья и выживания щенка, важно также, чтобы свести к минимуму время анестезии льда (< 4 мин) и держать щенка, нагревают с света во время процедуры трансплантации.
Может быть значительной изменчивости в трансплантированы мозги, некоторые не могут содержать любые привитые клетки, в то время как другие мозги будут содержать тысячи. Комбинируя несколько пометов P0-P2 для диссекции может увеличить количество клеток, собирают для прививки, что позволяет увеличить плотность клеток трансплантации или увеличить количество привитые щенки, оба из которых повысит вероятность успешные трансплантации. Для надлежащего мозга регионе, важно, что головы щенка стабилизируется и не двигаться, когда снижение микропипеткой в мозг. Смещение головы или изгиба вала микропипеткой может привести к стигматизацию и неточные инъекции (например, потеря клеток в боковой желудочек). Кроме того выполняя несколько инъекций сайтов за щенком (односторонней или двусторонней основе) может улучшить показатели успеха в случае одного укола mistargeted. В будущем было бы оптимальным разработать стратегию более эффективной стереотаксического стабилизировать щенком и обеспечить более точное и последовательное инъекции.
TH P0-P2 сроки был выбран по научным и техническим причинам. В этом возрасте большинство межнейронного прекурсоров мигрировали на их сайты, терминал, но имеют минимальный экологических взаимодействий. Этот срок может не справедливы для других типов нейрональных клеток и областях мозга, поэтому одно может потребоваться настроить эти timepoints для своих конкретных целей. Например, было бы интересно сравнить терапевтический потенциал этих прекурсоров межнейронного P0-P2 собирают с МГЕ собирают клетки: один возраст может иметь больше преимуществ и/или меньше нежелательных побочных эффектов, чем другие. Кроме того, это может быть интересно для выполнения heterochronic трансплантации (например, сбор клеток на P0-P2 и пересадка в мозги P7-10, или наоборот) для выявления как временные изменения в окружающей среде может повлиять на судьбу клеток и созревания. Преимущество выполнения инъекции P0-2, что череп относительно тонкий и может быть легко проникли с острым микропипеткой. Любые инъекции над P5 потребует удаления или истончение черепа.
Анализ указанных в настоящем Протоколе ограничивается особенностей межнейронного подтипы, которые выражаются дифференциально между областями мозга. В будущем одно может использовать силу одноклеточного последовательности характеризовать полным транскриптом привитые клеток. Это непредвзятый подход мог бы определить конкретные гены (или больше сигнальных каскадов), которые сильно обогащенный или обедненный пересаженные клетки, по сравнению с контроля, которые обеспечивали бы понимание кандидата экологические сигналы, которые будут влиять на судьбу определение или созревания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано национальных институтов здравоохранения (K99MH104595) и NICHD интрамуральных исследовательской программы для T.J.P. Мы благодарим горд Fishell, в которых лаборатории первоначально был создан этот подход.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
