Utmanande unga nervceller i nya regioner av hjärnan kan avslöja viktiga insikter i hur miljön skulpterar neuronala öde och mognad. Det här protokollet beskriver en procedur för att skörda interneuron prekursorer från delar av hjärnan och transplantera dem antingen homotopically eller heterotopically in i hjärnan av postnatal pups.
Neuronala öde beslutsamhet och mognad kräver ett intrikat samspel mellan genetiska program och Miljösignaler. Förgrymmat roller inneboende vs. extrinsic mekanismer som reglerar denna differentiering process är dock en gåta för alla utvecklingstoxicitet neurobiologists. Problemet förstoras för GABAergic interneuroner, en otroligt heterogen cell befolkning som är födda från övergående embryonala strukturer och genomgå en utdragen flyttande fasen att skingra hela telencephalon. För att utforska hur olika hjärnan miljöer påverkar interneuron öde och mognad, utvecklade vi ett protokoll för skörd fluorescently märkt omogna interneuron prekursorer från delar av hjärnan hos nyfödda möss (P0-P2). I den här åldern interneuron migreringen är nästan klar och dessa celler är bosatta i sin sista vila miljöer med relativt liten synaptic integration. Efter insamling av enstaka cell lösningar via flödescytometri, dessa interneuron prekursorer transplanteras in P0-P2 vildtyp postnatal pups. Genom att utföra både homotopic (t.ex. cortex-till-cortex) eller heterotopic (t.ex. cortex-till-hippocampus) transplantationer, man kan bedöma hur utmanande omogna interneuroner i nya hjärnan miljöer påverkar deras öde, mognad och krets integration. Hjärnor kan skördas i vuxna möss och analyseras med en mängd olika posthoc analyser på ympade celler, inklusive immunhistokemisk, elektrofysiologiska och transkriptionell profilering. Detta generella tillvägagångssätt ger utredarna en strategi till assay hur skilda hjärnan miljöer kan påverka många aspekter av neuron utveckling och identifiera om neuronala särdrag är främst driven av hårdkodade genetiska program eller miljömässiga ledtrådar.
Kortikal funktion kräver en balans mellan retande projektion nervceller och hämmande GABAergic interneuroner, en extremt heterogen befolkning med distinkta morfologier, elektrofysiologiska egenskaper, connectivity och neurokemiska markörer. Onormal utveckling och funktion av interneuroner (och specifika interneuron undergrupper) har kopplats till patobiologi av psykiatriska sjukdomar som schizofreni, autism och epilepsi1,2,3. Dessutom är många gener inblandade i dessa sjukdomar i hjärnan starkt berikad med unga interneuroner4. Således behövs en större förståelse för de mekanismer som reglerar interneuron öde beslutsamhet och mognad att förstå normala utveckling och potentiella etiologier många hjärnsjukdomar.
Framhjärnan interneuroner föds främst från två övergående embryonala strukturer, de mediala och stjärtfenan ganglieblockerande eminenser (MGE och CGE, respektive). Dessa postmitotic celler (interneuron prekursorer) sedan genomgå en utdragen tangentiella migration fas att skingra hela telencephalon där de integreras i en mängd olika kretsar. MGE-derived interneuroner består av tre till stor del icke-överlappande, neurochemically definierade undergrupper: snabbt tillsatta parvalbumin (PV+) interneuroner, icke-fast tillsatta somatostatin (SST+) interneuroner, och sent tillsatta neuronala nitrat Oxide synthase (nNOS+) interneuroner som utgör Hippocampus neurogliaform och murgröna celler. Talrika labs har identifierat flera mekanismer inom MGE som reglerar inledande öde beslut till PV+ eller SST + interneuroner, inklusive rumsliga övertoningar morphogens, födelsedatum av interneuron prekursorer och funktionsläget av neurogen division 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. det har föreslagits att interneuroner initialt differentieras till ‘kardinal klasser’ och sedan successivt mogna till ‘slutgiltiga klasser’ som de interagerar med deras miljö11. Nya rön indikerar att några mogna interneuron undertyper kan vara genetiskt hårdkodade som dessa celler blir postmitotic i de ganglieblockerande eminenser, som visar att tidig definierade inneboende genetiska program kan spela en större roll än tidigare uppskattad12,13. Nyckelfrågan om hur de inneboende genetiska program interagerar med miljön ledtrådar till drive differentiering in distinkta interneuron subtyper är dock fortfarande till stora delar outforskat.
Ett flertal studier har transplanteras embryonala MGE celler direkt in i en mängd olika hjärnregioner, med resultaten konsensus som ympade celler mogen och släppa GABA för att generellt hämma de lokala endogena kretsar14,15, 16,17,18,19. Dessa lovande observationer har genererat betydande intresse i att använda mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hIPSC)-härledda interneuroner för att behandla en mängd olika hjärnsjukdomar. Dock tänker mycket få av dessa studier bedöma om dessa ympade celler mognar till de förvänta typerna av mogna interneuroner, en kritisk komponent när man på translationella angreppssätt.
För att lösa hur miljön påverkar interneuron differentiering och mognad, utformades en strategi för att transplantera omogna interneuron prekursorer till nya hjärnan miljöer för att undersöka huruvida ympade interneuroner anta funktioner i mottagande miljö eller behålla funktioner från givare miljö20. MGE transplantationer är inte lämpliga att ta itu med denna fråga eftersom MGE innehåller en blandad befolkning av interneuron och GABAergic projektion celler som skingra hela talrika hjärnan regioner21. Utan att veta var dessa MGE celler skulle har migrerats, kan man inte fullt ut bedöma hur dessa transplantationer påverkas av hjärnan miljön. Genom att skörda interneuron prekursorer vid tidig postnatal tidpunkter, är detta problem kringgås genom att erhålla omogna celler som har slutfört sin migration och uppnått sina mål hjärnan regionen men har minimal interaktion med miljön. Genom att fokusera på specifika funktioner i interneuroner som uttrycks differentially mellan olika hjärnregioner, kan man då bestämma hur värdmiljön ändrar interneuron egenskaper. En allmän strategi som beskrivs i detta protokoll bör vara tillämplig på någon utredare att vill undersöka hur unga nervceller beter sig när utmanas i en ny miljö.
En kritisk aspekt av detta protokoll maximera överlevnadsförmågan för cellerna. Att garantera att vävnader och celler är alltid i iskall carboxygenated sACSF är nödvändigt att främja cellöverlevnad. Detta kräver en effektiv dissektion och dissociation strategi för att minimera tiden som cellerna spenderar i olika lösning och utanför hjärnan miljön. Beroende på antalet regioner i hjärnan som dissekeras och transplanteras, kan det vara fördelaktigt att ha en partner som stöd i dissektion eller transpla…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av National Institutes of Health (K99MH104595) och NICHD intramurala research program till T.J.P. Vi tackar Gord Fishell, i vars lab upprättades ursprungligen detta tillvägagångssätt.
Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
Glucose | Sigma | G7528 | |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
Pronase | Sigma | 10165921001 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
DNase I | Sigma | 4716728001 | |
Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |