Yeni beyin bölgelerindeki genç nöronlar zorlu nasıl çevre nöronal kader ve olgunlaşma sculpts içine önemli anlayışlar ortaya çıkarabilir. Bu iletişim kuralı interneuron öncüleri belirli beyin bölgelerinden hasat ve onları her iki homotopically nakli için bir yordam açıklanır veya beyin ve postnatal yavrularını içine heterotopically.
Nöronal kader tayini ve olgunlaşma genetik programlarla çevre sinyalleri arasında karmaşık bir etkileşim gerektirir. Ancak, bu Farklılaşma süreci düzenleyen dışsal mekanizmaları vs içsel rolleri disentangling tüm gelişimsel neurobiologists için bir bilmece olduğunu. Bu sorun GABAergic interneurons, geçici embriyonik yapılardan tarihi ve telencephalon dağıtmak için uzun süren bir göçmen faz tabi bir inanılmaz türdeş olmayan hücre nüfus için büyütülür. Ne kadar farklı beyin ortamları etkiler interneuron kader ve olgunlaşma keşfetmek için geliştirdiğimiz fluorescently etiketli olgunlaşmamış interneuron öncüleri (P0-P2) yeni doğan farelerde belirli beyin bölgelerinden hasat için bir iletişim kuralı. Bu yaşta interneuron geçiş neredeyse tamamlanmış ve bu hücreler nispeten küçük sinaptik entegrasyonu ile son istirahat ortamlarında bulunan. Toplama tek hücre çözümler akış sitometresi ile bu interneuron öncüleri P0-P2 wildtype Doğum sonrası pups nakledilen. Her iki Homotopik yaparak (örneğin, korteks korteks) veya heterotopik (örneğin, korteks hipokampus) nakillerine, bir can değerlendirmek yeni beyin ortamlarda olgunlaşmamış interneurons zor onların kaderi, olgunlaşma ve devre entegrasyon nasıl etkiler. Beyin yetişkin fareler hasat ve posthoc analiz aşılı hücrelerde immunohistokimyasal, dahil olmak üzere, çok çeşitli ile denetlesinler elektrofizyolojik ve transkripsiyon profil oluşturma. Müfettişler nasıl ayrı beyin ortam tahlil için bir strateji ile çok sayıda nöron gelişim yönlerini etkilemeye ve belirli nöronal özellikleri öncelikle kablolu genetik programlar tarafından tahrik edilmektedir tanımlamak bu genel yaklaşım sağlar veya çevre ipuçları.
Düzgün kortikal uyarıcı projeksiyon nöronlar ve inhibitör GABAergic interneurons, farklı türleri morfoloji, elektrofizyolojik özellikleri, connectivity ile son derece heterojen bir nüfus arasında bir denge gerektirir ve nörokimyasal işaretleri. Anormal gelişimi ve interneurons (ve belirli interneuron alt gruplar) fonksiyonu bağlı psikiyatrik bozukluklar şizofreni, otizm ve epilepsi1,2,3gibi pathobiology. Ayrıca, birçok genler bu beyin bozukluklarında karıştığı güçlü genç interneurons4‘ te zenginleştirilmiş. Böylece, interneuron kader tayini ve olgunlaşma düzenleyen mekanizmalar daha büyük bir anlayış normal gelişim ve potansiyel etiologies çok sayıda beyin hastalıkları anlamak için gereklidir.
Ön interneurons öncelikle iki geçici embriyonik yapılardan, medial ve kaudal ganglionic efendiler tarihi (MGE ve CGE, sırasıyla). Bu postmitotic hücreler (interneuron öncüleri) nerede onlar çok çeşitli devreleri entegre telencephalon dağıtmak için uzun süren teğet geçiş aşaması geçmesi. MGE kaynaklı interneurons oluşur üç büyük ölçüde örtüşen, neurochemically tanımlı alt gruplar: hızlı parvalbumin (PV+) interneurons, hızlı-somatostatin (SST+) interneurons, spiking yükseliyor ve geç yükseldi nöronal nitrik hipokampal neurogliaform ve Ivy hücreleri teşkil oksit sentaz (nNOS+) interneurons. Çok sayıda labs düzenleyen ilk kader kararlar PV+ veya SST + interneurons, morfojenlerdeki, interneuron öncüleri, Doğum tarihi ve nörojenik bölümü modu kayma degradeleri de dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar içinde MGE belirledik 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. interneurons başlangıçta ‘Kardinal sınıfa’ ayırt etmek ve onların çevre11ile etkileşimde bulunan ‘kesin sınıfa’ aşamalı olarak olgun önerilmiştir. Son kanıtlar bu hücreler ganglionic efendiler, postmitotic olmak gibi bazı olgun interneuron alt türlerinden genetik olarak kablolu erken tanımlanmış içsel genetik programlar daha önce daha büyük bir rol oynayabilir gösteren olabileceğini gösterir takdir12,13. Ancak, içsel genetik programlar için sürücü farklılaşma ayrı interneuron alt türlerini içine çevre ipuçları ile etkileşimini anahtar soru büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır.
Çok sayıda çalışma embriyonik MGE hücreleri doğrudan beyin bölgeleri, hücreler olgun aşılı ve genellikle yerel endojen devresi14,15inhibe GABA bırakın uzlaşma sonuçları ile çeşitli içine nakledilen, 16,17,18,19. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücre (hIPSC) kullanarak önemli ilgi oluşturulan bu gözlemler umut verici-beyin hastalıkları çeşitli tedavi interneurons türetilmiş. Ancak, bu aşılı hücreler olgun interneurons beklenen türlerini olgun olmadığını çok az bu çalışmaların değerlendirmek, ne zaman bir kritik bir bileşeni translasyonel yaklaşımlar hakkında düşünüyor.
Nasıl interneuron farklılaşma ve olgunlaşma çevre etkileri gidermek amacıyla bir strateji aşılı interneurons şekil-in belgili tanımlık ev sahibi kabul olup olmadığını incelemek için yeni beyin ortamlara olgunlaşmamış interneuron öncüleri nakli için geliştirildi çevre veya özelliklerini donör çevre20korumak. MGE nakli MGE nüfus interneuron ve çok sayıda beyin bölgeleri21dağıtmak GABAergic projeksiyon hücreler içerdiğinden bu soruyu çözmek uygun değildir. Nerede bu MGE hücreler göç var bilmeden, bir tam olarak nasıl bu nakillerine beyin ortamı tarafından etkilenen değerlendirmek değil. İnterneuron öncüleri erken postnatal timepoints, hasat tarafından bu sorunu kendi geçiş tamamlayan ve hedeflerine ulaştı olgunlaşmamış hücreleri elde ederek hile beyin bölgesi ama çevre en az etkileşim yok. Differentially farklı beyin bölgeleri arasında ifade edilir interneurons özellikleri üzerinde odaklanarak, kimse o zaman nasıl interneuron özellikleri ana ortamı değiştirir belirleyebilirsiniz. Bu protokol için özetlenen genel yaklaşım herhangi bir araştırmacı için uygulanabilir olmalıdır meydan yeni bir ortamda ne kadar genç nöronlar incelemek istiyor ne zaman davranırlar.
Önemli bir özelliği, bu iletişim kuralı hücrelerin Beka maksimize. Doku ve hücreler her zaman buz gibi carboxygenated sACSF sağlama hücre survival tanıtmak gereklidir. Bu bir verimli diseksiyon ve çeşitli çözüm ve beyin ortamı dışında hücreleri harcamak süreyi en aza indirmek için ayrılma strateji gerektirir. Disseke ve nakledilen beyin bölgeleri sayısına bağlı olarak, diseksiyon ve/veya nakli adımda deneme uzunluğu azaltmak için yardımcı bir arkadaşın olduğu yararlı olabilir. Sağl?…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri (K99MH104595) ve T.J.P. NICHD intramural araştırma programı tarafından desteklenen Gord Fishell, kimin Laboratuarı’nda bu yaklaşım başlangıçta kurulmuş teşekkür ediyoruz.
Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
Glucose | Sigma | G7528 | |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
Pronase | Sigma | 10165921001 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
DNase I | Sigma | 4716728001 | |
Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |