Summary
Hier zeigen wir, wie eine Nähe Ligation Assay (PLA) verwenden, um MST1/MST2 Heterodimerization in festen Zellen mit hoher Empfindlichkeit zu visualisieren.
Abstract
Regulierte Protein-Protein-Interaktionen sind ein leitendes Prinzip für viele Signalisierung Veranstaltungen, und die Erkennung solcher Ereignisse ist ein wichtiges Element für das Verständnis, wie solche Wege organisiert sind und wie sie funktionieren. Es gibt viele Methoden, um Protein-Protein-Interaktionen in den Zellen zu erkennen, aber relativ wenige können verwendet werden, um Interaktionen zwischen endogenen Proteinen zu erkennen. Eine solche Methode, Nähe Ligatur Assay (PLA), hat mehrere Vorteile, seine Verwendung zu empfehlen. Im Vergleich zu anderen gängigen Methoden der Proteinprotein Interaktionsanalyse, PLA hat relativ hohe Sensitivität und Spezifität, mit minimalen Zelle Manipulation und im Protokoll beschriebenen erfolgen kann, erfordert nur zwei gezielt Antikörper abgeleitet aus verschiedenen Arten (zB., von Mäusen und Kaninchen) und eine spezielle Reagenzien: eine Reihe von sekundären Antikörper, die kovalent verknüpfte spezifischer Oligonukleotide sind, wenn in unmittelbarer Nähe zueinander gebracht, erstellen ein amplifiable Plattform für in Situ PCR oder rollenden Kreis Verstärkung. In diesem Vortrag zeigen wir, wie die PLA-Technik, um Änderungen in MST1 und MST2 Nähe in festen Zellen visualisieren anwenden. Die Technik in diesem Manuskript beschrieben gilt vor allem für die Analyse der Zelle Studien.
Introduction
Störung der MST1/Hippo-Signal wurde mit Entwicklungsstörungen und Karzinogenese1verbunden. Bei Säugetieren, die Kinasen MST1 und MST2 aktivieren (phosphorylieren) MOB1 und LATS1/2, von denen die letztere dann phosphorylates und inaktiviert die transkriptionelle Coaktivator ja-assoziierten Protein (YAP)2. In seiner aktiven Form (unphosphorylated) hat YAP Onkogenen Aktivität, Verbesserung der Transkription von Genen Zelle Verbreitung; umgekehrt, wenn YAP durch den Hippo-Weg inaktiviert, Zellproliferation wird unterdrückt und Apoptose gefördert3. In Geweben MST1 und MST2 gibt es hauptsächlich als aktive Homodimers aber Onkogenen Reize MST1/MST2 Heterodimere erhöhen können, und solche Heterodimere sind inaktive4. Wie MST1/MST2 Heterodimerization reguliert wird, bleibt jedoch schlecht verstanden. Homo- und Heterodimere sind vermittelte über Interaktionen zwischen C-terminale coiled-Coil Regionen MST1 und MST2 bekannt als SARAH Domänen5. Über ein in Situ nachgewiesen PLA in diesem Artikel zeigen wir die Anwesenheit von MST1/MST2 Heterodimere im menschlichen Schwann-Zellen (HSC) und menschliche embryonale Nieren-Zellen (HEK-293). PLA hat einen Vorteil gegenüber anderen Eiweiß/Protein-Interaktion-Nachweismethoden, weil dadurch die Erkennung von endogenen Protein-Protein-Wechselwirkungen, die identifiziert und quantifiziert werden, ohne die Notwendigkeit des Transgens Ausdrucks oder die Verwendung von Epitop Tags werden können 6.
Transduktion Signalwege sind weitgehend vom bedingte Verband der Komponente Proteine gesteuert. Zum Beispiel führt Stimulation der meisten Rezeptor-Tyrosin-Kinasen ihre Homo oder Hetero-Dimerisierung und anschließende Verbindung mit zusätzlichen intrazellulären Signalproteine, die ihrerseits weitere komplexe Form. Der PLA-Methode soll Nähe zwischen den Proteinen in den Zellen visualisieren unter der Voraussetzung, dass die Proteine weniger als 30-40 nm auseinander. Protein-Nähe in der Regel vom ersten Inkubation der Zellen mit entsprechenden Primärantikörper angehoben in verschiedenen Arten erkannt wird (zB., Hase und Maus) gegen jedes interagierenden Protein, dann Zugabe artspezifische Sekundärantikörper Pre-gekoppelte, kurze DNA-Sonden. Wenn die DNA-Sonden in der Nähe sind, kann eine bestimmte Verknüpfung DNA-Oligonukleotid gleichzeitig sowohl diese Sonden, bilden eine Plattform für die Verstärkung von in Situ PCR oder durch Walzen Kreis Mechanismus binden. Fluoreszierende Tags hinzugefügt, um die Verstärkung Reaktion ermöglichen Visualisierung der interagierenden Proteine, die erscheinen als fluoreszierende Punkte, die leicht zu quantifizieren und lokalisiert auf bestimmte Regionen in der Zelle7,8, 9 , 10.
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Protocol
1. Vorbereitung der Lösungen
- Bereiten Sie Fixativ Lösung: 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer. Nehmen Sie für 10 mL, 2,5 mL 16 % PFA und 7,5 mL 1 X PBS.
Gefahren: PFA ist in geringen Dosen krebserregend. Dämpfe und Hautkontakt sind gefährlich. Shop bei-20 ° C. - Bereiten Sie Permeabilisierung Lösung: 0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer. Fügen Sie für 100 mL der Lösung 100 µL Triton x-100 in 100 mL 1 X PBS hinzu. Lagerung bei Raumtemperatur (RT).
- Waschpuffer vorbereiten: 1 X TBST. Nehmen Sie für 1 L 100 mL 10 X TBS, dH2O 890 mL und 10 mL Tween 20 (10 %).
- Bereiten Sie blockierende Lösung als Kit geliefert. Alternativ können Sie 1 X PBS-Lösung mit 2 % BSA.
- Bereiten Sie das Antikörper-Verdünnungsmittel wie Kit geliefert. Alternativ können Sie 1 X PBS-Lösung mit 1 % BSA.
2. Beschichtung von Zellen
Hinweis: In dieser Studie verwendeten wir unsterblich menschlichen Schwann-Zellen (Royal) und menschliche embryonale Nieren-293-Zellen (HEK 293); Diese Methode ist jedoch für viele Arten von adhärenten Zellen einsetzbar.
- Kultur HEK 293 in DMEM mit 10 % ergänzt FBS, 0,2 % Glucose, 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin G und 100 µg/mL Streptomycin auf Gewebekultur imprägnierte Platten bei 37 ° C in 5 % CO2. Pflegen Sie Royal in 10 % FBS/DMEM mit Pen/Strep und 2 µM Forskolin ergänzt. Routinemäßig testen Sie Zellen für Mykoplasmen. Keine Zelle Zeile Authentifizierung durchgeführt wurde.
- Bestreichen Sie eine 16-Well-Kammer-Folie mit 50 µL 10 µg/mL natürliche Maus Laminin oder 0,01 % Poly-L-Lysin-Lösung und inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C in 5 % CO2. Teilen von Zellen mit 0,04 % Trypsin-EDTA.
- Platte Royal und HEK-293 in 100 µL Medium bei 80 % Zusammenfluss (15.000-25.000 Zellen/na).
- Inkubation der Zellen für 12-24 Stunden bei 37 ° C in eine befeuchtete, 5 % CO2 Inkubator.
(3) Fixierung und Permeabilisierung
- Entfernen Sie das Medium aus den Brunnen und mit 100 µL 1 X PBS waschen. Aspirieren Sie mit einer Mikropipette zur Minimierung des Risikos die Probe zu entfernen.
- Zellen durch Zugabe von 50 µL 4 % PFA pro gut und inkubieren Sie für 10 min bei RT, ohne Unruhe zu beheben. Zellen reagieren empfindlich auf Distanz, so vermeiden pipettieren die Lösungen direkt auf die Zellen.
- Waschen Sie die Zellen mit 0,05 % TBST drei Mal für 5 Minuten. Aspirieren Sie mit einer Mikropipette zur Minimierung des Risikos die Probe zu entfernen.
- Behandeln der Zellen mit Permeabilisierung Lösung (0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer) für 10 min ohne Agitation bei RT
- Waschen Sie Zellen mit TBST dreimal für jeweils 5 min. unter Rühren.
4. Sperrung
- Tippen Sie auf die TBST (sehr sanft mit einer Mikropipette). Visualisieren Sie die Folie in einem Mikroskop zu sehen, ob Zellen verbunden bleiben.
- Geben Sie einen Tropfen (50-60 µL) von 1 x Blocking Lösung zu jeder Probe.
- Eine Feuchte Kammer (leer Tip Box mit Wasser) bei 37 ° C vorheizen und die Folien in es für 1 h bei 37 ° c inkubieren
5. primäre Antikörper
- Die primären Antikörper (1: 100) in der Antikörper Verdünnungsmittel verdünnen (siehe Tabelle der Materialien). 40 µL Antikörperlösung pro Bohrloch vorzubereiten.
- Entfernen Sie blockierende Lösung durch Antippen die Flüssigkeit von den Folien. Lassen Sie nicht zu trocken Zellen.
- Wirbel und jedes gut 40 µL der Antikörper Lösungen hinzufügen.
- Inkubieren Sie 1 h bei 37 ° C in einen vorgeheizten Feuchte Kammer.
(6) Nähe Ligation Assay Sonden
Hinweis: PLA-Sonden als Teil eines Kits bereitgestellt werden (siehe Tabelle der Materialien). Die Wahl der Sonden richtet sich nach den Arten von primären Antikörper verwendet, um die Proteine des Interesses zu erkennen.
- Verdünnen Sie die zwei PLA-Sonden (Anti-Maus-MINUS und PLUS Anti-Kaninchen) 1:5 in der Antikörper Verdünnungsmittel. Bereiten Sie für jede Probe 40 µL PLA-Sonde. Die Mischung für 20 min bei RT inkubieren
- Tippen Sie auf die primären Antikörper-Lösung von den Folien. Waschen Sie die Folien zweimal für jeweils 5 min. mit waschen Puffer bei RT
- Sanft von Waschpuffer von den Folien tippen und Brunnen (40 µL/Well) die Verdünnungsmittel PLA Sonde Lösung hinzufügen.
- Inkubieren Sie die Folien in eine vorgewärmte Feuchte Kammer für 1 h bei 37 ° c
(7) Ligatur
Hinweis: Die in Situ Detektion Reagenzien rot, Ligase und Ligation Lösung dienen als Teil eines Kits (siehe Tabelle der Materialien).
- Verwenden Sie das in Situ Detektion Reagenzien rot.
- Unmittelbar vor dem Gebrauch, Wirbel und die geforderten Mengen von 5 x Ligatur Lager 1:5 in hochreinem Wasser verdünnen.
Hinweis: Bewahren Sie verdünnte Reagenzien. - Tippen Sie auf die PLA-Sonde-Lösung von den Folien. Waschen Sie die Folien in 1 x Waschpuffer zweimal für 5 min bei RT
- Unmittelbar vor der Zugabe zu Proben Wirbel und die Ligation Lösung bei 01:40 Ligase hinzufügen Verdünnung und Wirbel wieder.
- Tippen Sie auf aus der Waschpuffer von Folien und fügen Sie die Ligation/Ligase-Lösung in jede Vertiefung (40 µL/Well).
- Inkubieren Sie die Folien in eine vorgewärmte Feuchte Kammer für 30 min bei 37 ° c
(8) Verstärkung
Hinweis: Die Verstärkung Lager als Teil eines Kits vorgesehen ist (siehe Tabelle der Materialien). Reagenzien sind lichtempfindlich; So vermeiden Sie die Folien zum Vorschein.
- Wirbel und die geforderten Mengen von 5 x Verstärkung Lager 1:5 in hochreinem Wasser verdünnen und mischen.
- Tippen Sie auf die Unterbindung/Ligase-Lösung von den Folien. Waschen Sie die Folien in 1 x Waschpuffer zweimal für 2 min bei RT
- Wirbel und die Polymerase die Verstärkung-Lösung bei Verdünnung von 1: 80 und Vortex erneut hinzufügen.
- Tippen Sie auf Ausschalten Waschpuffer von Folien und fügen Sie die Verstärkung/Polymerase-Lösung in jede Vertiefung (40 µL/Well). Inkubieren Sie die Folien in eine vorgewärmte Feuchte Kammer für 100 min bei 37 ° c
9. Vorbereitung für die Bildgebung
Hinweis: Diese sind leicht empfindlichen Reagenzien. Aufbewahren Sie die Folien vor Licht geschützt.
- Tippen Sie die Verstärkung-Polymerase-Lösung von den Folien und waschen Sie zweimal für 10 min jeweils in 1 x Waschpuffer bei RT
- Entfernen Sie die Kammern und Silikon um die Brunnen aus der Folie vollständig. Die restlichen Bits aus Silikon mit einem Rasiermesser abkratzen. Zeichnen Sie ein Raster auf der Folie trennt jeweils gut.
- ~ 40 µL Eindeckmedium mit DAPI hinzufügen. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, Überfüllen Luftblasen unter dem Deckglas. Die Kanten des Deckglases können mit Nagellack versiegelt werden.
- Warten Sie mindestens 20 Minuten vor der Durchführung Bildanalyse mit einem konfokalen Mikroskop.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Nach dem Imaging, speichern Sie die Folien bei-20 ° C im Dunkeln.
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Representative Results
Wir verwendet die PLA-Assay, um die Interaktion zwischen MST1 und MST2 in HEK-293 und Royal zu testen. Die Zellen wurden behoben, permeabilized und befleckt mit verschiedenen Antikörpern, gefolgt von in Situ Verstärkung nach dem PLA-Protokoll (Abbildung 1). Um das Niveau der MST1/MST2 Heterodimerization zu dokumentieren, wurden Zellen mit MST1 und MST2 Antikörper (Abb. 1A, 1 C und 1 G) gebeizt. Als Positivkontrolle verwendeten wir auch ERK und munter Antikörper, die voraussichtlich in der Nähe in Zellen mit aktiviert ERK (Abbildung 1 b und 1F). Zellen ohne MST1 und MST2 zeigen keine PLA-Signal (Abbildung 1). Zellen mit nur einem der beiden Antikörper gefärbt zeigen ebenfalls kein PLA-Signal (Abbildung 1). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass HEK-293-Zellen und Royal MST1/MST2 Heterodimere, konsistent mit früheren Ergebnissen von unserem Labor4enthalten. Als eine zusätzliche negative Kontrolle inkubiert wir Zellen mit ERK und MST2 Primärantikörper, Spezifität der Signale (Abbildung 1 und 1 H) zu zeigen.
Um Ebenen MST1 und MST2 Meinungsäußerung bestätigen Auszüge aus WT MST1/MST2 ko-HEK-293-Zellen, bzw. wurden durch und analysiert Immunoblot mit der angegebenen Antikörper (Abbildung 1I).
Abbildung 1 : Vertreter PLA-Daten. (A-H) Zellen wurden fixiert und gefärbt mit der angegebenen Antikörper, gefolgt von der PLA-Verfahren. Blau: DAPI, rot: PLA-Signal. Mikrofotos wurden mit einer Leica SP5 confocal Mikroskop erzielt. (I) Immunoblot für MST1 und MST2. Maßstabsleiste ist 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir fanden es nützlich, Kammer Objektträger für dieses Experiment zu verwenden, wie es sehr praktisch zum Experiment mit mehreren (14-16) Zelllinien durchführen ist und es keine Notwendigkeit gibt, die Probe jedes Mal während der Mikroskopie Analyse ändern. Ein paar Komplikationen auftreten, wie ein erhöhtes Risiko für Cross-Kontamination mit Antikörpern. Daher empfehlen wir waschen jeden gut einzeln anstatt Kanope Coplin, trotz der erhöhten während des Experiments. Darüber hinaus Entfernen von Silikon-Einlage ist eine heikle Angelegenheit und muss mit Sorgfalt und Geduld durchgeführt werden. Selbst bei sorgfältiger Technik ist es manchmal möglich, kleine Mengen von Silikon Schutt nach Entfernung des Einsatzes zu sehen. Aus diesem Grund muss man gewissenhaft, die Silikon-Einlage entfernen, mit einer Rasierklinge bei Bedarf, wie zuviel gesehen Silikon die konfokale Entfernung während Mikroskopie verändern kann. Es kann auch zum Zeichnen von Linien als Grenzen von Brunnen, nach dem Entfernen der Silizium einfügen, um die Zellen unter dem Mikroskop finden nützlich.
Es ist zwingend notwendig, primäre Antikörper-Kreuz zu verwenden, dass jeweils nur ein Mitglied der Heterodimer erkennen (z. B. die MST1 Antikörper sollte nicht auch erkennen, MST2 und umgekehrt). Darüber hinaus ist es wichtig, denken Sie daran, verschiedene Tipps zur Vermeidung von Kreuzkontamination von primären Antikörper und PLA-Sonden, um zu vermeiden, berühren den Boden des Brunnens und Vermeidung, pipettieren direkt über Proben. Wir fanden, dass für Royal, es besser, Mantel Kammer Folien mit 0,01 % Poly-L-Lysin-Lösung ist und für HEK-293, es besser, Mantel mit Maus 10 µg/mL Laminin ist.
Wie bei jedem Eingriff gibt es einige Einschränkungen dieser Methode. Die PLA-Assay, wird während eine leistungsfähige Methode für die Gründe oben aufgelistet, durch die Spezifität und Sensitivität der Antikörper begrenzt. Darüber hinaus sollten Antikörper-Konzentrationen und Zelle Kulturbedingungen fein abgestimmt werden, bevor Laborversuche zur Verringerung der Kosten der Assays eingerichtet sind. In diesem Zusammenhang ist eine Alternative zu reduzieren die Kosten für die Assays, unbeschichtete 35 mm Glasboden Schale statt Kammer Folien zu verwenden.
Ein Vorteil des Tests ist, dass die Intensität und Anzahl der fluoreszierende Punkte kann quantifiziert werden, mit verschiedenen Computer-Software-Programme wie die Blob-Finder-Software, die Duolink Image Tool und th Olink Bioscience.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei der gesamte Chernoff-Labor für Beitrag zur Optimierung und Validierung dieses Protokolls, insbesondere Maria Radu und Galina Semenova. Wir danken auch Andrey Efimov von Cell Imaging Facility am Fox Chase Cancer Center. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem NIH (R01 CA148805) an JC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
