Summary
Qui, vi mostriamo come utilizzare un dosaggio di legatura di prossimità (PLA) per visualizzare MST1/MST2 eterodimerizzazione in celle fisse con alta sensibilità.
Abstract
Interazioni proteina-proteina regolamentati sono un principio guida per molti eventi di segnale, e l'individuazione di tali eventi è un elemento importante nella comprensione di come tali percorsi sono organizzati e come funzionano. Ci sono molti metodi per rilevare le interazioni proteina-proteina in cellule, ma relativamente pochi può essere utilizzati per rilevare le interazioni tra proteine endogene. Uno di questi metodi, il dosaggio di legatura di prossimità (PLA), ha diversi vantaggi per raccomandare l'uso. Rispetto ad altri comuni metodi di analisi di interazione proteina-proteina, PLA ha relativamente alta sensibilità e specificità, possa essere eseguita con la manipolazione di cellule minimal e, nel protocollo descritto nel presente documento, richiede solo due target-specifici anticorpi derivati da specie diverse (ad es., da topo e coniglio) e un reagente specializzato: un set di anticorpi secondari che sono oligonucleotidi covalentemente legati a specifiche che, quando ha portato in prossimità di un altro, creare un amplificabile piattaforma per in situ PCR o rotolamento dell'amplificazione del cerchio. In questa presentazione, mostreremo come applicare la tecnica PLA per visualizzare le modifiche in prossimità di MST1 e MST2 nelle celle fisse. La tecnica descritta in questo manoscritto è particolarmente applicabile per l'analisi di studi di segnalazione delle cellule.
Introduction
Rottura di MST1/Hippo segnalazione è stata collegata a disturbi dello sviluppo e carcinogenesi1. Nei mammiferi, attivano le chinasi MST1 e MST2 (fosforilare) MOB1 e LATS1/2, il secondo dei quali poi fosforila ed inattiva co-l'attivatore trascrizionale Yes-associated protein (YAP)2. Nella sua forma attiva (unphosphorylated), YAP ha attività oncogena, migliorando la trascrizione dei geni di proliferazione delle cellule; al contrario, quando YAP è inattivato dalla via del Hippo, è soppressa la proliferazione cellulare e apoptosi promosso3. Nei tessuti, MST1 e MST2 esiste principalmente come attivo omodimeri, ma stimoli oncogeni possono aumentare i livelli di MST1/MST2 eterodimeri, e tali eterodimeri sono inattivo4. Tuttavia, com'è regolata la MST1/MST2 eterodimerizzazione rimane capita male. Omo - ed eterodimeri sono mediati tramite interazioni tra regioni arrotolato-arrotola C-terminale di MST1 e MST2 conosciuta come SARAH domini5. Utilizzando un in situ PLA ha dimostrato in questo articolo, ci mostrano la presenza di MST1/MST2 eterodimeri in cellule di Schwann umane (HSC) e rene embrionale umano cellule (HEK-293). PLA ha un vantaggio rispetto ad altri metodi di rilevazione di interazione proteina/proteina perché permette la rilevazione delle interazioni proteina-proteina endogena, che possono essere individuati e quantificati senza la necessità di espressione del transgene o l'uso di epitopo 6.
Vie di trasduzione del segnale sono in gran parte controllate dall'associazione condizionale delle proteine di componente. Per esempio, stimolazione della maggior parte dei recettori tirosina chinasi conduce alla loro omo - o etero-dimerizzazione e la successiva associazione con altre proteine di segnalazione intracellulare, che a loro volta formare ulteriori complessi. Lo scopo del metodo PLA è visualizzare la vicinanza tra le proteine nelle cellule, purché le proteine sono meno di 30-40 nm apart. Prossimità di proteina è rilevata solitamente incubando le cellule con gli anticorpi primari appropriati generati in specie diverse (ad es., coniglio e il mouse) contro ogni proteina d'interazione, quindi aggiungendo specie-specifici anticorpi secondari, sonde di DNA pre-accoppiato a breve. Se le sonde del DNA sono nelle immediate vicinanze, un oligonucleotide specifico collegamento DNA possibile associare contemporaneamente sia di queste sonde, formando una piattaforma per l'amplificazione in situ PCR o dal meccanismo del cerchio di rotolamento. Fluorescente tag aggiunti per la reazione di amplificazione permettono la visualizzazione delle proteine interagenti, che appaiono come puntini fluorescenti che possono essere facilmente quantificate e localizzate alle regioni particolari nella cella7,8, 9 , 10.
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Protocol
1. preparazione delle soluzioni
- Preparare soluzione fissante: paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS 1X. Per 10ml, prendere 2,5 mL di 16% PFA e aggiungere 7,5 mL di PBS 1X.
Pericoli: PFA è cancerogeno a basse dosi. Fumi e contatto con la pelle sono pericolosi. Conservare a-20 ° C. - Preparare la soluzione di permeabilizzazione: 0,1% Triton X-100 in PBS 1X. Per 100 mL di soluzione, aggiungere 100 µ l di Triton X-100 in 100 mL di 1X PBS. Conservare a temperatura ambiente (TA).
- Preparare il tampone di lavaggio: 1 x TBST. Per 1 L, prendere 100 mL di 10 x TBS, 890 mL di dH2O e 10 mL di Tween 20 (10%).
- Preparare soluzione bloccante come fornito dal kit. In alternativa, utilizzare soluzione PBS 1x contenente 2% BSA.
- Preparare il diluente di anticorpo come fornito dal kit. In alternativa, utilizzare soluzione PBS 1x contenente BSA 1%.
2. placcatura delle cellule
Nota: In questo studio, abbiamo utilizzato le cellule di Schwann umane immortalizzate (integrazione socio-sanitaria) e cellule umane embrionali del rene 293 (HEK 293); Tuttavia, questo metodo può essere utilizzato per molti tipi di cellule aderenti.
- Cultura HEK 293 in DMEM supplementato con 10% FBS, 0,2% glucosio, 2 mM L-Glutammina, 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina sulle piastre di coltura del tessuto-trattati a 37 ° C 5% CO2. Mantenere l'integrazione socio-sanitaria in 10% FBS/DMEM completate con Pen/Strep e 2 µM forskolin. Celle per micoplasma ordinariamente di prova. Nessuna autenticazione di linea cellulare è stata eseguita.
- Rivestire una diapositiva 16 pozzetti camera con 50 µ l di 10 µ g/mL naturale laminina o 0,01% poli-L-lisina soluzione mouse e incubare per 30 min a 37 ° C in 5% CO2. Dividere le celle utilizzando 0,04% tripsina-EDTA.
- Piastra di integrazione socio-sanitaria e HEK-293 in 100 µ l di terreno alla confluenza del 80% (15.000-25.000 cellule/pozzetto).
- Incubare le cellule per 12-24 ore a 37 ° C in un umidificata, 5% CO2 incubator.
3. fissazione e permeabilizzazione
- Rimuovere il supporto dai pozzetti e lavare con 100 µ l di 1X PBS. Aspirare con una micropipetta per ridurre al minimo il rischio di rimozione del campione.
- Difficoltà cellule aggiungendo 50 µ l del 4% PFA ogni pozzetto ed incubare per 10 min a RT, senza agitazione. Le cellule sono sensibili al distacco, in modo da evitare le soluzioni direttamente sulle celle di pipettaggio.
- Lavare le cellule con 0.05% TBST tre volte per 5 minuti ciascuno. Aspirare con una micropipetta per ridurre al minimo il rischio di rimozione del campione.
- Trattare le cellule con soluzione di permeabilizzazione (0,1% Triton x-100 in 1X PBS) per 10 min senza agitazione a TA.
- Lavare le cellule con TBST tre volte per 5 minuti ciascuno con agitazione.
4. blocco
- Picchiettare il TBST (molto delicatamente con una micropipetta). Visualizzare la diapositiva in un microscopio per vedere se le cellule rimangono attaccate.
- Aggiungere una goccia (50-60 µ l) di soluzione di blocco: 1x a ciascun campione.
- Pre-riscaldare una camera umidostatica (Tipbox vuoto con acqua) a 37 ° C ed incubare i vetrini in esso per 1h a 37 ° C.
5. primari anticorpi
- Diluire gli anticorpi primari (1: 100) nel diluente dell'anticorpo (Vedi Tabella materiali). Preparare 40 µ l di soluzione di anticorpo per pozzetto.
- Rimuovere la soluzione bloccante dalle diapositive toccando il liquido. Non permettono che le cellule a secco.
- Vortice e aggiungere 40 µ l delle soluzioni dell'anticorpo in ciascun pozzetto.
- Incubare 1h a 37 ° C in una camera umida preriscaldata.
6. vicinanza legatura Assay sonde
Nota: Il PLA sonde vengono forniti come parte di un kit (Vedi Tabella materiali). La scelta delle sonde dipenderà la specie di anticorpi primari utilizzati per rilevare le proteine di interesse.
- Le due sonde PLA (anti-topo MINUS e PLUS anti-coniglio) di diluire 1:5 in diluente del anticorpo. Per ogni campione, preparare 40 µ l di sonda PLA. Incubare la miscela per 20 minuti a TA.
- Picchiettare la soluzione di anticorpo primario dalle diapositive. Lavare i vetrini due volte per 5 minuti ciascuno con Buffer di lavare a TA.
- Delicatamente toccare del tampone di lavaggio dalle diapositive ed aggiungere la soluzione di sonda PLA diluente a pozzetti (40 µ l/pozzetto).
- Incubare i vetrini in una camera umida preriscaldata per 1h a 37 ° C.
7. legatura
Nota: L' in situ Detection reagenti Red, ligasi e soluzione di legatura sono forniti come parte di un kit (Vedi Tabella materiali).
- Utilizzare la in situ rilevamento reagenti rosso.
- Immediatamente prima dell'uso, vortice e diluire i volumi richiesti del 5 x Stock in legatura acqua 1:5 in ad alta purezza.
Nota: Non conservare i reagenti diluiti. - Picchiettare la soluzione della sonda PLA dalle diapositive. Lavare i vetrini in 1x tampone di lavaggio due volte per 5 minuti ciascuno, a TA.
- Immediatamente prima dell'aggiunta ai campioni, vortice e aggiungere alla soluzione di legatura ligasi alle 01:40 diluizione e vortex nuovamente.
- Toccare il tampone di lavaggio dalle diapositive e aggiungere la soluzione di legatura/ligasi in ciascun pozzetto (40 µ l/pozzetto).
- Incubare i vetrini in una camera di umidità pre-riscaldato per 30 min a 37 ° C.
8. amplificazione
Nota: Lo stock di amplificazione viene fornito come parte di un kit (Vedi Tabella materiali). I reagenti sono sensibili alla luce; così evitare di esporre le diapositive alla luce.
- Vortice e diluire i volumi richiesti del 5 x magazzino amplificazione 1:5 in acqua ad elevata purezza e mescolare.
- Picchiettare la soluzione di legatura/ligasi dalle diapositive. Lavare i vetrini in 1x tampone di lavaggio due volte per 2 minuti ciascuno, a TA.
- Vortice e aggiungere nuovamente la polimerasi alla soluzione di amplificazione a una diluizione di 1: 80 e vortice.
- Picchiettare il tampone di lavaggio dalle diapositive e aggiungere la soluzione di amplificazione/polimerasi ad ogni pozzetto (40 µ l/pozzetto). Incubare i vetrini in una camera umida preriscaldata per 100 min a 37 ° C.
9. preparazione per l'Imaging
Nota: Si tratta di luce reagenti sensibili. Mantenere le diapositive al riparo dalla luce.
- Tocca Disattiva la soluzione di amplificazione-polimerasi dalle diapositive e lavare due volte per 10 min ogni in 1x tampone di lavaggio a TA.
- Rimuovere completamente la chambers e silicone intorno ai pozzi dalla diapositiva. Raschiare i bit rimanenti del silicone con un rasoio. Disegnare una griglia sulla diapositiva separando ogni bene.
- ~ 40 µ l di mezzo di montaggio con DAPI. Fare attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto il vetrino coprioggetto. I bordi dei vetrini coprioggetto possono essere sigillati con smalto.
- Attendere almeno 20 minuti prima di eseguire analisi di immagine utilizzando un microscopio confocale.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Dopo formazione immagine, conservare i vetrini a-20 ° C al buio.
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Representative Results
Abbiamo usato l'analisi PLA per testare l'interazione tra MST1 e MST2 in HEK-293 e integrazione socio-sanitaria. Le cellule erano fissi, permeabilizzate e macchiate con vari anticorpi, seguiti dall'amplificazione in situ secondo il protocollo PLA (Figura 1). Per documentare il livello di MST1/MST2 eterodimerizzazione, le cellule sono state macchiate con gli anticorpi MST1 e MST2 (Figura 1A, 1C e 1 G). Come controllo positivo, abbiamo anche usato ERK e pERK anticorpi che dovrebbero essere nelle immediate vicinanze in cellule con attivato ERK (Figura 1B e 1F). Le cellule che mancano MST1 e MST2 non visualizza nessun segnale PLA (Figura 1). Allo stesso modo, le cellule colorate con uno solo dei due anticorpi non mostrano alcun segnale PLA (Figura 1). Questi risultati indicano che le cellule HEK-293 e integrazione socio-sanitaria le cellule contengono MST1/MST2 eterodimeri, coerente con i risultati precedenti dal nostro laboratorio4. Come un ulteriore controllo negativo abbiamo incubato le cellule con gli anticorpi primari ERK e MST2 per mostrare la specificità dei segnali (Figura 1 e 1 H).
Per confermare i livelli di espressione di MST1 e MST2, estratti da WT e cellule HEK-293 di MST1/MST2 knockout, rispettivamente, sono state analizzate da immunoblot con gli anticorpi indicati (Figura 1I).
Figura 1 : Dati rappresentante PLA. (A-H) Le cellule erano fissi e macchiate con gli anticorpi indicati seguiti dalla procedura di PLA. Blu: DAPI, rosso: segnale PLA. Microfotografie sono stati ottenuti con un microscopio confocale Leica SP5. (I) Immunoblot per MST1 e MST2. Barra della scala è 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo trovato utile utilizzare vetrini camera per questo esperimento, come è molto conveniente eseguire l'esperimento con diverse linee di cellule (14-16) e non c'è nessuna necessità di cambiare il campione ogni volta durante l'analisi in microscopia. Alcune complicazioni possono sorgere, ad esempio un aumentato rischio di contaminazione incrociata con gli anticorpi. Pertanto, consigliamo di lavare ogni pozzetto singolarmente anziché utilizzare una vaschetta di Coplin, nonostante l'aumento della durata dell'esperimento. Inoltre, la rimozione dell'inserto in silicone è un affare delicato e deve essere fatto con cura e pazienza. Anche con tecnica meticolosa, a volte è possibile vedere piccole quantità di detriti del silicone dopo la rimozione dell'inserto. Per questo motivo, uno deve rimuovere l'inserto in silicone scrupolosamente, usando una lametta, se necessario, come troppo unremoved in silicone può alterare la distanza confocale durante la microscopia. Può anche essere utile disegnare le linee come bordi di pozzi dopo la rimozione dell'inserto di silicio per aiutare a trovare le cellule sotto il microscopio.
È imperativo utilizzare non-cross reattivi anticorpi primari che ciascuno riconosce un solo membro dell'eterodimero (ad es., il MST1 anticorpi dovrebbero non anche riconoscere MST2 e viceversa). Inoltre, è importante ricordarsi di utilizzare diversi suggerimenti per evitare la contaminazione incrociata di anticorpi primari e PLA sonde, per evitare di toccare il fondo del pozzo ed evitare di pipettaggio direttamente sopra i campioni. Abbiamo trovato che per integrazione socio-sanitaria, è preferibile cappotto camera diapositive con soluzione 0,01% di poli-L-lisina, e per HEK-293 è meglio cappotto con laminina 10 µ g/mL del mouse.
Come con qualsiasi procedura, ci sono alcune limitazioni di questo metodo. Il dosaggio di PLA, mentre un metodo potente per tutti i motivi elencati sopra, è limitato dalla specificità e la sensibilità degli anticorpi. Inoltre, le concentrazioni nell'anticorpo e condizioni di coltura cellulare dovrebbero finemente sintonizzate prima di esperimenti di laboratorio sono impostati per ridurre i costi dei saggi. A questo proposito, un'alternativa per ridurre il costo delle analisi è utilizzare piatto fondo di vetro 35mm non rivestito invece di diapositive di camera.
Un vantaggio del test è che l'intensità e il numero di punti fluorescente può essere quantificata utilizzando vari programmi software per computer come il software di Blob-finder, il Duolink Image Tool e th Olink Bioscience.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo l'intero laboratorio Chernoff per contribuire alla ottimizzazione e convalida del presente protocollo, in particolare Maria Radu e Galina Semenova. Ringraziamo anche Andrey Efimov della struttura cellulare Imaging presso il Fox Chase Cancer Center. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal NIH (R01 CA148805) a JC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
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