Summary
Aquí, mostramos cómo hacer un análisis de proximidad de la ligadura (PLA) visualizar heterodimerization MST1/MST2 en células fijas con alta sensibilidad.
Abstract
Las interacciones proteína-proteína regulada están un principio rector de muchos eventos de señalización, y la detección de este tipo de eventos es un elemento importante en la comprensión de cómo estas vías están organizadas y cómo funcionan. Hay muchos métodos para detectar las interacciones proteína-proteína en las células, pero relativamente pocos pueden utilizarse para detectar interacciones entre proteínas endógenas. Un tal método, el análisis de ligadura de proximidad (PLA), tiene varias ventajas para recomendar su uso. En comparación con otros métodos comunes de análisis de interacción de proteínas, PLA tiene relativamente alta sensibilidad y especificidad, se puede realizar con la manipulación mínima de la célula y en el protocolo descrito en este documento, requiere sólo dos específico del destino anticuerpos derivan de diferentes especies (por ejemplo., de ratón y conejo) y un reactivo especializado: un conjunto de anticuerpos secundarios que son oligonucleótidos covalentemente ligados a determinado que, cuando muy cerca uno del otro, crear un plataforma amplificable en situ PCR o amplificación de círculo rodante. En esta presentación mostramos cómo aplicar la técnica PLA para visualizar cambios en proximidad MST1 y MST2 en células fijas. La técnica descrita en este manuscrito es particularmente aplicable para el análisis de estudios de señalización de la célula.
Introduction
Interrupción de señalización MST1/Hippo ha estado ligada a trastornos del desarrollo y carcinogénesis1. En mamíferos, se activan las quinasas MST1 y MST2 (fosforilan) MOB1 y LATS1/2, el último de los cuales luego fosforila y hace inactivo el coactivador transcripcional de la proteína asociada a Yes (YAP)2. En su forma activa (unphosphorylated), YAP tiene actividad oncogénica, mejorar la transcripción de genes de proliferación celular; por el contrario, cuando YAP es inactivado por la vía de Hippo, se suprime la proliferación celular y apoptosis promovido3. En los tejidos, MST1 y MST2 existen principalmente como homodímeros activo, pero estímulos oncogénicos pueden aumentar los niveles de heterodímeros MST1/MST2 y son de estos heterodímeros inactivos4. Sin embargo, cómo está regulada la MST1/MST2 heterodimerization sigue siendo mal entendida. Homo - y heterodímeros están mediada a través de interacciones entre regiones de en espiral-arrolle c-terminal de MST1 y MST2, conocida como SARAH dominios5. Usando una en situ PLA demostrado en este artículo, nos muestran la presencia de heterodímeros MST1/MST2 en las células de las células de Schwann humana (HSC) y riñón embrionario humano (HEK-293). PLA tiene una ventaja sobre otros métodos de detección de interacción proteína/proteína, ya que permite la detección de interacciones proteína-proteína endógena, que puede ser identificado y cuantificado sin la necesidad de expresión del transgen o el uso de etiquetas del epítopo 6.
Vías de transducción de señalización son controladas en gran parte por la Asociación condicional de proteínas componentes. Por ejemplo, la estimulación de la mayoría del receptor tirosina quinasas conduce a su homo o hetero-dimerización y posterior asociación con proteínas de señalización intracelulares adicionales, que a su vez formar más complejos. El propósito del método PLA es visualizar la proximidad entre las proteínas en las células, siempre que las proteínas son menos de 30-40 nm aparte. Proximidad de proteína generalmente se detecta por primera incubar las células con anticuerpos primarios apropiados en diferentes especies (por ej., conejo y ratón) contra cada interacción proteína, luego agregar anticuerpos secundarios propios de cada especie, sondas de ADN previamente acoplado a corto. Si las sondas de ADN están en proximidad cercana, un oligonucleótido de ADN enlace específico al mismo tiempo puede enlazar tanto de estas sondas, formando una plataforma para la amplificación en situ PCR o mecanismo del círculo del balanceo. Etiquetas fluorescentes agregados a la reacción de amplificación permiten la visualización de las proteínas obran recíprocamente, que aparecen como puntos fluorescentes que pueden ser fácilmente cuantificados y localizadas en determinadas regiones en la celda7,8, 9 , 10.
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Protocol
1. preparación de soluciones
- Preparar solución de fijación: 4% paraformaldehido (PFA) en PBS 1 x. Para 10 mL, tomar 2.5 mL de 16% PFA y agregar 7,5 mL de PBS 1 x.
Peligros: PFA es carcinogénico a dosis bajas. Los vapores y el contacto con la piel son peligrosos. Almacenar a-20 ° C. - Preparar solución de permeabilización: 0,1% Tritón X-100 en PBS 1 x. Para 100 mL de solución, añada 100 μl de Tritón X-100 en 100 mL de 1 x PBS. Almacenar a temperatura ambiente (RT).
- Preparar el tampón de lavado: 1 x TBST. Para 1 L, tomar 100 mL de 10 x TBS y 890 mL de dH2O 10 mL de Tween 20 (10%).
- Preparar solución de bloqueo suministrado por kit. Alternativamente, use 1 x PBS solución 2% BSA.
- Prepare el diluyente de anticuerpos como suministrados por kit. Alternativamente, use 1 x solución de PBS con 1% de BSA.
2. galjanoplastia de células
Nota: En este estudio, se utilizaron células de Schwann humanas inmortalizadas (iHSC) y humano embrionario riñón 293 células (HEK 293); sin embargo, este método puede utilizarse para muchos tipos de células adherentes.
- Cultura HEK 293 en DMEM suplementado con 10% FBS, 0,2% glucosa, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 μg/mL en placas de cultivo de tejidos tratados a 37 ° C en 5% CO2. Mantener iHSC en 10% FBS/DMEM suplementado con pluma/Strep y 2 μm forskoline. Rutinariamente la prueba las células de mycoplasma. Se realizó sin autenticación de línea celular.
- Capa una diapositiva 16-pozo cámara con 50 μl de 10 μg/mL ratón natural laminina o 0.01% poly-L-lisina solución e incubar durante 30 min a 37 ° C en 5% CO2. Dividir celdas utilizando 0.04% tripsina-EDTA.
- IHSC placa y HEK-293 en 100 μl de medio en confluencia del 80% (15.000-25.000 células/pocillo).
- Incube las células para 12-24 horas a 37 ° C en vapor, 5% CO2 incubadora.
3. fijación y permeabilización
- Retire el medio de los pocillos y lavar con 100 μl de 1 x PBS. Aspiración con una micropipeta para minimizar el riesgo de la eliminación de la muestra.
- Fijar las células añadiendo 50 μl de 4% PFA por bien e incubar 10 min a temperatura ambiente, sin agitación. Las células son sensibles a la separación, así que evitar pipetear las soluciones directamente sobre las células.
- Lavar las células con 0.05% TBST tres veces por 5 minutos cada uno. Aspiración con una micropipeta para minimizar el riesgo de la eliminación de la muestra.
- Tratar las células con solución de permeabilización (0,1% Tritón x-100 en 1 x PBS) durante 10 minutos sin agitación a TA.
- Lavar las células con TBST tres veces por 5 minutos con agitación.
4. bloqueo
- Tap off TBST (muy suavemente con una micropipeta). Visualizar el portaobjetos en un microscopio para ver si las células permanecen adjuntas.
- Añadir una gota (50-60 μL) de solución de bloqueo 1 x a cada muestra.
- Precalentar una cámara de humedad (caja de punta vacía con agua) a 37 ° C e incubar los portaobjetos en él durante 1 h a 37 ° C.
5. primarios anticuerpos
- Diluir los anticuerpos primarios (1: 100) en el diluyente de anticuerpos (véase Tabla de materiales). Preparar solución de anticuerpo de 40 μl por pocillo.
- Quitar bloqueo solución de las diapositivas golpeando el líquido. No permita que las células se sequen.
- Vórtice y agregar 40 μl de las soluciones de anticuerpos a cada pocillo.
- Incubar 1 h a 37 ° C en una cámara de humedad precalentado.
6. proximidad ligadura ensayo sondas
Nota: Las sondas PLA son proporcionadas como parte de un kit (véase Tabla de materiales). La elección de las puntas de prueba dependerá de la especie de los anticuerpos primarios utilizados para detectar las proteínas de interés.
- Diluir las dos sondas PLA (menos el ratón y anti-conejo PLUS) 1:5 en el diluyente de anticuerpos. Para cada muestra, preparar 40 μl de sonda PLA. Incubar la mezcla por 20 min a TA.
- Puntee fuera de la solución de anticuerpo primario de las diapositivas. Lavar los portaobjetos dos veces por 5 minutos con Buffer de lavado a TA.
- Suavemente golpee el tampón de lavado de los portaobjetos y añadir la solución de sonda PLA diluyente en los pocillos (40 μL/pocillo).
- Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad precalentado durante 1 hora a 37 ° C.
7. ligadura
Nota: La en situ detección reactivos rojo, ligasa, ligadura de solución y se proporcionan como parte de un kit (véase Tabla de materiales).
- Utilice el en situ detección reactivos rojo.
- Inmediatamente antes de utilizar, vortex y diluir los volúmenes requeridos de 5 x stock de ligadura 1:5 en alta pureza del agua.
Nota: No almacene reactivos diluidos. - Puntee fuera de la solución de sonda PLA de las diapositivas. Lave el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado dos veces por 5 min a TA.
- Inmediatamente antes de la adición a las muestras, vortex y ligasa a la solución de la ligadura en el 1:40 dilución y agitar nuevamente.
- Tap off el tampón de lavado de los portaobjetos y añadir la solución de Ligase de la ligadura a cada pozo (40 μL/pocillo).
- Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad previamente calentado durante 30 min a 37 ° C.
8. la amplificación
Nota: Los valores de amplificación se proporcionan como parte de un kit (véase Tabla de materiales). Los reactivos son sensibles a la luz; por lo tanto Evite exponer las diapositivas a la luz.
- Vórtice y diluir los volúmenes requeridos de los 5 x stock de amplificación 1:5 en agua de alta pureza y mezcla.
- Puntee fuera de la solución de Ligase de la ligadura de las diapositivas. Lave el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado dos veces por 2 min a TA.
- Vórtice y agregar la polimerasa a la solución de amplificación en dilución de 1: 80 y agitar de nuevo.
- Toque de tampón de lavado de los portaobjetos y añadir la solución de amplificación de la polimerasa a cada pozo (40 μL/pocillo). Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad previamente calentadas para 100 min a 37 ° C.
9. preparación para la proyección de imagen
Nota: Estos son reactivos sensibles luz. Guardar las diapositivas de la luz.
- Toque de la solución de amplificación-polimerasa de las diapositivas y lavar dos veces por 10 min cada 1 en x Wash Buffer a TA.
- Retire las cámaras y la silicona alrededor de los pozos de la diapositiva completamente. Raspe los bits restantes de silicona con una maquinilla de afeitar. Dibujar una cuadrícula en la diapositiva de separación cada uno bien.
- Añadir ~ 40 μl del medio de montaje con DAPI. Tenga cuidado de evitar atrapar burbujas de aire bajo el cubreobjetos. Los bordes de la hoja de cubierta pueden sellarse con esmalte de uñas.
- Espere por lo menos 20 minutos antes de realizar el análisis de imágenes mediante un microscopio confocal.
Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí. - Después de la proyección de imagen, guardar las diapositivas a-20 ° C en la oscuridad.
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Representative Results
Se utilizó el ensayo PLA para probar la interacción entre MST1 y MST2 en HEK-293 y iHSC. Las células eran fijos, permeabilized y teñidas con anticuerpos diferentes, seguidos de amplificación en situ según el protocolo PLA (figura 1). Para documentar el nivel de heterodimerization MST1/MST2, las células fueron teñidas con anticuerpos MST1 y MST2 (figura 1A, 1C y 1 G). Como control positivo, también utilizamos ERK y anticuerpos pERK que espera que estén en proximidad cercana en células con activación ERK (figura 1B y 1F). Las células que carecen de MST1 y MST2 no mostrar ninguna señal PLA (figura 1). Células teñidas con sólo uno de los dos anticuerpos además no mostrar ninguna señal PLA (figura 1). Estos resultados sugieren que las células HEK-293 y iHSC células contienen MST1/MST2 heterodímeros, consistente con resultados previos de nuestro laboratorio4. Como control negativo adicional incuban las células con anticuerpos primarios ERK y MST2 Mostrar especificidad de señales (figura 1 y la 1 H).
Para confirmar los niveles de expresión MST1 y MST2, extractos de WT y las células de HEK 293 de nocaut MST1/MST2, respectivamente, se analizaron por el immunoblot con los anticuerpos indicados (figura 1I).
Figura 1 : Datos del representante de PLA. (A-H) Las células eran fijo y tinción con los anticuerpos indicados seguidos por el procedimiento PLA. Azul: DAPI, rojo: señal PLA. Las fotomicrografías fueron obtenidas con un microscopio confocal Leica SP5. (I) Immunoblot MST1 y MST2. Barra de escala es 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nos pareció útil portaobjetos de la cámara para este experimento, ya que es muy conveniente realizar el experimento con varias líneas de celulares (14-16) y no hay necesidad de cambiar la muestra cada vez que durante el análisis de microscopía. Pueden surgir algunas complicaciones, tales como un mayor riesgo de contaminación cruzada con los anticuerpos. Por lo tanto, sugerimos lavar cada pozo individual en lugar de utilizar un frasco de Coplin, a pesar de la mayor duración del experimento. Además, la remoción del inserto de silicona es un asunto delicado y debe hacerse con cuidado y paciencia. Incluso con técnica meticulosa, a veces es posible ver pequeñas cantidades de restos de silicona después de la eliminación el inserto. Por esta razón, uno debe quitar el relleno de silicona escrupulosamente, usando un razorblade si es necesario, como demasiada silicona tisulares puede alterar la distancia confocal en microscopia. También puede ser útil dibujar las líneas como fronteras de pozos después de retirar el inserto de silicona para ayudar a encontrar las células bajo el microscopio.
Es imperativo utilizar anticuerpos primarios reactivos no Cruz que cada uno reconoce sólo un miembro del heterodímero (p. ej., la MST1 anticuerpos si no también reconocen MST2 y viceversa). También, es importante recordar utilizar diferentes consejos para evitar la contaminación cruzada de los anticuerpos primarios y PLA sondas, para evitar tocar el fondo del pozo y evitar pipetear directamente sobre las muestras. Encontramos que para iHSC, es mejor capa compartimiento portaobjetos con solución de poli-l-lisina 0,01%, y para HEK-293 es mejor cubrir con mouse laminin de 10 μg/mL.
Como con cualquier procedimiento, existen algunas limitaciones de este método. El ensayo PLA, mientras que un método eficaz para todas las razones mencionadas anteriormente, está limitado por la especificidad y la sensibilidad de los anticuerpos. Además, las concentraciones de anticuerpo y las condiciones de cultivo celular deben finalmente ajustarse antes de experimentos de laboratorio se establecen para reducir los costos de los ensayos. En ese sentido, una alternativa para reducir el costo de las pruebas es utilizar plato de fondo de cristal de 35 mm sin recubrir en lugar de diapositivas de la cámara.
Una ventaja del ensayo es que intensidad y número de puntos fluorescentes puede cuantificarse mediante diversos programas de software de computadora como el software finder Blob, herramienta de imagen Duolink y th Olink Bioscience.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos al laboratorio de Chernoff todo para contribuir a la optimización y validación de este protocolo, en particular María Radu y Galina Semenova. También agradecemos a Andrey Efimov de la instalación de la proyección de imagen de celular en el Fox Chase Cancer Center. Este trabajo fue financiado por una subvención del NIH (R01 CA148805) a JC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
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- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
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