Summary
在这里, 我们展示了如何使用接近结扎法 (PLA) 在高灵敏度的固定细胞中可视化 MST1/MST2 heterodimerization。
Abstract
调控蛋白质-蛋白质相互作用是许多信号事件的指导原则, 而检测此类事件是了解这些途径是如何组织和如何运作的重要因素。在细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法很多, 但相对较少的人可以用来检测内源蛋白之间的相互作用。一个这样的方法, 近距离结扎法 (PLA), 有几个优点, 建议使用它。与其他常用的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法相比, PLA 具有较高的灵敏度和特异性, 可以用最小的细胞操作进行, 并且, 在本文所述的协议中, 只需要两个目标特定的来自不同物种 (例如, 从老鼠和兔子) 和一个专门试剂的抗体: 一组与特定的寡核苷酸共价连接的二次抗体, 当彼此靠近时, 产生一个扩增原位PCR 或滚动圆扩增的平台。在本演示中, 我们展示了如何应用 PLA 技术来可视化固定细胞中 MST1 和 MST2 接近的变化。本手稿中描述的技术特别适用于细胞信号研究的分析。
Introduction
MST1/Hippo 信号的中断已连接到发育紊乱和癌变1。在哺乳动物中, 激酶 MST1 和 MST2 激活 (磷酸化) MOB1 和 LATS1/2, 后者随后 phosphorylates 和失活转录共同激活剂 Yes 相关蛋白 (叶)2。在其活性 (unphosphorylated) 形式中, 叶叶具有致癌活性, 增强细胞增殖基因的转录;反之, 当叶叶被河马通路灭活时, 细胞增殖被抑制, 凋亡提升3。在组织中, MST1 和 MST2 主要作为活性 homodimers 存在, 但致癌刺激可以增加 MST1/MST2 异的水平, 这种异是不活动的4。然而, MST1/MST2 heterodimerization 的监管方式仍然不甚了解。通过MST1 和 MST2 (称为萨拉域5) 之间的相互作用, 可以介导异和均质。本文用原位PLA 演示了 MST1/MST2 异在人雪旺细胞 (HSC) 和人胚肾细胞 (HEK-293) 中的存在。PLA 优于其他蛋白质/蛋白质相互作用检测方法, 因为它允许检测内源蛋白-蛋白质相互作用, 可以识别和量化, 无需转基因表达或使用表位标记6。
信号传导通路主要由成分蛋白的条件关联控制。例如, 大多数受体酪氨酸激酶的刺激导致他们的二聚和随后与其他细胞内信号蛋白的关联, 它们本身形成进一步的复合物。PLA 方法的目的是可视化细胞中蛋白质之间的接近, 只要蛋白质小于 30-40 nm。蛋白质接近通常是通过在不同的物种 (例如, 兔子和老鼠) 中培养出适当的原代抗体, 然后添加特定于物种的二次抗体, 来检测细胞,预耦合到短 DNA 探针。如果 dna 探针接近, 一个特定的链接 dna 寡核苷酸可以同时绑定这些探针, 形成一个平台, 通过原位PCR 或滚动循环机制进行放大。添加到扩增反应中的荧光标记允许可视化的相互作用的蛋白质, 它显示为荧光点, 可以很容易地量化和本地化到单元格7,8中的特定区域,9,10。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 解决方案的准备
- 准备固定液: 1x PBS 中的4% 多聚甲醛 (PFA)。对于10毫升, 采取2.5 毫升 16% PFA 和添加7.5 毫升 1x PBS。
危害:PFA 在低剂量下致癌。烟雾和皮肤接触是危险的。存储在-20 摄氏度。 - 准备透化解决方案: 1x PBS 中的0.1% 海卫 X-100。对于100毫升的溶液, 添加100µL 的海卫 X-100 到100毫升 1x PBS。在室温下贮存 (RT)。
- 准备洗涤缓冲液: 1x TBST。对于 1 L, 采取100毫升 10x tb, 890 毫升 dH2O 和10毫升吐温 20 (10%)。
- 准备由套件提供的阻止解决方案。或者, 使用包含 2% BSA 的 1x PBS 解决方案。
- 准备试剂盒提供的抗体稀释剂。或者, 使用包含 1% BSA 的 1x PBS 解决方案。
2. 细胞电镀
注意:本研究采用永生化人雪旺细胞 (iHSC) 和人胚肾293细胞 (HEK 293);然而, 这种方法可以用于许多类型的贴壁细胞。
- 培养 HEK 293 在 DMEM 补充 10% FBS, 0.2% 葡萄糖, 2 毫米 l-谷氨酰胺, 100 U/毫升青霉素 G 和100µg/毫升链霉素在组织培养处理板在37摄氏度 5% CO2。保持 iHSC 在10% 的 FBS/DMEM 补充与笔/链球菌和2µM 毛佛司。定期检测支原体的细胞。未执行单元格行身份验证。
- 大衣一个16井室幻灯片与50µL 10 µg/毫升天然小鼠层粘连蛋白或0.01% 多 l-赖氨酸溶液和孵育30分钟在37摄氏度 5% CO2。使用0.04% 胰蛋白酶-EDTA 分离细胞。
- 板 iHSC 和 HEK-293 在100µL 中80% 汇流 (1500万个细胞/井)。
- 在37摄氏度的加湿、5% CO2孵化器中孵育 12-24 小时的细胞。
3. 固定和透化
- 从井中取出培养基, 用100µL 1x PBS 洗涤。用微量吸管吸液, 以最小化样品去除的风险。
- 固定细胞通过增加50µL 4% PFA 每井和孵育10分钟在 RT, 没有搅动。细胞对分离敏感, 因此避免将溶液直接移到细胞上。
- 洗涤细胞 0.05% TBST 三次每5分钟。用微量吸管吸液, 以最小化样品去除的风险。
- 用透化溶液 (1x PBS 中的0.1% 海卫 x-100) 治疗细胞, 10 分钟, 不搅动 RT。
- 用 TBST 洗涤细胞三次, 每5分钟搅拌一次。
4. 阻止
- 点按 TBST (非常轻柔地用微量吸管)。可视化显微镜中的幻灯片, 以查看单元格是否保持连接。
- 将1x 阻塞解决方案的一滴 (50-60 µL) 添加到每个样本中。
- 在37摄氏度前加热湿度室 (带水的空尖盒), 在37摄氏度下孵育1小时的滑块。
5. 原发性抗体
- 稀释抗体稀释剂中的原抗体 (1:100) (见材料表)。每井准备40µL 抗体溶液。
- 通过轻击液体, 从幻灯片中移除阻止解决方案。不要让细胞干燥。
- 漩涡, 并添加40µL 的抗体解决方案, 每井。
- 在预热的湿度室中孵育1小时, 37 摄氏度。
6. 近距离结扎法探针
注: PLA 探针作为试剂盒的一部分提供 (参见材料表)。探针的选择将取决于用于检测感兴趣蛋白质的主要抗体的种类。
- 稀释两个 PLA 探针 (抗鼠减和抗兔加) 1:5 在抗体稀释剂。对于每个样品, 准备40µL 的 PLA 探针。在 RT 孵育混合物20分钟。
- 从幻灯片中轻触主抗体解决方案。每两次用洗涤缓冲液洗涤5分钟的幻灯片。
- 轻轻点按滑块上的洗涤缓冲液, 然后将稀释剂 PLA 探针溶液添加到井中 (40 µL/井)。
- 在预加热湿度室中孵育1小时, 在37摄氏度时的幻灯片。
7. 结扎
注:原位检测试剂红色、连接酶和结扎溶液作为试剂盒的一部分提供 (见材料表)。
- 使用原位检测试剂红色。
- 使用前, 在高纯度水中, 涡旋和稀释5x 结扎料1:5 的所需体积。
注意: 不要储存稀释的试剂。 - 从幻灯片中轻按 PLA 探针解决方案。将1x 洗涤缓冲液中的滑块洗涤两次, 每小时5分钟。
- 在添加样品前, 先将涡流添加到连接溶液中, 再在1:40 稀释和涡旋。
- 点按滑块上的洗涤缓冲液, 并将连接/连接酶溶液添加到每个井 (40 µL/井)。
- 在预加热湿度室内孵育幻灯片30分钟, 在37摄氏度。
8. 放大
注: 放大库存作为套件的一部分提供 (见材料表)。试剂是光敏的;因此, 避免将幻灯片暴露在光线下。
- 在高纯度水和混合液中, 涡旋和稀释5x 放大库存的所需体积1:5。
- 从幻灯片中轻触连接/连接酶解决方案。将1x 洗涤缓冲液中的滑块洗涤两次, 每小时2分钟。
- 在1:80 稀释和涡旋时将聚合酶添加到放大溶液中。
- 从幻灯片中点按 "冲洗缓冲液", 并将扩增/聚合酶溶液添加到每个井 (40 µL/井)。在预加热湿度室内孵育幻灯片100分钟, 在37摄氏度。
9. 成像准备
注意:这些是光敏试剂。使幻灯片免受光线的保护。
- 从幻灯片中轻按放大-聚合酶溶液, 在 RT 1x 洗涤缓冲液中每两次洗涤10分钟。
- 完全从幻灯片中取出孔和硅胶周围的井。用剃刀刮掉剩下的硅胶钻头。在幻灯片上绘制一个分隔每个井的网格。
- 增加 ~ 40 µL 的安装介质与 DAPI。注意避免在盖子滑下捕捉气泡。盖滑的边缘可以用指甲油密封。
- 请等待至少20分钟, 然后使用共聚焦显微镜执行图像分析。
注意:可以在此处暂停该协议。 - 成像后, 将幻灯片存储在-20 摄氏度的黑暗中。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们使用 PLA 测定法测试 HEK-293 和 iHSC 中 MST1 与 MST2 的相互作用。细胞固定, 透化, 染色与各种抗体, 其次是原位扩增根据 PLA 协议 (图 1)。为了记录 MST1/MST2 heterodimerization 的水平, 细胞被 MST1 和 MST2 抗体染色 (图 1A、1C 和 1G)。作为一个积极的控制, 我们也使用 erk 和振作抗体, 预期是在细胞与激活的 ERK (图 1B和1F) 密切接近。缺乏 MST1 和 MST2 的细胞不显示 PLA 信号 (图 1C)。只有两种抗体中的一个被染色的细胞同样不显示 PLA 信号 (图 1G)。这些结果表明, HEK-293 细胞和 iHSC 细胞包含 MST1/MST2 异, 与我们实验室4以前的研究结果一致。作为一个额外的负控制, 我们孵育细胞与 ERK 和 MST2 的主要抗体, 以显示信号的特异性 (图 1D和 1H)。
为了确认 MST1 和 MST2 表达的水平, 分别对 WT 和 MST1/MST2 敲除 HEK-293 细胞提取物进行了免疫印迹与指示抗体的分析 (图 1I)。
图 1:代表 PLA 数据。(H)细胞被固定和染色的指示的抗体后, 解放军程序。蓝色: DAPI, 红色: 解放军信号。显微照片是用徕卡 SP5 共聚焦显微镜获得的。(I) 免疫印迹 MST1 和 MST2。比例尺为10µm.请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们发现在这个实验中使用玻璃腔玻片是很有用的, 因为它非常方便地进行了几个 (14-16) 细胞系的实验, 并且在显微分析过程中无需每次更换样品。可能会出现一些并发症, 如抗体交叉污染的风险增加。因此, 我们建议单独洗涤, 而不是使用 Coplin 罐, 尽管实验持续时间延长。此外, 去除硅胶插入物是一件微妙的事情, 必须小心和耐心地做。即使采用细致的技术, 在移除刀片后, 有时也可以看到少量的硅胶碎屑。因此, 必须严格去除硅胶刀片, 如有必要, 使用剃刀, 因为太多的取下硅胶可以改变显微镜中的共焦距离。它也可以是有用的绘制线作为孔的边界后移除硅插入, 以帮助查找在显微镜下的细胞。
必须使用非交叉反应性原发性抗体, 每一个都认识到单体的一个成员 (例如, MST1 抗体也不应该识别 MST2,反之亦然)。此外, 重要的是要记住使用不同的提示, 以避免交叉污染的原抗体和 PLA 探针, 以避免触及井底和避免直接移出样品。我们发现, 对于 iHSC, 最好是用0.01% 多 l-赖氨酸溶液来涂布室幻灯片, 对于 HEK-293, 最好是用小鼠10µg/毫升层粘连蛋白涂布。
与任何过程一样, 此方法有一些局限性。PLA 检测虽然是上述所有原因的有力方法, 但其特异性和敏感性受抗体的限制。此外, 在建立实验室实验以降低检测成本之前, 应微调抗体浓度和细胞培养条件。在这方面, 减少化验费用的另一种替代方法是使用未涂布的35毫米玻璃底碟, 而不是腔体玻片。
该检测的优点是, 可以使用各种计算机软件程序 (如 Blob 查找器软件、Duolink 图像工具和 th Olink 生物科学) 量化荧光点的强度和数量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢整个切尔诺夫实验室为本议定书的优化和验证作出贡献, 特别是玛丽亚 Radu 和加林娜 Semenova。我们还感谢安德烈 Efimov 在福克斯大通癌症中心的细胞成像设施。这项工作得到了 NIH (R01 CA148805) 授予 JC 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
