Summary
İşte, bir yakınlık ligasyonu tahlil (PLA) ile yüksek hassasiyet MST1/MST2 heterodimerization sabit hücrelerdeki görselleştirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.
Abstract
Düzenlenmiş protein-protein etkileşimleri çok sayıda sinyal olayı için temel bir ilke vardır ve bu tür olayların tespiti böyle yolları nasıl düzenlendiğini ve şekilleriyle anlamada önemli bir unsurdur. Protein-protein etkileşimleri hücrelerde algılamak için pek çok yöntem vardır, ancak nispeten az endojen proteinler arasındaki etkileşimler algılamak için kullanılabilir. Böyle bir yöntem, yakınlık ligasyonu tahlil (PLA), kullanımı tavsiye bir çok avantajı vardır. Protein-protein etkileşimi analiz ortak diğer yöntemlerine göre PLA nispeten yüksek duyarlılık ve özgüllük vardır, çok az hücre düzenleme ile burada açıklanan protokol yapılabilir, sadece iki hedef özgü gerektirir antikorlar farklı türlerden elde edilen (e.g., fare ve tavşan) ve bir özel reaktif: bir dizi belirli kovalent bağlı oligonucleotides olan ikincil antikorlar, birbirine yakın getirdiğimde, oluşturmak bir situ PCR veya çalışırken daire amplifikasyon amplifiable platformu. Bu sunum, biz MST1 ve MST2 yakınlık sabit hücrelerdeki değişiklikler görselleştirmek için PLA tekniği uygulamak gösterilmiştir. Bu el yazması açıklanan tekniği, özellikle hücre çalışmaları sinyal analizi için geçerlidir.
Introduction
MST1/Hippo sinyal kesintileri gelişimsel bozuklukları ve karsinojenezis1bağlı olmuştur. Memelilerde, MST1 ve MST2 kinaz etkinleştirin (fazdan) MOB1 ve LATS1/2, ikincisi olan daha sonra phosphorylates ve transkripsiyon ortak harekete geçirmek Evet ilişkili protein (YAP)2inaktive. Etkin (unphosphorylated) haliyle YAP oncogenic etkinlik, hücre proliferasyonu genlerin transkripsiyon artırılması vardır; Bunun tersi olarak, YAP Hippo yolu tarafından inaktive, hücre çoğalması bastırılır ve Apoptozis3terfi. Dokularda, esas olarak active homodimers, MST1 ve MST2 var ama oncogenic uyaranlara MST1/MST2 heterodimers düzeyleri artırabilir ve böyle heterodimers etkin olmayan4vardır. Ancak, MST1/MST2 heterodimerization nasıl düzenlenir kötü anlaşılır kalır. Homo - hem heterodimers aracılı ile C-terminal dolandı-coil MST1 bölgelerinde ve SARAH etki alanları5olarak bilinen MST2 arasındaki etkileşimler vardır. Bir in situ kullanarak PLA Bu makalede, biz insan Schwann hücreleri (HSC) ve insan embriyonik böbrek hücrelerinde (HEK-293) MST1/MST2 heterodimers varlığını göstermek gösterdi. Tespit ve transgene ifade ihtiyacı veya epitope Etiketler kullanımı sayısal endojen protein-protein etkileşimleri algılanmasını sağlar çünkü PLA diğer protein/protein etkileşim algılama yöntemleri üzerinde bir avantaj vardır 6.
Sinyal iletim yollarının büyük ölçüde bileşen proteinler koşullu Derneği tarafından kontrol edilir. Örneğin, çoğu reseptör Tirozin kinaz uyarılması kendi homo veya heteroseksüel dimerization ve ek hücre içi sinyal proteinleri, kendilerini izleyen ilişkilendirmesiyle formu daha fazla kompleksleri yol açar. Proteinler daha az 30-40 nm parçalara olması koşuluyla PLA yöntemin amacı hücrelerdeki proteinler arasında yakınlık görselleştirmek etmektir. Protein yakınlık genellikle ilk hücre içinde farklı tür kaldırdı uygun birincil antikorlar ile kuluçka tarafından tespit (Örn., tavşan ve fare) karşı etkileşen her protein, sonra species-specific ikincil antikorlar, ekleme önceden birleştiğinde kısa DNA sondalar. DNA probları yakın iseniz, belirli bir bağlantı DNA oligonükleotid aynı anda hem in situ PCR veya daire mekanizması haddeleme tarafından amplifikasyon için bir platform oluşturan Bu sondalar bağlayabilirsiniz. Floresan Etiketler amplifikasyon tepki eklendi görselleştirme kolayca sayılabilir ve hücre7,8, belirli bölgelere lokalize floresan noktalar olarak görünür etkileşen proteinlerin izin 9 , 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması çözümleri
- Sabitleştirici çözüm hazırlamak: %4 paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS. 10 mL için 2.5 mL % 16 almak PFA ve 7,5 mL 1 x PBS ekleyin.
Tehlikeler: İngiltere'de yılın düşük dozlarda kanserojen. Duman ve Ciltle temas tehlikeli. -20 ° C'de mağaza - Permeabilization çözüm hazırlamak: %0,1 1 x PBS Triton X-100. 100 mL için çözeltisi, Triton X-100 100 µL 100 mL 1 x PBS ekleyin. (RT) Oda sıcaklığında saklayın.
- Yıkama arabellek hazırlayın: 1 x TBST. 1 L için 10 x TBS 100 mL, dH2O 890 mL ve 10 mL Tween 20 (% 10) alın.
- Engelleme çözüm paketi tarafından sağlanan gibi hazırlayın. Alternatif olarak, % 2 BSA içeren 1 x PBS çözüm kullanın.
- Antikor seyreltici kit tarafından sağlanan gibi hazırlayın. Alternatif olarak, % 1 BSA içeren 1 x PBS çözüm kullanın.
2. kaplama hücre
Not: Bu çalışmada, kullandığımız ölümsüzleştirdi insan Schwann hücreleri (iHSC) ve insan embriyonik böbrek 293 hücreleri (HEK 293); Ancak, bu yöntem yapışık hücreleri birçok türü için kullanılabilir.
- Kültür HEK 293 yılında % 10 ile desteklenmiş DMEM FBS, %0.2 glikoz, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin doku kültürü tedavi plakaları 37 ° c % 5 CO2. İHSC kalem/Strep ve 2 µM forskolin FBS/DMEM takıma % 10 sürdürmek. Rutin test hücreleri Mikoplazma için. Hiçbir hücre satır kimlik doğrulaması gerçekleştirildi.
- 16-iyi odası slayt 10 µg/mL doğal fare laminin veya % 0,01 poli-L-lizin çözüm 50 µL ile ceket ve % 5 CO237 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. %0,04 tripsin-EDTA kullanarak hücreleri bölün.
- Plaka iHSC ve HEK-293 yılında 100 µL % 80 izdiham (15.000-25.000 hücreler/de), orta.
- Kuluçkaya hücreler için 12-24 saat içinde oksijen, 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka makinesi.
3. fiksasyon ve Permeabilization
- Orta kuyulardan kaldırmak ve 1 x PBS 100 µL ile yıkayın. Örnek çıkarma riskini en aza indirmek için micropipette ile Aspire edin.
- Hücreleri 4 PFA ücret iyi ve ajitasyon olmadan, RT, 10 min için kuluçkaya % 50 µL ekleyerek düzeltmek. Hücreleri dekolmanı duyarlıdır, yani doğrudan hücreleri üzerine çözümleri pipetting önlemek.
- % 0.05 hücrelerle yıkama 5 min için üç kez TBST. Örnek çıkarma riskini en aza indirmek için micropipette ile Aspire edin.
- Ajitasyon, RT. olmadan 10 dk permeabilization çözüm (% 0,1 Triton x-100 1 x PBS içinde) hücrelerle tedavi
- TBST hücrelerle ajitasyon ile her 5 min için üç kez yıkayın.
4. engelleme
- TBST (micropipette) ile çok nazikçe kapalı dokunun. Hücreleri bağlı kalır eğer görmek için mikroskop slayt görselleştirin.
- Bir damla (50-60 µL) 1 x engelleme çözüm her örnek için ekleyin.
- 37 ° c nem odası (su ile boş ipucu kutusunu) ön ısı ve bu slaytları 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
5. birincil antikorlar
- Birincil antikor (1: 100) antikor Dilüent seyreltik ( Tablo malzemelerigörmek). İyi başına 40 µL antikor çözüm hazırlamak.
- Engelleme çözüm sıvı kapalı dokunarak slaytlardan kaldırmak. Hücreleri kuru izin vermez.
- Girdap ve her şey için antikor çözümleri 40 µL ekleyin.
- Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.
6. yakınlık ligasyonu tahlil probları
Not: PLA probları bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme). Seçtiğiniz probları bir birincil antikorlar faiz proteinlerin algılamak için kullanılan türler üzerinde bağlıdır.
- İki PLA problar (Anti-fare eksi ve anti-tavşan artı) seyreltik 1: 5'te antikor seyreltici. Her örnek için 40 µL PLA inceleyebilirsek hazırlayın. Karışım RT., 20 dk için kuluçkaya
- Slaytları birincil antikor çözümden kapatmak dokunun. 5 min her arabellek yıkama ile iki kez slaytlarını RT. yıkama
- Yavaşça slaytlardan yıkama tamponunun dokunun ve seyreltici PLA sonda çözüm wells (40 µL/de) ekleyin.
- Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 1 h için slaytları kuluçkaya
7. tüp ligasyonu
Not: in situ algılama reaktifler kırmızı, ligaz ve ligasyonu çözüm bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme).
- Situ algılama reaktifler kırmızı kullanın.
- Hemen önce kullanmak, girdap ve 5 x 1:5 içinde yüksek saflıkta su tüp ligasyonu stok gerekli miktarda oranında seyreltin.
Not: seyreltilmiş reaktifler depolamayın. - Slaytları PLA sonda çözümden uzak dokunun. 1 x 5 dk her RT. az için iki kez yıkama arabellek slaytları yıkayın
- Hemen önce ek örnekleri, girdap ve ligaz ligasyonu 1:40 ekleyin seyreltme ve tekrar girdap.
- Slaytları yıkama arabelleğinden kapalı dokunun ve her şey (40 µL/de) tüp ligasyonu/ligaz çözüm ekleyin.
- Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 30 dk için slaytları kuluçkaya
8. güçlendirme
Not: Amplifikasyon hisse senedi bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme). Reaktifler ışığa duyarlı vardır; Böylece ışık slaytlara kullanılmasını önlemek.
- Girdap ve 5 x amplifikasyon hisse senedi 1:5 yüksek saflıkta su gerekli miktarda sulandırmak ve karıştırın.
- Slaytları ligasyonu/ligaz çözümden uzak dokunun. 1 x 2 dk her RT. az için iki kez yıkama arabellek slaytları yıkayın
- Girdap ve polimeraz 1:80 seyreltme ve girdap güçlendirme çözüm yeniden ekleyin.
- Yıkama tampon slaytlardan dokunun ve her şey (40 µL/de) güçlendirme/polimeraz çözüm ekleyin. Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 100 min için slaytları kuluçkaya
9. görüntüleme için hazırlık
Not: Bu ışık duyarlı reaktifler vardır. Işıktan korunan slaytlar tutun.
- Slaytları amplifikasyon-polimeraz çözümden uzak dokunun ve iki kez 10 dk içinde her 1 x yıkama arabellek RT., yıkama
- Odalar ve silikon wells etrafında slayttan tamamen kaldırın. Silikon kalan parçaları bir ustura ile kazı. Her ayıran slayt üzerinde bir tablo çizmek de.
- ~ 40 µL DAPI ile montaj ortamının ekleyin. Kapak notu altında hava kabarcıkları yakalama önlemek dikkatli olun. Kapak notu kenarlarını oje ile kapalı gibi.
- Confocal bir mikroskop kullanarak görüntü analizi yapmadan önce en az 20 dakika bekleyin.
Not: Protokol burada duraklatılmış. - Görüntüleme sonra karanlıkta slaytlar-20 ° C'de depolayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PLA tahlil HEK-293 ve iHSC MST1 ve MST2 arasındaki etkileşimi sınamak için kullanılır. Hücreleri sabit, permeabilized ve in situ amplifikasyon PLA Protokolü (Şekil 1) göre ardından çeşitli antikorlar ile lekeli. MST1/MST2 heterodimerization düzeyini belgelemek için hücreleri MST1 ve MST2 antikorlar ile (Şekil 1A, 1 C ve 1 G) lekeli. Pozitif kontrol olarak biz de ERK kullanılır ve hücrelerle birbirine yakın olması bekleniyor dikmek antikorlar ERK (Şekil 1B ve 1F) harekete geçirmek. MST1 ve MST2 eksik olan hücreleri PLA sinyal (Şekil 1 c) gösterir. İki antikorlar ile tek lekeli hücreleri aynı şekilde PLA sinyal (Şekil 1G) gösterir. Bu sonuçlar HEK-293 hücreleri ve iHSC hücreleri MST1/MST2 heterodimers, bizim laboratuvar4önceki bulgular ile tutarlı içeren öneririz. Ek bir negatif kontrol sinyalleri (Şekil 1 d ve 1 H) özgüllük göstermek için ERK ve MST2 birincil antikorları içeren hücreleri inkübe.
MST1 ve MST2 ifadesi düzeyi onaylamak için WT ayıklar ve MST1/MST2 nakavt HEK-293 hücreleri, sırasıyla, belirtilen antikorlar (Şekil 1I) ile immunoblot tarafından analiz.
Resim 1 : Temsilcisi PLA veri. (A-H) Hücreleri sabit ve PLA yordam tarafından takip belirtilen antikorlar ile lekeli. Mavi: DAPI, kırmızı: PLA sinyal. Photomicrographs Leica SP5 confocal mikroskop ile elde edilmiştir. (I) Immunoblot MST1 ve MST2 için. Ölçek çubuğu var. 10 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cam odası slaytlar gibi çok çeşitli (14-16) hücre hatları ile deneme gerçekleştirmek uygundur ve örnek mikroskobu analizi sırasında her zaman değiştirmek için gerek yoktur bu deneme için kullanmak yararlı bulduk. Bir antikor ile çapraz bulaşma riski gibi bazı komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Bu nedenle, biz her şey yıkama öneririz deneme artan süre rağmen bir Coplin kavanoz kullanmak yerine tek tek. Buna ek olarak, silikon Ekle kaldırılması hassas bir meseledir ve özen ve sabır ile yapılmalıdır. Bile titiz tekniği ile bazen az miktarda silikon enkaz kaldırıldıktan sonra Insert görmek mümkündür. Bu nedenle, bir silikon Ekle titizlikle, razorblade gerekirse, çok fazla unremoved silikon confocal mesafe mikroskobu sırasında değiştirebilirsiniz kullanarak kaldırmanız gerekir. Mikroskop altında hücreler bulmanıza yardımcı olmak için silikon Ekle kaldırdıktan sonra kuyu kenarlık olarak çizgiler çizmek kullanılabilir.
Çapraz reaktif birincil antikorlar her heterodimerdir tek bir üyesi tanımak kullanmak zorunludur (Örneğin, MST1 antikorlar de tanımak değil MST2 ve tersi). Ayrıca, çapraz bulaşma birincil antikorlar ve PLA probları, kuyunun dokunmaktan kaçının ve doğrudan örnekleri üzerinde pipetting önlemek için önlemek için farklı ipuçları kullanmak hatırlamak önemlidir. İHSC için için kat odası Slaytlar % 0,01 poli-L-lizin çözüm ile daha iyi ve HEK-293 için fare 10 µg/mL laminin paltoyla için iyidir bulduk.
Her işlemde olduğu gibi bu yöntemin bazı sınırlamalar vardır. Tüm nedenlerle güçlü bir yöntem yukarıda iken PLA tahlil antikorlar duyarlılık ve özgüllük tarafından sınırlıdır. Laboratuvar deneyleri deneyleri maliyetleri azaltmak için ayarlanan Ayrıca, antikor konsantrasyonları ve hücre kültür koşulları ince ayarlanmaları. Bu bağlamda, deneyleri maliyetini azaltmak için bir alternatif kaplamasız 35-mm cam alt yemek odası slaytlar yerine kullanmaktır.
Bu yoğunluk tahlil bir avantajdır ve floresan nokta sayısını sayısal Blob-finder yazılım, Duolink görüntü aracı ve inci gibi çeşitli bilgisayar yazılım programları kullanarak Olink Bioscience.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
En iyi duruma getirme ve bu protokol, belirli Maria Radu ve Galina Semenova, doğrulanması için katkıda bulunmak için tüm Chernoff laboratuvar teşekkür ediyoruz. Andrey Efimov hücre Imaging tesisin Fox Chase Kanser Merkezi ayrıca teşekkür ederiz. Bu eser NIH (R01 CA148805) bir hibe için Dizayn Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
