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Biochemistry

प्रोटीन Isoforms के Heterodimerization का पता लगाने में एक का उपयोग कर सीटू निकटता बंधाव परख

Published: October 20, 2018 doi: 10.3791/57755
Automatic Translation
1, 1
1Fox Chase Cancer Center

Summary

यहां, हम बताते है कि कैसे एक निकटता बंधाव परख (पीएलए) का उपयोग करने के लिए उच्च संवेदनशीलता के साथ तय की कोशिकाओं में MST1/MST2 heterodimerization कल्पना ।

Abstract

विनियमित प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत कई संकेतन घटनाओं के लिए एक मार्गदर्शक सिद्धांत हैं, और इस तरह की घटनाओं का पता लगाने कैसे इस तरह के रास्ते का आयोजन कर रहे हैं और कैसे वे समारोह को समझने में एक महत्वपूर्ण तत्व है. वहाँ कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन अपेक्षाकृत कुछ अंतर्जात प्रोटीन के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ऐसी ही एक विधि, निकटता बंधाव परख (पीएलए), इसके उपयोग की सिफारिश करने के लिए कई फायदे हैं । प्रोटीन के अंय आम तरीकों के मुकाबले प्रोटीन संपर्क विश्लेषण, पीएलए अपेक्षाकृत उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है, ंयूनतम सेल हेरफेर के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, और, प्रोटोकॉल में वर्णित यहां, केवल दो लक्ष्य विशेष की आवश्यकता है विभिंन प्रजातियों से व्युत्पंन एंटीबॉडी (जैसे, माउस और खरगोश से) और एक विशेष एजेंट: माध्यमिक एंटीबॉडी कि covalently विशिष्ट oligonucleotides है कि, जब एक दूसरे के करीब निकटता में लाया से जुड़े रहे है का एक सेट, बनाएं सीटू पीसीआर या रोलिंग सर्कल प्रवर्धन में के लिए प्रवर्धित मंच । इस प्रस्तुति में, हम MST1 और MST2 निकटता में तय कोशिकाओं में बदलाव की कल्पना करने के लिए पीएलए तकनीक लागू करने के लिए कैसे दिखाते हैं । इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक सेल सिग्नलिंग अध्ययन के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से लागू है ।

Introduction

MST1/हिप्पो संकेतन के विघटन विकासात्मक विकारों और कैंसरजनन1से जुड़ा हुआ है । स्तनधारी में, kinases MST1 और MST2 सक्रिय (phosphorylate) MOB1 और LATS1/2, के बाद जो फिर phosphorylates और निष्क्रिय transcriptional सह उत्प्रेरक हां-जुड़े प्रोटीन (याप)2। अपने सक्रिय (unphosphorylated) रूप में, याप oncogenic गतिविधि है, कोशिका प्रसार जीन की प्रतिलेखन बढ़ाने; इसके विपरीत, जब याप हिप्पो मार्ग द्वारा निष्क्रिय है, सेल प्रसार दबा दिया और apoptosis3पदोंनत किया है । ऊतकों में, MST1 और MST2 सक्रिय homodimers के रूप में मुख्य रूप से मौजूद हैं, लेकिन oncogenic उत्तेजनाओं MST1 के स्तर में वृद्धि कर सकते हैं/MST2 heterodimers, और इस तरह के heterodimers निष्क्रिय कर रहे हैं4. हालांकि, कैसे MST1/MST2 heterodimerization विनियमित है खराब समझ में आता है । दोनों होमो-और heterodimers सी के बीच बातचीत के माध्यम से मध्यस्थता कर रहे हैं-टर्मिनल कुंडलित MST1 और MST2 सारा डोमेन5के रूप में जाना के क्षेत्रों का तार । एक सीटू पीएलए में इस लेख में प्रदर्शन का प्रयोग, हम MST1/MST2 heterodimers की उपस्थिति मानव Schwann कोशिकाओं (HSC) और मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (HEK-२९३) में दिखाते हैं । पीएलए अन्य प्रोटीन पर एक फायदा है/प्रोटीन इंटरेक्शन डिटेक्शन तरीके क्योंकि यह अंतर्जात प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने की अनुमति देता है, जो transgene अभिव्यक्ति की आवश्यकता के बिना quantified और epitope टैग के उपयोग की पहचान की जा सकती है 6.

संकेत transduction रास्ते काफी हद तक घटक प्रोटीन की सशर्त संघ द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, सबसे रिसेप्टर tyrosine kinases की उत्तेजना अपने होमो-या hetero-dimerization और अतिरिक्त intracellular संकेतन प्रोटीन, जो खुद आगे परिसरों के फार्म के साथ बाद में सहयोग करने के लिए सुराग । पीएलए विधि के उद्देश्य से कोशिकाओं में प्रोटीन के बीच निकटता की कल्पना है, बशर्ते कि प्रोटीन से कम 30-40 एनएम के अलावा कर रहे हैं । प्रोटीन निकटता आमतौर पर उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को अलग प्रजातियों में उठाया द्वारा पता लगाया है (जैसे, खरगोश और माउस) प्रत्येक बातचीत प्रोटीन के खिलाफ है, तो प्रजातियों-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने, पूर्व में लघु डीएनए जांच को मिलकर. यदि डीएनए जांच बंद निकटता में हैं, एक विशिष्ट जोड़ने डीएनए oligonucleotide एक साथ इन जांच के दोनों बांध कर सकते हैं, प्रवर्धन के लिए एक मंच बनाने के द्वारा सीटू पीसीआर में या वृत्त तंत्र रोलिंग द्वारा । फ्लोरोसेंट टैग प्रवर्धन प्रतिक्रिया को जोड़ा गया बातचीत प्रोटीन के दृश्य की अनुमति है, जो फ्लोरोसेंट डॉट्स कि आसानी से quantified जा सकता है और सेल में विशेष क्षेत्रों के लिए स्थानीयकृत के रूप में प्रकट7,8, 9 , 10.

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Protocol

1. समाधान की तैयारी

  1. 1x पंजाब में 4% paraformaldehyde (पीएफए): निर्धारण समाधान तैयार करें । 10 मिलीलीटर के लिए, 16% पीएफए के २.५ मिलीलीटर ले और 1x पंजाब के ७.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
    खतरों: पीएफए कम मात्रा में यलो होता है । धुएं और त्वचा के संपर्क खतरनाक हैं । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  2. permeabilization समाधान तैयार करें: ०.१% ट्राइटन X-१०० 1x पंजाब में । समाधान के १०० मिलीलीटर के लिए, ट्राइटन X-१०० के १०० µ एल जोड़ें 1x पंजाबियों के १०० मिलीलीटर में । कमरे के तापमान पर स्टोर (आरटी) ।
  3. धो बफर तैयार: 1x TBST । 1 एल के लिए, १०० मिलीलीटर की 10x टीबीएस, डीएच2ओ के ८९० मिलीलीटर, और 20 के बीच 10 मिलीलीटर (10%) ।
  4. किट द्वारा आपूर्ति के रूप में समाधान अवरुद्ध तैयार । वैकल्पिक रूप से, 2% BSA युक्त 1x पंजाब समाधान का उपयोग करें ।
  5. किट द्वारा आपूर्ति के रूप में एंटीबॉडी मंदक तैयार करें । वैकल्पिक रूप से, 1% BSA युक्त 1x पंजाबन समाधान का उपयोग करें ।

2. कोशिकाओं की चढ़ाना

नोट: इस अध्ययन में, हम अमरता मानव Schwann कोशिकाओं (iHSC) और मानव भ्रूण गुर्दे २९३ कोशिकाओं का इस्तेमाल किया (HEK २९३); हालांकि, इस विधि अनुयाई कक्षों के कई प्रकार के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

  1. संस्कृति HEK २९३ में DMEM पूरक 10% FBS, ०.२% ग्लूकोज, 2 मिमी एल-Glutamine, १०० U/एमएल पेनिसिलिन जी और १०० µ g/एमएल streptomycin पर ऊतक संस्कृति-इलाज प्लेटों पर 5% CO2में ३७ ° c । पेन/Strep और 2 µ m forskolin के साथ 10% FBS/DMEM सप्लीमेंट में iHSC बनाए रखें । माइकोप्लाज्मा के लिए नियमित रूप से परीक्षण कोशिकाओं । कोई कक्ष पंक्ति प्रमाणन नहीं किया गया था ।
  2. कोट एक 16-५० µ एल के 10 µ जी के साथ अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड/एमएल प्राकृतिक माउस laminin या ०.०१% पाली-L-lysine समाधान और 5% CO2में ३७ ° c में 30 मिनट के लिए मशीन । ०.०४% trypsin-EDTA का उपयोग करके कक्ष विभाजित करें ।
  3. प्लेट iHSC और HEK-२९३ में १०० µ एल मीडियम के ८०% संगम पर (15000-25000 कोशिकाएं/
  4. एक humidified, 5% CO2 मशीन में ३७ ° c में 12 -24 घंटे के लिए कोशिकाओं को मशीन ।

3. निर्धारण और Permeabilization

  1. मध् यम को कुएं से निकालें और 1x पंजाबियों के १०० µ l से धोएं । एक micropipette के साथ महाप्राण नमूना निकालने के जोखिम को कम करने के लिए ।
  2. 4% पीएफए के प्रति अच्छी तरह से और आर टी पर 10 मिनट के लिए आंदोलन के बिना, के लिए ५० µ एल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक । कोशिकाएं टुकड़ी के प्रति संवेदनशील होती हैं, इसलिए समाधानों को सीधे कक्षों पर pipetting से बचें ।
  3. 5 मिनट प्रत्येक के लिए ०.०५% TBST तीन बार के साथ कोशिकाओं को धो लें । एक micropipette के साथ महाप्राण नमूना निकालने के जोखिम को कम करने के लिए ।
  4. RT में आंदोलन के बिना 10 मिनट के लिए permeabilization समाधान (1x पंजाब में ०.१% ट्राइटन x-१००) के साथ कोशिकाओं का इलाज ।
  5. एक आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार TBST के साथ कोशिकाओं को धो लें ।

4. ब्लॉकिंग

  1. TBST (बहुत धीरे से एक micropipette के साथ) को टैप करें । एक खुर्दबीन में स्लाइड कल्पना को देखने के लिए अगर कोशिकाओं संलग्न रहते हैं ।
  2. एक बूंद (50-60 µ एल) 1x के प्रत्येक नमूने के लिए समाधान अवरुद्ध जोड़ें ।
  3. पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रता चैंबर (पानी के साथ खाली टिप बॉक्स) गर्मी और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इसे में स्लाइड की मशीन ।

5. प्राथमिक एंटीबॉडी

  1. एंटीबॉडी मंदक में प्राथमिक एंटीबॉडी (1:100) पतला ( सामग्री की तालिकादेखें) । प्रति कुआं ४० µ l एंटीबॉडी समाधान तैयार करें ।
  2. बंद तरल दोहन से स्लाइड से अवरुद्ध समाधान निकालें । कक्षों को सूखने की अनुमति न दें ।
  3. भंवर और एक अच्छी तरह से एंटीबॉडी समाधान के ४० µ एल जोड़ें ।
  4. एक गरम आर्द्रता चैंबर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच मशीन ।

6. निकटता बंधाव परख जांच

नोट: पीएलए जांच एक किट के भाग के रूप में प्रदान की जाती है ( सामग्री की तालिकादेखें) । जांच के विकल्प के लिए ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों पर निर्भर करेगा ।

  1. एंटीबॉडी मंदक में दो पीएलए जांच (विरोधी माउस शूंय और विरोधी खरगोश प्लस) 1:5 पतला । प्रत्येक नमूने के लिए, पीएलए जांच के ४० µ एल तैयार करें । आर टी पर 20 मिनट के लिए मिश्रण की मशीन ।
  2. स्लाइड से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को टैप करें । आर टी पर धो बफर के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार स्लाइड धो लो ।
  3. धीरे स्लाइड से धोने बफर का दोहन और कुओं के लिए मंदक पीएलए जांच समाधान जोड़ें (४० µ l/
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक पूर्व गरम आर्द्रता कक्ष में स्लाइड की मशीन ।

7. बंधाव

नोट: में सीटू पता लगाना एजेंट लाल, Ligase, और बंधाव समाधान एक किट ( सामग्री की तालिकादेखें) के भाग के रूप में प्रदान किए जाते हैं ।

  1. में सीटू डिटेक्शन रिएजेंट लाल का उपयोग करें ।
  2. तुरंत उपयोग, भंवर से पहले और उच्च शुद्धता पानी में 5x बंधाव स्टॉक 1:5 की आवश्यक मात्रा को पतला ।
    नोट: पतला एजेंट की दुकान नहीं है ।
  3. स्लाइड से पीएलए जांच समाधान पर टैप करें । 5 मिनट आरटी पर प्रत्येक के लिए दो बार 1x धोने बफर में स्लाइड धो लो ।
  4. तुरंत नमूने, भंवर के अलावा पहले और 1:40 कमजोर पड़ने और भंवर पर बंधाव समाधान के लिए Ligase फिर से जोड़ें ।
  5. स्लाइड से वॉश बफ़र को टैप करें और बंधाव/Ligase समाधान प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें (४० µ l/
  6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक पूर्व गर्म आर्द्रता चैंबर में स्लाइड की मशीन ।

8. प्रवर्धन

नोट: प्रवर्धन स्टॉक एक किट के भाग के रूप में प्रदान की जाती है ( सामग्री की तालिकादेखें) । रिएजेंट हल्के संवेदनशील होते हैं; इस प्रकार प्रकाश करने के लिए स्लाइड उजागर से बचें ।

  1. भंवर और उच्च शुद्धता पानी और मिश्रण में 5x प्रवर्धन स्टॉक 1:5 की आवश्यक मात्रा को पतला ।
  2. स्लाइड से बंधाव/Ligase समाधान को टैप करें । 2 मिनट आरटी पर प्रत्येक के लिए दो बार 1x धोने बफर में स्लाइड धो लो ।
  3. भंवर और 1:80 कमजोर पड़ने और भंवर में प्रवर्धन समाधान के लिए पोलीमरेज़ फिर से जोड़ें ।
  4. स्लाइड से धो बफर बंद नल और प्रवर्धन/पोलीमरेज़ समाधान के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें (४० µ l/ ३७ डिग्री सेल्सियस पर १०० मिनट के लिए एक पूर्व गरम आर्द्रता कक्ष में स्लाइड की मशीन ।

9. इमेजिंग के लिए तैयारी

नोट: ये हल्के संवेदनशील रिएजेंट हैं । स्लाइड को प्रकाश से सुरक्षित रखें ।

  1. स्लाइड से प्रवर्धन-पोलीमरेज़ समाधान को टैप करें और 10 मिनट के लिए RT पर 1x वॉश बफ़र में प्रत्येक को दो बार धोएं ।
  2. स्लाइड से कुओं के आसपास चैंबर्स और सिलिकॉन को पूरी तरह से हटा दें । एक उस्तरा के साथ सिलिकॉन के शेष बिट्स परिमार्जन । स्लाइड पर एक ग्रिड ड्रा एक अच्छी तरह से अलग ।
  3. DAPI के साथ बढ़ते माध्यम के ~ ४० µ एल जोड़ें । कवर स्लिप के नीचे हवा के बुलबुले फँसाने से बचने के लिए सावधान रहें । कवर स्लिप के किनारों को नेल पॉलिश से सील किया जा सकता है ।
  4. छवि विश्लेषण प्रदर्शन एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए रुको ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है ।
  5. इमेजिंग के बाद, स्लाइड-20 ° c अंधेरे में संग्रहीत करें ।

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Representative Results

हम पीएलए परख इस्तेमाल के लिए MST1 और HEK में MST2-२९३ और iHSC के बीच बातचीत का परीक्षण । कोशिकाओं तय किया गया, permeabilized, और विभिन्न एंटीबॉडी के साथ दाग, पीएलए प्रोटोकॉल के अनुसार सीटू प्रवर्धन में द्वारा पीछा (चित्रा 1). MST1/MST2 heterodimerization के स्तर के दस्तावेज़ के लिए, कोशिकाओं MST1 और MST2 एंटीबॉडी (आंकड़ा 1a, 1C, और 1G) के साथ दाग रहे थे । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हम भी सक्रिय ERK (चित्रा 1b और 1F) के साथ कोशिकाओं में करीब निकटता में होने की उम्मीद कर रहे हैं कि ERK और पर्क एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया. कोशिकाओं की कमी MST1 और MST2 कोई पीएलए संकेत (चित्रा 1C) दिखाओ । दो एंटीबॉडी के ही एक साथ सना हुआ कोशिकाओं को इसी तरह कोई पीएलए संकेत (चित्रा 1G) दिखाओ । इन परिणामों का सुझाव है कि HEK-२९३ कोशिकाओं और iHSC कोशिकाओं MST1/MST2 heterodimers, हमारी प्रयोगशाला से पिछले निष्कर्षों के अनुरूप4। एक अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में हम ERK और MST2 प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की मशीन संकेतों की विशिष्टता दिखाने के लिए (1 डी औरएक घंटा) ।

MST1 और MST2 अभिव्यक्ति के स्तर की पुष्टि करने के लिए, WT और MST1/MST2 नॉकआउट HEK-२९३ कोशिकाओं से अर्क, क्रमशः, संकेत एंटीबॉडी (चित्रा immunoblot) के साथ 1I द्वारा विश्लेषण किया गया ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्रतिनिधि पीएलए डेटा। (A-H) कोशिकाओं को ठीक किया गया और संकेत दिया एंटीबॉडी पीएलए प्रक्रिया के बाद के साथ दाग । ब्लू: DAPI, रेड: पीएलए सिग्नल । Photomicrographs एक Leica SP5 फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया । (I) MST1 और MST2 के लिए Immunoblot । स्केल बार 10 µm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

हम इस प्रयोग के लिए ग्लास चैंबर स्लाइड का उपयोग करने के लिए उपयोगी पाया, के रूप में यह बहुत (14-16) सेल लाइनों के साथ प्रयोग करने के लिए सुविधाजनक है और कोई नमूना माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के दौरान हर बार बदलने की जरूरत है । कुछ जटिलताओं पैदा हो सकता है, जैसे एंटीबॉडी के साथ पार संक्रमण के लिए एक बढ़ा जोखिम के रूप में. इसलिए, हम हर अच्छी तरह से व्यक्तिगत रूप से धोने के बजाय एक Coplin जार का उपयोग करने का सुझाव है, प्रयोग की वृद्धि की अवधि के बावजूद । इसके अलावा, सिलिकॉन डालने के हटाने के एक नाजुक मामला है और देखभाल और धैर्य के साथ किया जाना चाहिए । यहां तक कि सावधानीपूर्वक तकनीक के साथ, इसे हटाने डालने के बाद सिलिकॉन मलबे की छोटी मात्रा को देखने के लिए कभी-कभार संभव है । इस कारण से, एक सिलिकॉन डालने के लिए एक razorblade का उपयोग कर, यदि आवश्यक हो तो, एक के रूप में बहुत अधिक निकाल दिया सिलिकॉन माइक्रोस्कोपी के दौरान फोकल दूरी को बदल सकते है हटाने चाहिए । यह भी सिलिकॉन डालने के लिए मदद माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं को खोजने के बाद कुओं की सीमाओं के रूप में लाइनों को आकर्षित करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।

यह गैर-पार प्रतिक्रियाशील प्राथमिक एंटीबॉडी है कि प्रत्येक heterodimer (जैसे, MST1 एंटीबॉडी भी MST2 और उपाध्यक्ष के विपरीतपहचान नहीं होनी चाहिए की केवल एक ही सदस्य को पहचान का उपयोग करने के लिए आवश्यक है) । इसके अलावा, यह करने के लिए विभिंन युक्तियों का उपयोग याद रखना महत्वपूर्ण है पार से बचने के प्राथमिक एंटीबॉडी और पीएलए जांच के संदूषण, के लिए अच्छी तरह से नीचे छूने से बचने के लिए और नमूनों पर सीधे pipetting से बचने के लिए । हमने पाया है कि iHSC के लिए, यह ०.०१% पाली के साथ कोट चैंबर स्लाइड करने के लिए बेहतर है-L-lysine समाधान, और HEK-२९३ के लिए यह माउस के साथ कोट करने के लिए बेहतर है 10 µ g/एमएल laminin ।

किसी भी प्रक्रिया के साथ के रूप में, वहां इस पद्धति की कुछ सीमाएं हैं । पीएलए परख, जबकि ऊपर सूचीबद्ध सभी कारणों के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, विशिष्टता और एंटीबॉडी की संवेदनशीलता द्वारा सीमित है । इसके अलावा, एंटीबॉडी सांद्रता और कोशिका संस्कृति की स्थिति को बारीकी से देखते हुए प्रयोगशाला प्रयोगों की स्थापना के लिए परख की लागत को कम कर रहे है चाहिए । उस संबंध में, एक विकल्प के लिए परख की लागत को कम करने के लिए कक्ष स्लाइड के बजाय कोट ३५-mm ग्लास नीचे पकवान का उपयोग है ।

परख का एक लाभ यह है कि तीव्रता और फ्लोरोसेंट डॉट्स की संख्या ऐसी बूँद खोजक सॉफ्टवेयर, Duolink छवि उपकरण, और गु Olink के रूप में विभिंन कंप्यूटर सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर quantified जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम अनुकूलन और इस प्रोटोकॉल के सत्यापन में योगदान के लिए पूरी Chernoff प्रयोगशाला धंयवाद, विशेष रूप से मारिया रडू और Galina Semenova में । हम भी फॉक्स चेस कैंसर सेंटर में सेल इमेजिंग सुविधा के एंड्री Efimov धंयवाद । इस कार्य को NIH (R01 CA148805) से जे. पी. ए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chamber slides Thermo Fisher Scientific 178599 16 well, glass slide
PLA probe Anti-Mouse Minus Sigma-Aldrich DUO92004 Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent
PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent
Wash Buffers, Flurescence Sigma-Aldrich DUO82049 Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B
Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040
Detection Reagents Red Sigma-Aldrich DUO92008 Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody Cell Signaling 9102s
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) Cell Signaling 5726s pERK antibody
MST2 antibody Cell Signaling 3952s
Krs-2 (RJ-5) Santa Cruz sc-100449 MST1 antibody
16% Paraformaldehyde Electron microscopy sciences 15710 Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution
Triton x100 Fisher BioReagents BP 151-500 To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution
Confocal microscopy Leica TCS SP8, 63x Image analysis with ImageJ software

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References

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Karchugina, S., Chernoff, J.… More

Karchugina, S., Chernoff, J. Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (140), e57755, doi:10.3791/57755 (2018).

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